新型聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架的细胞相容性研究

目的研究骨髓基质干细胞(BMSCs)与该聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)类支架的细胞相容性及体外粘附情况,为制备负载多种细胞因子的PLGA类支架提供研究基础。方法抽取新西兰兔骨髓,用全骨髓培养法获取单核细胞,经条件培养液体外诱导、扩增。设立空白BMSCs组和具有良好细胞相容性的β-磷酸三钙(β-TCP)为对照组。BMSCs以1×106/mL浓度接种于PLGA和β-TCP上,通过倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞生长及细胞与材料的附着情况。以MTT实验、流式细胞仪等手段检测各组细胞增殖和细胞周期变化情况。结果BMSCs可较好粘附于PLGA支架上,且该PLGA类支架对细胞增殖、生长周期无明显影响。结论该PLGA类支架的细胞相容性较好,并可进一步作为多种细胞因子载体构建缓释型支架,从而用于骨组织工程。     

荧光活性染料DiI标记观察人骨髓基质干细胞与部分脱钙骨粘附的实验研究

目的通过荧光活性染料DiI标记观察骨髓基质干细胞在部分脱钙骨上的粘附。方法用DiI标记人骨髓基质干细胞,接种于部分脱钙骨上,测定细胞的粘附率。于接种后第2、4、7天激光共聚焦显微镜观察细胞在支架材料上的生长状况。结果DiI标记的骨髓基质干细胞的粘附率为(99.9±0.2)%,未标记的骨髓基质干细胞粘附率为(99.1±1)%,两者无统计学差异(P>0.05);第7天时细胞脱钙骨内孔覆盖。结论荧光活性染料DiI标记不影响骨髓基质干细胞在部分脱钙骨支架上的粘附,是观察骨髓基质干细胞在脱钙骨支架上粘附状况的较好方法。     

壳聚糖支架材料与骨髓基质细胞相容性的实验研究

目的 初步探讨壳聚糖支架材料与骨髓基质细胞的生物相容性.方法 壳聚糖制成疏松多孔海绵状支架材料,采用体外复合细胞培养技术,将骨髓基质细胞在壳聚糖支架材料中培养,通过噻唑蓝比色(MTT)法检测细胞增殖情况及碱性磷酸酶活性的检测,观察支架材料对培养细胞的影响.结果 骨髓基质细胞在壳聚糖支架材料中生长良好,细胞增殖和碱性磷酸酶活性在细胞组与支架-细胞组中差异无统计学意义(P＞0.05),表明壳聚糖支架材料对骨髓基质细胞的增殖、分化及分泌功能均无明显影响.结论 壳聚糖支架材料与骨髓基质细胞的生物相容性好,有作为骨组织工程载体材料的应用前景.     

新型多孔PLGA/HA复合支架体外细胞相容性的实验研究

目的研究新型多孔聚乳酸乙醇酸／羟基磷灰石（PLGA/HA）支架材料的体外细胞相容性。方法采用贴壁法对兔骨髓基质细胞（BMSCs）进行体外矿化诱导培养，扩增后与实验A组（含5％HA的PLGA／HA），实验B组（含10％HA的PLGA／HA）及对照C组（仅含PLGA）分别进行体外复合培养；并通过定性及定量法检测BMSCs在材料表面的粘附能力、增殖活力，验证细胞材料复合体的成骨活性。比较分析各组之间的差异。结果兔BMSCs在每组材料的表面均能生长，经体外诱导后在支架材料的表面形成钙结节，A、B组细胞的粘附及增殖能力均强于C组（P〈0．05），A、B组之间无差异。结论兔BMSCs与新型多孔PLGA／HA支架材料有良好的相容性。     

