1,25（OH）2维生素D3对人树突状细胞成熟及其介导免疫耐受的影响

本研究旨在探讨1,25(OH)2维生素D3〔1,25(OH)2Vit D3〕对人树突状细胞(DC)分化、成熟及功能的影响及其机制。在体外将人外周血单个核细胞诱导分化成DC,实验组加入1,25(OH)2Vit D31 nmol/L培养9 d,对照组加入等量无水乙醇,流式细胞仪检测DC表面共刺激因子表达水平。混合淋巴细胞培养后,用MTT法评估DC刺激同种异体T细胞增殖的能力。Western blot检测DC吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)蛋白表达。结果表明,与对照组相比,实验组DC表面标志CD80、CD83、CD86表达率低于对照组(P<0.05),CD1a高于对照组(P<0.05);CD80、CD83、CD86、CD1a表达率分别为(40.43±9.83)%、(20.04±4.73)%、(14.45±5.38)%,(58.48±10.72)%;对照组CD80、CD83、CD86、CD1a表达率分别为(29.36±13.34)%、(35.91±10.19)%、(27.15±11.64)、(72.20±12.79)%。实验组DC刺激同种异体T细胞增殖的能力受到抑制;DC表达IDO蛋白上调。结论:1,25(OH)2Vit D3抑制DC的成熟,通过上调DC的IDO蛋白表达抑制DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖及介导免疫耐受。     

脐血树突状细胞介导的食管癌疫苗抗肿瘤实验研究

目的:用杂交瘤技术制备脐血树突状细胞(DC)和食管癌细胞的融合疫苗,观察其在体内外抗肿瘤的作用。方法:分离脐血CD34 干细胞并诱导扩增为成熟DC,并与EC109细胞经聚乙二醇法融合;免疫磁珠法筛选EC109-DC;MTT法测定瘤苗诱导淋巴细胞增殖能力及体外特异性免疫应答能力;重建SCID小鼠免疫功能;体内抗肿瘤免疫治疗实验。结果:(1)融合疫苗可体外生长,且同时高表达叶酸受体和CD80。(2)疫苗能有效刺激淋巴细胞增殖反应,体外诱导细胞毒T细胞(CTL)对EC109的杀伤活性显著高于对照组(P<0.05)。(3)在免疫治疗中,用融合瘤苗治疗的荷瘤小鼠,肿瘤大小和重量明显小于对照组(P<0.05)。结论:(1)EC109-DC能在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导特异性CTL杀伤作用;(2)融合瘤苗治疗荷瘤小鼠有一定的效应。     

用携有存活蛋白基因的重组腺病毒载体转染树突状细胞诱导细胞毒T细胞抗淋巴瘤免疫效应

本研究探讨转染survivin（SVV）基因的树突状细胞（DC）体外诱导特异性抗淋巴瘤的免疫效应。对人外周血DC进行诱导培养,以Ad-SVV转染DC,用Westernblot鉴定Survivin的表达,用乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应,用混合淋巴细胞反应（MLR）测定DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,以ELISA法检测上清中的细胞因子IL-12含量。结果表明：在MLR中,刺激应答比（S/R）为1∶5、1∶10、1∶50和1∶100时,转染Ad-SVV的DC有较强刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;转染Ad-SVV的DC组所诱发的CTL活性明显高于对照DC组;转染病毒后第2天,转染Ad-SVV的DC组的IL-12分泌水平高于对照DC组。结论：含存活蛋白基因的DC能够在体外诱导特异性CTL效应,对CA46细胞有明显的杀伤作用。     

