过表达miRNA-224骨髓间充质干细胞对卵巢颗粒细胞增殖和氧化应激的影响

目的:探讨过表达miRNA-224骨髓间充质干细胞(BMSCs)对卵巢颗粒细胞的作用及其机制。方法:构建miRNA-224慢病毒载体,转染BMSCs,qRT-PCR法验证转染效率。将转染后的BMSCs与卵巢颗粒细胞共培养后分为六组:对照组、BMSCs组、miRNA-224-BMSCs组、顺铂组、BMSCs+顺铂组和miRNA-224-BMSCs+顺铂组。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)试剂盒检测氧化应激水平。结果:qRT-PCR法结果表明,转染后BMSCs miRNA-224的表达显著上调,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,顺铂组细胞存活率显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),而与顺铂组相比,BMSCs+顺铂组和miRNA-224-BMSCs+顺铂组细胞存活率显著升高,且相较于BMSCs+顺铂组,miRNA-224-BMSCs+顺铂组细胞存活率进一步升高,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,顺铂组细胞MDA和ROS水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),而与顺铂组相比,BMSCs+顺铂组和miRNA-224-BMSCs+顺铂组细胞MDA和ROS水平显著降低,且相较于BMSCs+顺铂组,miRNA-224-BMSCs+顺铂组细胞MDA和ROS水平进一步降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:过表达miRNA-224的BMSCs可明显降低顺铂诱导的卵巢颗粒细胞凋亡,其机制与氧化应激有关。     

骨髓间充质干细胞对重症急性胰腺炎大鼠胰腺氧化应激损伤的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)对重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）大鼠胰腺氧化应激损伤的影响。方法 应用4～6周龄雄性SD大鼠常规方法提取、培养、鉴定BMSCs。6～8周龄SD雄性大鼠随机分为空白对照组、假手术组、模型组、移植组、每组20只。模型组逆行胆管注射牛磺胆酸钠制备SAP动物模型,移植组在造模成功后6h尾静脉注射BMSCs,对照组注射等量PBS。3d后提取胰腺组织和血清,检测胰腺组织丙二醛、超氧化物岐化酶、过氧化氢酶和活性氧簇水平,分别检测血中炎症因子水平和淀粉酶活性,通过病理评分评估胰腺的损伤。结果 与对照组和假手术组相比,模型组的病理评分、血淀粉酶、MDA和ROS水平明显增高（P＜0.01）,CAT和SOD活性降低（均P＜0.01）。经BMSCs治疗后,病理评分、血清淀粉酶、MDA和ROS水平均较SAP模型组降低（均P＜0.05）,SOD和CAT活性明显增高（均P＜0.05）。结论 BMSC能明显改善SAP大鼠胰腺氧化应激损伤。     

骨髓间充质干细胞的免疫调节活性

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种多潜能的非造血干细胞,可以向多系分化,如骨、脂肪和软骨,并优先归巢于损伤组织,有利于组织修复。体外研究显示它们不诱导免疫应答,对识别、清除同种异体抗原的免疫细胞具有抑制作用。在动物实验中,骨髓间充质干细胞可以诱导外周免疫耐受并向损伤处迁移,抑制致炎细胞因子的释放,促进损伤组织修复。这种独特作用说明它们在细胞治疗和自身免疫性疾病治疗中发挥了积极作用。     

剪应力诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化

目的：研究剪应力对骨髓间充质干细胞（MSCs）分化的作用.方法：采用平行平板流动腔系统,将人骨髓间充质干细胞在3×10-5,8×10-5,15×10-5N/cm2剪应力水平分别作用24h,观察细胞形态变化,并进行内皮细胞标记物Von Willebrand factor（vWF）定性间接免疫荧光染色,进行Dil标记的乙酰化LDL（Dil-Ac-LDL）摄取实验以鉴定是否具有内皮细胞功能.结果：在剪应力作用24h后,MSCs形态变得偏圆、呈多角形,平行于流体方向排列.MSCs在接受3×10-5,8×10-5N/cm2剪应力作用24h后vWF染色阳性,提示内皮细胞表型特征,同时Dil-Ac-LDL摄取实验阳性,提示具有内皮细胞功能.而接受15×10-5N/cm2剪应力作用的MSCs,vWF染色与Dil-Ac-LDL摄取实验均阴性,提示未出现向内皮细胞分化.结论：剪应力可诱导MSCs向内皮细胞分化,并且与力的大小相关.     