天然羟基磷灰石/壳聚糖复合材料细胞相容性研究

目的：评价天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料（nature hydroxyaptite／chitosan composite，NHC）的细胞相容性。方法：人骨髓间充质干细胞诱导法培养成骨细胞，并鉴定。将材料与细胞体外进行复合培养，应用细胞增殖度，碱性磷酸酶和扫描电镜等对其细胞相容性进行评定。结果：骨髓间充质干细胞诱导的成骨细胞在复合材料表面粘附，生长良好，细胞增殖度无显著性差异（P〉0．05），材料组与对照组之间碱性磷酸酶无显著性差异（P〉0．105），扫描电镜观察发现24h后细胞生长良好，细胞连接紧密，有细胞外基质生成。说明本复合材料具有良好的细胞相容性。结论：NHC具有较良好的体外细胞相容性。     

自制脱蛋白骨与骨髓基质细胞的生物相容性研究

目的 探讨表面脱钙的脱蛋白异体骨与骨髓基质细胞的生物柑容性，为骨组织工程提供合适的支架材料。方法 用经物理与化学方法处理而制得的脱蛋白骨与骨髓基质细胞（MSCs)复合培养，进行形态学观察、细胞增殖、ALP的活性、骨钙素的分泌与蛋白质含量检测；扫描电镜观察细胞在脱蛋白骨材料上的情况。结果 骨髓基质细胞能在脱蛋白骨上贴附、增殖，其生长及功能不受影响。结论 本方法所制的脱蛋白骨与MSCs具有良好的生物相容性，可作为MSCs的载体应用于骨组织工程。     

利用人骨髓基质干细胞异位构建组织工程化骨的实验研究

目的 探讨以人骨髓基质干细胞为种子细胞、以部分脱钙骨为支架材料在体内构建组织工程化骨的可行性及其成骨机制。方法 培养、扩增人骨髓基质干细胞，将第4代hBMSCs接种于部分脱钙骨支架上，通过扫描电镜观察其生长和粘附情况，并测量粘附率。于裸鼠皮下植入人骨髓基质干细胞和部分脱钙骨复合物，以无细胞部分脱钙骨作对照。8及12周取材观察。结果 8及12周复合物植入组均见新骨形成，多数骨小梁表面衬有一层成骨细胞样细胞，提示可能存在膜内成骨。单纯部分脱钙骨植入组未见新骨形成。结论 人骨髓基质干细胞与部分脱钙骨复合可以在体内构建组织工程化骨；其成骨机制可能为膜内成骨。     

新型聚β-羟基丁酯作为血管组织工程支架材料的实验研究

目的：探讨经改性处理后的可降解生物材料聚β-羟基丁酯(PHB)作为血管组织工程支架材料与血管平滑肌细胞的细胞相容性。方法：采用体外培养的免血管平滑肌细胞接种在经胶原包埋处理后的管型PHB支架材料上，用相差显微镜和扫描电镜观察细胞的粘附和生长情况，并行HE染色观察。结果：免血管平滑肌细胞在改性后的管型PHB支架材料上粘附生长良好，扫描电镜下可见细胞生长融合成片状，HE染色示细胞在PHB材料上生长良好。结论：改性后的聚β-羟基丁酯材料与兔血管平滑肌细胞有较好的生物相容性。     

兔血管平滑肌细胞和聚羟基丁酯(PHB)的细胞相容性实验研究

目的：探索血管平滑肌细胞和新型可降解材料聚羟基丁酯（PHB）的细胞相容性，为组织工程血管的构建寻找理想的支架材料。方法：将组织块法体上培养与兔血管平滑肌细胞种植在PHB膜片和PHB三维微孔支架上，在相差显微镜下观察细胞的粘附和生长情况。用MTT法测定细胞粘附率和细胞增殖指数，复合培养7天后进行扫描电镜观察并用流式细胞仪（FCM）的测定细胞周期，DNA指数。结果：兔血管平滑肌细胞在PHB膜片上粘附率为77％，细胞增殖符合细胞的生长曲线，在PHB三维微孔支架上生长情况良好，并被证实为二倍体细胞。结论：兔血管平滑肌细胞和聚羟基丁酯（PHB）的细胞相容性较好，但细胞与材料间的粘附有待进一步改善。     