不同来源的树突状细胞体外扩增比较研究

【目的】对脐血和外周血树突状细胞(DC)体外扩增进行比较,探索更好的DC来源。【方法】取正常人脐血及外周血,以Ficoll分离提取白细胞,去除悬浮细胞后,分别加入含有GM-CSF、TNF-α及GM-CSF、IL-4的完全培养基中培养,于4、8、10 d进行表型(CD1α、CD83、CD80、HLA-DR)分析及形态观察,1周左右分别检测同种异体混合淋巴细胞反应培养,比较诱导细胞增殖的能力。【结果】脐血诱导的DC细胞数明显大于外周血来源的DC细胞数(脐血2.05±0.05,外周血0.45±0.01),两组有显著差异(P<0.05)。比较两种来源的DC在形态及细胞表型上无显著差异(P>0.05),两者刺激同种异体混合淋巴细胞增殖的能力无显著差异。【结论】脐血和外周血均可成功诱导成熟DC,脐血诱导DC增殖比外周血效率高。     

当归多糖对乙肝病毒转基因小鼠树突状细胞功能状态的影响

目的:探讨当归多糖对乙肝病毒转基因小鼠树突状细胞功能状态的影响。方法:取当归多糖处理和未处理的转基因小鼠脾脏来源的单个核细胞,以重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组小鼠白细胞介素-4培养诱导树突状细胞,显微镜下观察其形态,流式细胞仪检测其表面共刺激分子(CD80,CD86),MTT法检测其刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,ELISA法测定培养上清液中IL-12、r-IFN水平等方法进行研究。结果:当归多糖处理组小鼠树突状细胞的表面协同刺激分子(CD86)表达水平、刺激同种异体淋巴细胞增殖能力和细胞因子产生水平均高于对照组(P<0.05)。结论:当归多糖可以促进乙肝病毒转基因小鼠树突状细胞的成熟,上调其表面协同刺激分子CD86的表达,增强了其促淋巴细胞细胞增殖和分泌IL-12、r-IFN的能力,加强其抗原递呈能力,诱导细胞免疫反应,在乙肝病毒转基因小鼠抗病毒免疫中可能发挥一定的作用。     

负载肝癌肿瘤抗原的B淋巴细胞诱导特异性抗肿瘤免疫的实验研究

目的:探讨体外经小鼠肝癌细胞不同抗原致敏的CD40配体活化的B淋巴细胞诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)抗肿瘤免疫的能力.方法:分离、纯化T、B混合淋巴细胞,并在CD40L、rmIL-4联合作用下培养.然后分离T、B淋巴细胞以备用.将凋亡的肝癌细胞及其冻融裂解物作为实验组,1640培养基作为空白对照组分别与B淋巴细胞共同培养,检测培养后各组B细胞表面抗原呈递细胞标记(CD40、CD80、CD86)及主要组织相容性抗原的表达情况.利用混合淋巴细胞增殖实验检测T细胞增殖情况.以负载肿瘤抗原的B淋巴细胞诱导的CTL作为效应细胞,肝癌细胞Hepal-6为靶细胞,LDH释放实验检测杀伤活性.结果:负载肿瘤抗原的B淋巴细胞具有刺激T细胞增殖的能力,实验组的B淋巴细胞,其组织相容性分子及其刺激分子表达明显高于空白对照组,其对靶细胞的杀伤率与空白对照组比较经统计学分析差异有显著性.结论:负载肝癌肿瘤抗原的B淋巴细胞作为抗原呈递细胞诱导的CTL可有效产生特异性抗肝癌免疫作用.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA对树突状细胞成熟的影响及其机制

目的:本研究探讨新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA(Suberoylanilide hydroxamic acid)对健康人外周血单个核细胞(PBMNC)来源树突状细胞(DC)成熟的影响及其机制。方法:PBMNC取自健康志愿者的外周血,经贴壁处理后培养于含100 ng/ml rh GM-CSF、500 U/ml rh IL-4的RPMI 1640完全培养液中,用脂多糖(LPS)刺激经SAHA处理和未经处理的DC为实验组,并将不经LPS和SAHA处理的细胞设为对照组,在倒置显微镜下观察各组细胞形态学改变;流式细胞术检测各组DC表面抗原的表达情况;采用混合淋巴细胞培养法(MLC)观察各组DC对同种异体T淋巴细胞的刺激作用;应用凝胶电泳迁移变动测定法(EMSA)检测各组DC NF-κB通路的活化情况。结果:SAHA能够有效抑制LPS诱导的DC成熟,主要表现在经SAHA+LPS处理的DC具有未成熟DC的形态学特征;经SAHA+LPS处理组和对照组的DC表面抗原CD80、CD83、HLA-DR的表达量均低于单用LPS组(P0.01);SAHA+LPS处理组和对照组的DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力明显低于单用LPS刺激组(P0.01);电泳迁移变动检测(EM SA)实验结果提示,SAHA+LPS处理的DC NF-κB活性显著下降。结论:SAHA能够有效抑制DC的成熟和对异基因T淋巴细胞的刺激作用,该作用与SAHA抑制DC NF-κB信号通路活化有关。     