骨髓间充质干细胞对肾缺血再灌注损伤后肾功能及氧化应激水平的改善作用

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）促肾缺血再灌注损伤修复的能力,为肾脏疾病治疗提供新的思路。 方法：健康3周龄C57BL/6J小鼠的骨髓细胞悬液进行BMSCs体外扩增培养。8周龄C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、平行对照组和细胞移植组,每组16只小鼠。建立肾缺血-再灌注损伤模型,将BMSCs通过尾静脉注射到细胞移植组小鼠中,平行对照组注射生理盐水。检测肾功能指标血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平变化、损伤肾组织自由基--羟自由基和超氧阴离子自由基变化和肾形态学变化。结果：①分离培养的BMSCs增殖旺盛,纯度较高,且均质性和稳定性好。②平行对照组小鼠整体状态差,肾功能指标、氧化应激指标明显升高,组织形态学出现肾小球崩解,肾小管结构消失,肾间质见大量炎性细胞浸润。而细胞移植组小鼠整体状态良好,肾功能指标和氧化应激指标得到明显改善（P<0.05）,组织形态学未出现明显病理性改变。结论：BMSCs在体外易分离培养,具有旺盛的增殖能力;移植BMSCs后,通过抑制氧自由基的生成来促进肾缺血-灌注损伤后小鼠的恢复。     

端粒酶活性在骨髓间充质干细胞中的表达

目的：探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells MSCs)端粒酶活性的表达并检测其部分生物学特性。方法：取正常成人骨髓用含10%新生牛血清的LG-DMEM培养液培养、扩增。流式细胞仪行细胞表面抗原检测,细胞化学染色鉴定其生物学特性,观察其在地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C特定培养条件下向成骨细胞分化的能力,采用TRAP（Telomerase repeat amplification protoco1 assay)-银染法测定其端粒酶的活性。结果：分离培养获得的贴壁细胞,碱性磷酸酶染色阳性。流式细胞仪检测CD34、CD45呈阴性表达,CD29、CD44呈阳性表达。经向成骨细胞诱导3周后,可得到成骨细胞,经茜素红染色得到证实。TRAP-银染法证实MSCs表达一定的端粒酶活性。结论：体外分离培养的MSCs可以向成骨分化,表达一定的端粒酶活性,具有干细胞的特性。     

Effect of You-Gui Yin on glucocorticoid-induced apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells

Objective: To investigate the effect of You-Gui Yin on glucocorticoid-induced apoptosis of rat bone marrow mesenchymal stem cells and its possible mechanism. Methods: 20 SD rats were divided into normal saline group and You-Gui Yin group. Ten rats in each group were given normal saline and You-Gui Yin by gavage for 2 weeks, once daily. After the gavage, the rats were sacrificed by spinal removal, blood was taken from the abdominal aorta and centrifuged to obtain blank serum and medicated serum. The rat bone marrow mesenchymal stem cells were extracted and cultured and administered in groups: blank group (10％ blank serum) , Model group (10％ blank serum + dexamethasone 5×10-5mol/ml), traditional Chinese medicine group (10％ medicated serum + dexamethasone 5×10-5mol/ml), control group (10％ medicated serum), CCK-8 method was used to detect cell proliferation changes in different groups, ELISA method was used to detect bone alkaline phosphatase levels in each group, Alizarin red staining was used to compare red-stained calcium mineralized nodules in each group, Western Blot Detect the expression of apoptosis-related proteins in BMSCs, and perform molecular docking of the quantitative components to evaluate the binding strength and activity of the target and the active compound. Results: The ratio of absorbance (A450) in each time period of the model group was significantly reduced (P<0.05), and the ratio of absorbance (A450) between the traditional Chinese medicine group and the control group was significantly higher than that of the model group (P<0.05). There was no difference between the control group and the blank group (P>0.05); ELISA method showed that the ALP level of the model group was significantly lower than that of the blank group and the control group (P<0.05), the traditional Chinese medicine group significantly increased the ALP level (P<0.05), there was no significant difference between the control group and the blank group; Observation of the number of calcium mineralized nodules under alizarin red staining microscope suggests that the number of calcium mineralized nodules in the model group is significantly lower than that of each group, and there is no significant difference between the control group and the blank group. Both groups are higher than the model group and traditional Chinese medicine Group; Western Blot indicated that compared with the blank group, the expression levels of pro-apoptotic proteins Bax and Cleaved-casepase-3 in the model group were significantly increased (P<0.01), and the expression levels of anti-apoptotic protein Bcl-2 were decreased (P<0.01), on the contrary in the traditional Chinese medicine group, the expression of the control group did not change significantly compared with the blank group; the molecular docking results showed that You-Gui Yin mainly regulates the apoptosis of BMSCs through Epicatechin 5,7,3'-trimethyl ether, Delphinin, etc. promote bone formation. Conclusion: You-Gui Yin medicated serum can protect BMSCs from apoptosis induced by GCs and promote BMSCs proliferation and osteogenic differentiation by regulating Bax, Cleaved-caspase3, and Bcl-2.     

骨髓间充质干细胞条件膜微粒对心脏成纤维细胞的影响

目的：探讨体外缺氧条件下骨髓间充质干细胞（MSCs）凋亡膜微粒（MSC-MPs）对心脏成纤维细胞（CFs）增殖、迁移和胶原合成的影响。方法：提取SD大鼠MSCs,在缺氧低营养条件下培养,收集上清液并提取MSC-MPs,用MSC-MPs刺激大鼠CFs,用cck-8和划痕实验分别检测CFs增殖和迁移,qRT-PCR检测CFs中I型胶原、III型胶原、血管平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波型蛋白和纤连蛋白的合成情况。结果：CFs被MSC-MPs刺激后,与对照组比较,其增殖能力明显增加（P＜0.05）,迁移能力无明显变化（P＞0.05）,I型胶原、III型胶原、波型蛋白和纤连蛋白合成增加（均P＜0.05）。结论：体外缺氧条件下MSC-MPs可促进CFs的增殖和胶原合成能力,而对CFs的迁移能力无明显影响。     

人骨髓间充质干细胞端粒酶活性的表达

目的:探讨人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)端粒酶活性的表达以及深低温冻存和向脂肪细胞诱导分化对基因表达的影响.方法:联合应用密度梯度离心法和贴壁培养法分离人hMSCs,传代培养.深低温冻存hMSCs或诱导其向脂肪细胞分化,以TRAP(Telomerase repeat amplification protocol assay) 法分别检测新鲜的不同传代次数的hMSCs、冻存复苏后培养的hMSCs和诱导分化为脂肪细胞的hMSCs的端粒酶活性.结果:用TRAP法检测hMSCs(n=19)端粒酶活性(RTA)是(1.46±0.67)%,分化成脂肪的hMSCs(n=3)的RTA为(11.80±2.52)%(P<0.001);不同传代次数MSCs端粒酶活性的比较中,早期hMSCs(n=10)的RTA为(1.46±0.83)%,晚期hMSCs(n=9)的RTA为(1.46±0.47)%(P=0.99);在低温冻存对hMSCs端粒酶活性的影响中,新鲜的hMSCs(n=13)的RTA为(1.41±0.44)%,低温冻存的hMSCs(n=6)的RTA为(1.57±1.07)%(P=0.64).结论:hMSCs的端粒酶呈阴性,传代培养和低温冻存不影响基因表达水平.向脂肪细胞分化后hMSCs端粒酶活性表达水平增高,其确切机制尚需进一步研究.     