兔骨髓基质细胞体外成骨分化鉴定及与煅烧骨复合培养的实验研究

目的研究兔骨髓基质细胞体外向成骨细胞分化的生物学特性及其与牛煅烧骨体外复合培养的生物相容性.方法将体外培养1周的兔骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化,于1、2、4周时提取RNA,采用RT-PCR技术检测ALP和I型胶原mRNA表达,并对培养2周的细胞行VonKossa染色观察钙结节形成;另制备细胞-煅烧骨复合物,继续培养1、7、14 d后取出,扫描电镜观察及X射线衍射仪检测.结果体外诱导培养2、4周后,兔骨髓基质细胞成功表达ALT和I型胶原,VonKossa染色可见钙结节形成.扫描电镜及X射线衍射分析证实细胞在煅烧骨表面大量贴附成活,14 d后细胞铺满支架表面,合成并分泌胶原纤维及钙盐.结论兔骨髓基质细胞体外可成功向成骨细胞诱导分化,成骨特性表达佳;与牛煅烧骨体外复合培养显示良好的生物相容性.     

双相磷酸钙组织工程骨块重建股骨头内骨缺损的实验研究

目的 观察在体外构建的具有仿生结构的双相磷酸钙（biphasic calcium phosphate，BCP）组织工程骨块植入犬股骨头缺损内的骨再生情况及预防股骨头塌陷的效果。方法 以犬股骨头的松质骨样本Micro—CT（micro—computed tomography）图像为基础，提取其中的图像信息，利用三维凝胶叠层成形法制备出具有仿骨小梁结构的陶瓷支架。在体外利用诱导分化的自体骨髓间充质细胞与仿生BCP支架复合，构建组织工程骨块，将其植入10只犬的股骨头负重区骨缺损内；另取10只火作为对照组，在股骨头骨缺损区内打球植入自体松质骨粒，对比观察仿生BCP骨块的植入效果。结果 制备出的股骨头仿生BCP支架具有良好的三维空间结构，支架小梁具有一定的方向性，呈板状模型；细胞在支架表面大量生长。植入动物体内30周后，实验组火股骨头外形基本完整，新生骨质包绕支架小梁并沿支架表面生长，而对照组犬股坩头均出现不同程度的塌陷。结论 仿生BCP组织工程骨块具有良好的生物相容性，植入犬股骨头负曩区骨缺损后，能在一定程度上防止股骨头塌陷。     

新型多孔双相磷酸钙支架与兔骨髓间充质干细胞相容性的体外实验研究

目的：研究新型多孔双相磷酸钙支架与兔骨髓间充质干细胞的体外相容性。方法：体外分离、扩增兔骨髓间充质干细胞。取传二代细胞,按照经典组织工程构建方法,分别接种双相磷酸钙（对照组）和双相磷酸钙复合纳米羟基磷灰石（实验组）支架。单纯细胞培养为空白对照组。体外成骨诱导培养14天。倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞生长情况;MTT法检测细胞增殖功能;碱性磷酸酶（ALP）检测细胞成骨分化功能。结果：细胞在新型支架上吸附、生长良好。各组MTT及ALP值随培养时间延长而增大。培养各时段实验组均高于其他两组,差别有统计学意义（P〈0.01）。结论：新型BCP支架与兔BMSC在体外具有良好的相容性,二者具有体外构建工程骨的潜力。     

新型多孔PLGA/HA复合支架体外细胞相容性的实验研究

目的研究新型多孔聚乳酸乙醇酸/羟基磷灰石(PLGA/HA)支架材料的体外细胞相容性。方法采用贴壁法对兔骨髓基质细胞(BMSCs)进行体外矿化诱导培养,扩增后与实验A组(含5%HA的PLGA/HA),实验B组(含10%HA的PLGA/HA)及对照C组(仅含PLGA)分别进行体外复合培养;并通过定性及定量法检测BMSCs在材料表面的粘附能力、增殖活力,验证细胞材料复合体的成骨活性。比较分析各组之间的差异。结果兔BMSCs在每组材料的表面均能生长,经体外诱导后在支架材料的表面形成钙结节,A、B组细胞的粘附及增殖能力均强于C组(P<0.05),A、B组之间无差异。结论兔BMSCs与新型多孔PLGA/HA支架材料有良好的相容性。     