抗原冲击致敏树突状细胞诱导特异性CTL杀伤Jurkat细胞实验研究

本研究以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导其为树突状细胞（DC），分别负载Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽抗原，产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL），以探讨其对白血病Jurkat细胞的杀伤作用。联合应用rhGM—CSF、rhIL-4、rhTNF-α及rhsCD40L等细胞因子，密度梯度离心法、贴壁法从外周血获取单核细胞并进行诱导扩增，培养出DC，分别用冻融抗原及WT1多肽抗原冲击致敏DC。实验分4组：冻融抗原致敏DC组为实验组A，WT1多肽致敏DC组为实验组B，未致敏DC组为对照组A，单核细胞组为对照组B，观察CTL对Jurkat细胞的杀伤作用。结果表明：培养出了具有典型特征的DC，它高表达CD40、CD80、CD1a及CD86等表面标志，能体外诱导强烈的同种异基因混合淋巴细胞增殖反应。实验组显示高水平杀伤率，与对照组比较均具有统计学意义（P〈0.01），实验组A、B间比较无统计学意义。结论：Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽抗原冲击致敏DC能有效诱导T细胞抗白血病作用，为临床研制DC疫苗提供了实验依据。     

TNF-α促进树突状细胞分化成熟的实验研究

本研究探讨不同浓度肿瘤坏死因子α(TNF-α)对人外周血单个核细胞来源树突状细胞(MNC-derived den-dritic cells,MNCDC)分化成熟的影响。采集正常健康成人外周血30 ml,以Thomas法分离外周血单个核细胞(PBMNC),用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素-4(rhIL-4)于体外联合诱导培养8天,并于培养第5天加入不同浓度的rhTNF-α共同培养;用流式细胞术检测DC膜表面的HLA-DR、CD83和CD1a表达,用MTT法检测DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果表明,不同浓度的TNF-α能不同程度地刺激DC表达HLA-DR、CD83和CD1a,增强DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结论:TNF-α能够显著增强外周血单个核细胞来源DC的分化和成熟,不同浓度TNF-α能不同程度地刺激MNCDC功能成熟,TNF-α浓度为20ng/ml时刺激DC分化成熟的作用最强。     

HBcAg和HBeAg对人树突状细胞成熟和功能的影响

目的观察乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen,HBcAg)和乙型肝炎e抗原(hepatits B e antigen,HBeAg)对人树突状细胞的影响。方法分离20例健康者外周抗凝血淋巴细胞,将贴壁细胞加重组人白细胞介素4和重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子培养至第7天,将树突状细胞分为HBcAg组、HBeAg组和树突状细胞对照组,分别加入HBcAg、HBeAg对树突状细胞刺激培养至第10天,检测刺激培养后细胞表型与分泌的细胞因子及其对树突状细胞体外诱导的淋巴细胞增殖效应和淋巴细胞毒活性的影响。结果 HBcAg组、HBeAg组树突状细胞表面分子(CD83,CD86,HLA-ABC)水平和分泌干扰素-γ、白细胞介素-12p70水平、体外诱导淋巴细胞增殖效应及淋巴细胞毒活性与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);HBcAg组增强树突状细胞的分子表达、分泌白细胞介素-12p70及体外诱导淋巴细胞毒活性与HBeAg组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 HBcAg和HBeAg可增加人树突状细胞表达成熟活化的分子、分泌细胞因子,增强树突状细胞体外诱导淋巴细胞增殖效应及淋巴细胞毒活性。     