DMOG促进骨髓间充质干细胞血管新生作用的研究

目的探讨在缺氧缺血清环境下,脯氨酸羟化酶抑制剂———二甲基乙二酰甘氨酸（DMOG）促进骨髓间充质干细胞（MSCs）血管新生的作用及其机制。方法MSCs从大鼠骨髓中分离得到,分为：常氧条件下溶剂对照组（N-DMSO）、缺氧条件下溶剂对照组（H-DMSO）、20μMDMOG加药组（D-20滋M）、100滋MDMOG加药组（D-100滋M）及500μMDMOG加药组（D-500滋M）,观察以下指标：（1）通过缺氧条件下CCK-8检测DMOG在20μM、100μM及500滋M剂量下对MSCs的保护作用,确定DMOG的最佳剂量;（2）通过Matrigel实验观察DMOG促进MSCs血管新生的作用;（3）通过Westernblot法检测血管新生通路相关蛋白表达。结果（1）不同浓度组DMOG对缺氧损伤MSCs的影响：N-DMSO组OD值3.25±0.05,H-DMSO组2.23±0.14,D-20滋M组2.68±0.43,D-100滋M组3.11±0.25,D-500滋M组3.23±0.04。与N-DMSO组比较,H-DMSO组OD值降低（P＜0.01）,与H-DMSO组比较,D-20滋M组、D-100滋M组、D-500滋MOD值均升高（P＜0.05或0.01）。（2）不同浓度组DMOG对正常MSCs的影响：D-20滋M组3.19±0.02,D-100滋M组3.15±0.06,D-500滋M组2.51±0.08。与N-DMSO组比较,D-500滋M组OD值降低（P＜0.01）,D-20滋M组、D-100滋M组与N-DMSO组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）,提示DMOG在20滋M及100滋M对细胞无毒性。（3）血管新生相关蛋白的表达：与H-DMSO组相比,D-100μM组缺氧3、6及24hHIF-1α均增加（1.44±0.32vs7.79±0.23,2.4±0.28vs3.51±0.79,0.93±0.37vs2.46±0.07,P＜0.05或0.01）,pAKT则在缺氧6h增加（0.47±0.15vs0.71±0.03,P＜0.05）,VEGF在缺氧6、24h均增加（0.63±0.10vs0.87±0.14,0.42±0.06vs0.70±0.06,P＜0.05或0.01）,以缺氧24h最为显著。pmTOR/mTOR及pERK/ERK蛋白两组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论DMOG通过抑制HIF-1α降解及促进AKT磷酸化提高缺氧环境下MSCs的血管新生能力。     

骨髓基质干细胞的成软骨能力

目的 综述近年骨髓基质干细胞成软骨分化的研究进展。方法 广泛查阅近期有关骨髓基质干细胞成软骨分化的研究文献。着重阐述与成软骨分化有关的生长因子及分化后的组织成分。结果 骨髓基质干细胞取材方便，体外扩增迅速，在特定的软骨培养液和生长因子作用下，可形成软骨样组织。作为自体来源的细胞可修复动物关节软骨缺损，避免了免疫反应。结论 骨髓基质干细胞扩增后数量多，具有明确的成软骨能力，作自体移植无免疫反应，用于软骨组织工程有广阔的前景。成软骨分化的调控机制和应用值得进一步研究。     