以软骨细胞外基质与脱细胞骨基质构建组织工程骨软骨双层支架及其性能的研究

目的 探讨采用软骨细胞外基质(CECM)与脱细胞骨基质(ACBM)为材料制作新型组织工程骨软骨双层支架的可行性,并检测其性能.方法 双层支架的骨部分以犬松质骨制备的ACBM为原料,软骨部分以人CECM为材料,采用冷冻冻干法制备CECM/ACBM双层支架并交联.测定支架孔隙率,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法分析支架浸提液毒性.分离培养犬骨髓基质干细胞(BMSCs),成软骨诱导后种植到支架上,倒置显微镜、电镜、Dead/Live荧光染色观察细胞在支架的生长、分化情况.结果 扫描电镜及Micro-CT观察显示支架内孔洞相互贯通呈海绵状,CECM部分孔径(155±34)μm,孔隙率为91.3%±2.0%;ACBM部分具有大然骨的孔径和空隙率,骨软骨部分结合良好.培养1～6 d不同浓度支架浸提液与对照培养液吸光度值比较羌异均无统计学意义(P＞0.05).倒置显微镜、电镜检查结果表明BMSCs在支架上黏附良好,细胞基质分泌增加,Dead/Live荧光染色表明双层支架内细胞均呈绿色.结论 CECM/ACBM骨软骨双层支架具备良好的孔径和孔隙率,骨、软骨两层间结合良好,无毒,生物相容性良好,可作为支架载体用于组织工程骨软骨复合体的构建.

Abstract：

Objective To fabricate a novel bilayered scaffold constructed with cartilage extracellular matrix (CECM) and acellular bone matrix (ACBM) for osteochondral tissue engineering.Methods The bone layer of the osteochondral scaffold was prepared using canine bone cancellous bone columns, and the cartilage layer was fabricated using CECM.After CECM microfilaments were decellularized, the biphasic scaffolds were fabricated by soaking the ACBM columns into cylindrical silicon moulds with a 30 g/L CECM suspension using simple freeze-drying method.After the scaffolds were cross-linked, the porosity was measureed.MTT test was also done to assess cytotoxicity of the scaffolds.Canine bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) were induced by chondrogenic medium and seeded into novel scaffold.Cell proliferation and differentiation were analyzed using inverted microscopy, scanning electron microscopy (SEM)and Dead/Live staining method.Results SEM and Micro-CT revealed a 3-D interconnected porous structure, with the CECM pore diameter of 155 ± 34 μm and the porosity of 91.3% ± 2.0%.Cytotoxicity testing with MTT revealed no significant difference in absorbance among different extracts, showing no cytotoxic effect of the scaffold on BMSCs.Inverted microscopy and SEM showed that the novel scaffold could provide a suitable 3-D environment to support the adhesion, proliferation and differentiation of BMSCs to chondroeytes in culture with chondrogenic medium.Confocal microscopy of cell-scaffold constructs revealed cells with green fluorescence.Conclusion Since the novel CECM/ACBM bilayered integrated osteochondral scaffold has good mircostructure, non-toxicity and good biocompatibility, it may be a suitable candidate as an alternative cell-carrier for osteochondral tissue engineering.     