VEGF对白血病树突状细胞诱导CTL杀伤活性的影响

目的观察血管内皮生长因子(VEGF)对白血病树突状细胞(DC)激活的CTL体外杀伤活性的影响。方法K562白血病细胞经5μmol/L VEGF反义寡核苷酸作用24 h后诱导生成DC。流式细胞术检测DC特征性表型(CD40、CD86、HLA-DR和CD83)的表达,MTT法检测DC激发的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对靶细胞的杀伤活性。ELISA法检测DC上清中IL-12的表达。结果与正常K562诱生的DC(K562-DC)相比,K562经反义寡核苷酸下调VEGF表达后培养出具有典型特征的DC(AS-K562-DC),它不仅高表达DC免疫表型,而且激活的CTL对K562细胞具有更强的杀伤效应,同时具有更强的IL-12分泌能力(P均<0.05)。结论抑制白血病细胞VEGF表达,能够促进白血病源DC的分化和成熟,激活的CTL在体外具有更强的抗白血病效应。     

多药耐药K562/A02和敏感K562细胞来源的树突状细胞介导抗白血病效应对比研究

本研究探讨多药耐药(MDR)白血病K562/A02细胞和敏感K562细胞诱导树突状细胞(DC)分化及介导的抗白血病效应。采用慢性粒细胞白血病(CML)P170糖蛋白(Pgp)高表达的MDRK562/A02细胞、敏感K562细胞在含细胞因子GMCSF(1000U/ml)、IL4(500U/ml)和TNFα(100ng/ml)的RPMI1640完全培养液中诱导分化成DC,以光镜观察细胞形态、流式细胞术检测细胞表型,异基因混合淋巴细胞反应(alloMLR)检测T细胞增殖活性,MTT法测定细胞毒作用。结果表明:培养14天的K562/A02细胞和K562细胞均出现典型的DC形态特征,表达DC的相关分化抗原及共刺激分子CD1a、CD83、HLADR、CD80、CD86。alloMLR检测中,K562/A02DC较K562DC具有更强的刺激异基因T细胞增殖能力(P<0.05)。两种DC激活的CTL分别对K562/A02和K562细胞较HL60细胞具有显著的杀伤活性(P<0.01);更重要的是,K562/A02DC较K562DC激活的CTL对Pgp高表达的MDRK562/A02细胞、HL60/VCR细胞具有更强的细胞毒作用,杀伤活性分别为(40.7±1.3)%、(28.4±0.9)%(P<0.01)和(24.9±1.1)%、(8.2±0.7)%(P<0.01)。结论:Pgp高表达的MDR白血病细胞K562/A02和敏感K562细胞都可在GMCSF、IL4和TNFα作用下诱导分化为成熟DC,均可活化CTL产生特异的抗白血病效应;尤其K562/A02细胞来源的DC可介导针对Pgp高表达的多药耐药白血病的特异细胞毒作用。     