小寡核苷酸对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的：筛选具有促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化作用的小寡核苷酸（ODN）,探讨ODN对BMSCs向成骨细胞分化的影响。方法：取第3代BMSCs孵育24 h后进行成骨诱导,双盲法加入12条不同的ODN,PBS作为溶媒对照组,应用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测ODN于不同工作浓度（4.0、 2.0、 1.0和 0.5 mg/L）、不同时间点（24、72和120 h）刺激经成骨诱导后的BMSCs内ALP的表达水平,筛选出具有促成骨分化作用的ODN。结果：与PBS溶媒对照组比较,ODN工作浓度为4.0和0.5 mg/L时,实验组与对照组ALP表达水平差异无显著性(P>0.05),ODN工作浓度为2.0和1.0 mg/L时,有2条ODN在不同时间点（24、72和120 h）均可促进BMSCs内ALP的表达（P<0.01）。结论：在12条不同的ODN中共筛选出2条具有促进BMSCs成骨分化作用的ODN,表明特定序列的ODN能够影响大鼠BMSCs向成骨细胞的分化。     

罗哌卡因对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和迁移能力的影响

目的：探讨罗哌卡因对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）增殖能力和迁移能力的影响,为BMSCs的临床应用提供进一步的研究基础。方法：使用贴壁法分离扩增大鼠BMSCs,流式细胞仪检测细胞表面分子标志物;成脂、成骨和成肌诱导分化检测细胞的分化潜能;分别使用CCK-8和Brdu掺入方法检测不同浓度罗哌卡因处理对BMSCs增殖能力的影响;细胞划痕实验和Millicell小室迁移实验检测不同浓度罗哌卡因对大鼠BMSCs迁移能力的影响。结果：培养所得细胞具备BMSCs的表面标志物特点和多向分化潜能。50,100μmol/L罗哌卡因处理可显著降低BMSCs的增殖速度,降低BMSCs的Brdu阳性率,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。划痕实验和迁移实验表明罗哌卡因处理可引起BMSCs迁移能力的明显降低（P〈0.05）。上述效应均对罗哌卡因的给药剂量呈现明显的剂量依赖关系,组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：罗哌卡因可显著降低大鼠BMSCs的增殖能力和细胞迁移能力,提示外科应用BMSCs时需注意罗哌卡因等长效局部麻醉剂对BMSCs造成的不利影响。     

骨髓间质干细胞分离培养及向心肌细胞的转化

目的:探讨骨髓间质干细胞(MsCs)诱导分化为心肌细胞的可能性,为干细胞移植治疗心肌梗死寻求理想的细胞材料.方法:体外分离培养大鼠骨髓MSCs,5-氮胞苷(5-aza)诱导24 h后继续培养,免疫细胞化学染色和RT-PCR检测心肌细胞特异性蛋白的表达.结果:MSCs经5-aza诱导后3周心肌肌钙蛋白T和连接蛋白43免疫细胞化学染色阳性表达;RT-PCR显示诱导3周细胞有心肌肌钙蛋白I、α心肌肌动蛋白表达.结论:MsCs可在体外经5-aza诱导定向分化为心肌细胞.     

骨髓间充质干细胞改善糖尿病大鼠勃起功能障碍的研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）移植到大鼠阴茎海绵体组织后对勃起功能的影响。方法：体外分离培养BMMSCs并利用形态学及流式细胞术进行鉴定证实。用腹腔注射链脲左菌素（Streptozotocin,STZ）建立糖尿病性大鼠模型,并用阿扑吗啡（Apomorphine,APO）筛选出糖尿病勃起功能障碍（Diabetes mellitus induced erectile dysfunction,DMED）大鼠模型,成模后将BMMSCs（2×106个）移植于大鼠阴茎海绵体内。2周后,分别对正常组、糖尿病组及治疗组进行海绵体内压（Intracorporeal pressure,ICP）及平均动脉压（Mean arterial blood pressure,MAP）测定并取大鼠阴茎海绵体组织,荧光显微镜下观察BMMSCs的局部存活情况,苏木素-伊红染色（Hematoxylin and eosin,HE）观察阴茎海绵体组织中血管。结果：荧光显微镜观察提示BMMSCs能在糖尿病大鼠体内存活;勃起功能测定结果表明治疗组大鼠ICP/MAP比值明显高于糖尿病组;HE染色结果显示在治疗组大鼠阴茎海绵体中血管数目[（12.75±1.89）根/HP]多于糖尿病组[（8.05±1.43）根/HP]。结论：BMMSCs能够有效改善糖尿病性大鼠勃起功能。     