白血病细胞系来源的树突状细胞诱导及其抗肿瘤免疫功能研究

树突状细胞（DC）在抗肿瘤免疫反应中起关键作用，但大多数白血病病病人有DC功能缺陷，在外体扩增DC并增强其抗肿瘤免疫功能及以DC为基础的肿瘤疫苗是对白血病有效的免疫治疗方法，为了探讨由不同的髓性白血病细胞诱生DC的条件及其抗白血病反应，选用HL－60，K562和THP－1细胞与不同的细胞因子组合诱生DC，以光学和电子显微镜术观察形态特征，用流式细胞术和单克隆抗体检测细胞表型，以同种混合淋巴细胞反应观察刺激淋巴细胞增殖，用^51Cr释放法检测诱生细胞的细胞术和单克隆抗体检测细胞表型，以同种混合淋巴细胞反应观察刺激淋巴细胞增殖，用^51Cr释放法检测诱生细胞的细胞毒作用，用ELISA法测定DC培养及DC＋血单个核细胞培养的血清中IL－12及INF－γ的量，结果表明，由K562，HL－60和THP－1细胞诱生的DC具有村突状细胞的形太学特征，细胞表达DC的表面分化抗原，其中GM－CSF＋IL－4＋TNF-γ刺激HL－60－DC和THP－DC和GMCSF＋IL－4＋IL－12刺激的K562－DC中有抗原表达。3种细胞诱生的DC对混合淋巴细胞反应CTL反应有强刺激细胞因子能诱导髓性白细胞产生DC，不同细胞需要不同的细胞因子和培养条件，这些DC表达抗原呈递细胞的表型具有刺激T淋巴细胞增殖和诱导CTL反应以及分泌IL－2和促进T细胞分泌INF－γ的作用。     

p53基因修饰树突细胞诱导特异性抗肿瘤免疫应答的实验研究

目的　探讨含p5 3基因的质粒pC5 3 SN3转染的树突细胞 (DC)体外诱导特异性抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)。方法　应用脂质体介导将质粒pC5 3 SN3转染肺癌患者单个核细胞 [HLA A2 + ]衍生的DC ,然后与未经纯化的自体T细胞混合培养以诱导CTL(T pC5 3 SN3) ,并通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验测定其对p5 3基因突变的HLA A2 + 人肺癌细胞系Calu 6的杀伤活性。结果　用质粒pC5 3 SN3转染DC后 ,发现CD1a、CD83显著升高 ,转染前表达率分别为 (5 .4 5± 0 .89) %、(3.2 6± 0 .4 7) % ,转染后分别为 (5 2 .15± 11.5 6 ) %、(2 5 .78± 12 .35 ) %。但CD86 、CD4 0 、HLA DR等DC相关标志与转染前无明显改变。LDH释放实验显示 ,以Calu 6作为靶细胞 ,T pC5 3 SN3诱导的杀伤作用显著高于T IL 2(IL 2 10 0U ml刺激外周血单个核细胞产生的CTL) ,效靶比为 10∶1时其杀伤活性分别为 (5 6 .79±15 .6 7) %和 (39.33± 9.88) %。同时细胞表面标记检测可见T pC5 3 SN3细胞中以CD8+ 细胞为主 ,且CD6 9、CD4 5RO CD8表达均显著升高。结论　p5 3基因修饰的DC对p5 3突变的人肺癌细胞系可有效诱导HLA A2限制的特异性CTL。     

钙离子载体诱导慢性髓系白血病细胞分化为树突状细胞的实验研究

本研究旨在探索钙载体（calcium ionophore,CI）诱导慢性髓性白血病（CML）细胞分化成树突状细胞（DC）的作用,了解诱导产生P210蛋白的情况和刺激自身T细胞产生针对CML细胞的细胞毒作用。用CI和粒－单集落刺激因子（GM—CSF）联合诱导CML病人骨髓来源的单个核细胞,通过倒置显微镜和电子显微镜观察细胞的形态变化和超微结构,用流式细胞仪检测细胞表面分化抗原的变化和变化过程;用Western blot检测CML特异的肿瘤标志物P210蛋白在DC中的表达;通过乳酸脱氢酶（LDH）实验评估CI诱导的CML—DC刺激自身T细胞产生抗CML细胞的细胞毒作用。结果表明：CML细胞经CI和GM—CSF联合诱导96小时后在倒置显微镜和电子显微镜下观察到DC典型的形态结构;流式细胞仪检测显示CD83、CD86、CD80、HLA—DR、CD40等细胞表面分化抗原的表达显著提高;Western blot实验表明,生成的CML—DC有P210蛋白的表达,与未经诱导的CML单个核细胞比较,用CI和GM—CSF联合诱导生成的CML－DC的P210蛋白表达水平降低;LDH实验表明,这些CML—DC刺激的自身T细胞对CML细胞的杀伤率显著高于用CML细胞刺激的自身T细胞。结论：CI和GM—CSF联合能快速诱导CML细胞分化成DC,这些CML—DC表达CML细胞特异的肿瘤标志物P210蛋白,但其表达水平较未经诱导的CML单个核细胞低;CML细胞经诱导生成的CML—DC能够刺激自身T细胞产生抗白血病细胞毒性。     

外周血单核细胞来源树突状细胞体外扩增及诱导抗乳腺癌免疫的研究

目的研究外周血来源树突状细胞(DC)的体外扩增及诱导特异性抗乳腺癌细胞的免疫效应。方法(1)从外周血中分离单个核细胞后,获得单核细胞(monocyte,Mo)。粒-单集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)诱导分化扩增培养7d后,应用流式细胞术进行表型分析。(2)诱导单核细胞分化的第3天加入人乳腺癌细胞株3A0的冻融抗原培养4d后,获得负载肿瘤抗原的成熟DC;将致敏DC与从外周血中分离的同种异体T淋巴细胞共培养3d,获得细胞毒T淋巴细胞(CTL);四甲基偶氮唑蓝法检测CTL及上清液对人乳腺癌细胞株3A0、人胚肾细胞株293T(对照细胞)、人肝癌细胞株HCCC-9810的细胞毒作用。结果(1)外周血来源Mo在GM-GSF和IL-4作用下,第7天后可分化生成成熟的DC,高表达DC特异性抗原CDla、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)HLA-DR、CD83。(2)DC可负载并递呈肿瘤抗原,激活同种异体T淋巴细胞,诱导肿瘤特异性CTL产生。不同浓度CTL及上清液对乳腺癌细胞3A0有特异性杀伤、抑制作用(P<0.05)。结论外周血中Mo可体外分化扩增为成熟的功能性DC,并诱导出特异性杀伤乳腺癌细胞的免疫效应。     

慢性粒细胞白血病树突状细胞瘤苗对T淋巴细胞刺激作用的研究

目的　观察细胞因子联合培养诱生的白血病树突状细胞 (DC)表型和抗原提呈功能。方法　慢性粒细胞白血病细胞和K5 6 2细胞应用GM CSF IL 4 TNF α联合培养后进行细胞表型和激活淋巴细胞对白血病细胞杀伤活性的检测。结果　CML DC和K 5 6 2 DC具有DC的形态特征和超微结构 ,表达CD1a、CD80和CD86等DC相关抗原 ,并可激活淋巴细胞产生增殖反应 ,并产生针对白血病细胞的特异性细胞毒性 ,同时此种DC可不同程度地分泌IL 12并协助淋巴细胞产生IFN γ。结论　慢性粒细胞白血病细胞和K5 6 2细胞在细胞因子的诱导下 ,可分化为具有DC形态和功能的特异性抗原提呈细胞。     

CD8(+) T cells mediate CD40-independent maturation of dendritic cells in vivo.

Induction of cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses against minor histocompatibility antigens is dependent upon the presence of T cell help and requires the interaction of CD40 on dendritic cells (DCs) with CD40 ligand on activated T helper cells (Th). This study demonstrates that CD40 is neither involved in Th-dependent nor Th-independent antiviral CTL responses. Moreover, the data show that DC maturation occurs in vivo after viral infection in the absence of CD40 and Th. This maturation did not require viral infection of DCs but was mediated by peptide-specific CD8(+) T cells. Surprisingly, naive CD8(+) T cells were able to trigger DC maturation within 24 h after activation in vivo and in vitro. Moreover, peptide-activated CD8(+) T cells were able to induce maturation in trans, as DCs that failed to present the relevant antigen in vivo also underwent maturation. Upon isolation, the in vivo-stimulated DCs were able to convert a classically Th-dependent CTL response (anti-HY) into a Th-independent response in vitro. Thus, antiviral CD8(+) T cells are sufficient for the maturation of DCs in the absence of CD40.