骨髓间质干细胞对大鼠脑损伤后血管再生的影响

目的：探讨骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)对大鼠颅脑损伤后血管再生的影响。方法：自由落体法建立大鼠脑撞击伤模型,50只Sprague-Dawley大鼠随机分为移植组和对照组,每组25只。移植组大鼠手术后12 h侧脑室注射法移植BM-MSCs,对照组仅注射生理盐水。术后第 1,3,7,14和21天行改良大鼠神经功能缺损评分(modified neurological deficit scores of rats,mNSS)。于术前,术后3,6,12,24 h和3,7 d采用流式细胞仪检测大鼠外周血CD34和CD133抗体双标记细胞。免疫组织化学SP法检测损伤周围脑组织CD31和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)的表达。结果：两组间mNSS分值差异有统计学意义(F=5.997,P<0.05),组内不同时间点间差异也有统计学意义(F=37.106,P<0.01)。术后第7,14,21天对照组较移植组 mNSS评分高,差异有统计学意义(均P<0.05)。大鼠外周血中存在CD34和CDl33双阳性细胞表达。对照组大鼠外周血中CD34和CDl33双阳性细胞数伤后3 h为下降状态,后升高,伤后6 h达最高点,此后逐渐下降,伤后24 h降至正常水平。移植组有同样的趋势,CD34和CDl33双阳性细胞升高持续到伤后24 h,其数量明显高于对照组(P<0.05)。术前两组NSE均有阳性表达,术后7,14 d时移植组的NSE表达显著高于对照组(P<0.05)。术前两组CD31的阳性表达很少,术后3,7 d时移植组的CD31表达显著高于对照组(均P<0.05)。结论：BM-MSCs移植可以增加脑创伤后大鼠外周血中内皮祖细胞数量并持续约24 h,可以调高大鼠脑创伤后损伤周围区的血管生成标志物的表达和神经元标志物的表达。BM-MSCs移植组大鼠脑损伤后神经功能较对照组改善明显。     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞的定向诱导分化

骨髓由非贴壁的造血细胞和贴壁的基质细胞部分组成.这些贴壁的基质细胞部分包括多能间充质干细胞和分化的骨髓间充质基质细胞.间充质干细胞(mesenchymal stemce lls,MSCs)系统依靠增殖来自我更新,但是能够保持其干细胞的表型而引起成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、成纤维细胞的分化[1].     

兔骨髓间充质干细胞向神经元的诱导分化

目的 :探讨兔骨髓间充质干细胞 (bonemarrowmesenchymalstemcells ,BM -MSCs)向神经元定向诱导分化及分化前后体外培养的条件。方法 :无菌条件下收集兔股骨骨髓 ,用相对密度为 1 0 77的淋巴细胞分离液分离出白膜层细胞群 ,贴壁法筛检其中的MSCs ,用DMEM H条件培养基进行原代及传代培养。分别取 5和 10代的MSCs向神经元定向诱导。诱导后更换为神经培养基继续培养 ,并在 1～ 2 0d用免疫细胞化学方法检测分化细胞的特异性表面标志。结果 :兔骨髓MSCs在DMEM H条件培养基中建立高纯度的细胞培养 ,能够稳定地连续传代达 10代以上。不同代数的MSCs诱导后均表达巢蛋白 (nestin)和神经特异性烯醇化酶 (neuron specificenolase ,NSE)。诱导后NSCs在神经培养基中继续存活 2 0d以上 ,但未见扩增。结论 :兔骨髓MSCs能够诱导表达神经元特异性标志 ,且诱导前后的MSCs均可在体外培养条件下存活。