磷酸钙人工骨结合骨髓基质干细胞移植修复骨缺损的实验研究

目的制备磷酸钙人工骨(calcium phosphats artifieal bone, CPC)与骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)复合物，通过动物实验研究其对骨缺损的修复作用。方法分离、扩增兔的BMSCs，并以CPC为载体制备cPc／BMSCs复合物，植入兔桡骨15mm骨缺损处。于术后不同时间处死动物，通过X线摄片、组织学染色分析和放射性核素监测，观察新骨形成和材料降解情况。同时以单纯的CPC及空白对照组作为对照研究，评价CPC／BMSCs复合物对骨缺损的修复能力。结果CPC／BMSCs复合物可再生新骨组织并完好地修复桡骨缺损，且其修复能力明显优于单纯的CPC。结论以CPC为载体的自体骨髓细胞移植能有效的修复骨缺损。     

小肠粘膜下层的制备及细胞相容性的实验研究

目的了解猪小肠粘膜下层(SIS)的细胞相容性,探讨用SIS为生长载体复合骨髓基质干细胞(BMSCs)构筑组织工程骨的可能性。方法用物理和化学方法处理猪小肠粘膜下层,将兔骨髓基质干细胞与SIS进行体外复合培养,分别进行组织学、相差显微镜和扫描电镜观察。结果经物理和化学处理的SIS纯度高,孔隙多,胶原纤维未受损;BMSCs在SIS材料上生长、粘附、增殖,并能长入材料的孔隙内,分泌大量的细胞外基质成分。结论SIS的细胞相容性良好,不影响BMSCs的形态,对细胞生长和功能表达无抑制作用,可以用作骨组织工程的支架材料。     

3D打印胶原/羟基磷灰石支架对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用研究

目的探讨3D打印胶原/羟基磷灰石支架对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用。 方法分离SPF级雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞,实验分为：对照组、浸提组、诱导组及浸提诱导组,MTT法检测对照组,浸提组的细胞增殖情况,对比分析各组细胞的碱性磷酸酶（ALP）活性,对各组细胞诱导培养17天后进行茜素红染色,观察钙结节染色情况。 结果MTT结果显示,浸提组与对照组在不同时间点的OD值比较,差异无统计学意义（P>0.05）,ALP活性结果显示,不同时间点各组与对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.05）;不同时间点浸提诱导组与浸提组相比,差异均有统计学意义（P<0.05）;诱导组在48 h及72 h与浸提组相比,差异均有统计学意义（P<0.05）。茜素红染色结果显示,对照组细胞无钙结节点,浸提组及诱导组镜下肉眼可明显观察到红色区域染色,镜下观察可见钙结节点,浸提诱导组所产生的钙结节点的数量、大小以及染色的颜色深度均明显优于其他各组。 结论3D打印胶原/羟基磷灰石支架具有生物相容性好,可促进BMSCs向成骨分化,对细胞毒性低等特点,适宜用作骨缺损的治疗。     

Cellular compatibility of improved scaffold material with deproteinized heterogeneous bone

Objective： To study cellular compatibility of improved scaffold material with deproteinized heterogeneous bone and provide experimental basis on choosing the scaffold material in bone tissue engineering. Methods： Bone marrow stromal cells （BMSC） were co-cultured with heterogeneous deproteinized bone in vitro. The contrast phase microscope, scanning electron microscope, MTT assay, flow cytometry were performed and the BGP content and ALP activities were detected in order to observe the cell growth, adhesion in the material, cell cycle and cell viability. Results. The scaffold material of deproteinized heterogeneous bone had no inhibitory effect on cellular proliferation, differentiation and secretion function of BMSCs. Conclusions ： The established heterogeneous deproteinized bone has good biocompatibility with BMSCs and is a potentially ideal scaffold material for bone tissue engineering.     

骨髓间充质细胞与速固化磷酸钙支架共培养的实验研究

[目的]观察人骨髓间充质干细胞在速固化磷酸钙骨水泥支架中的增殖和生长情况。[方法]将速固化壳聚糖-磷酸钙骨水泥支架材料预先成形。采用全骨髓法分离人骨髓间充质细胞并在体外对细胞进行培养和扩增。72h首次换液,细胞融合80%传代,取第3代细胞用于实验。将细胞与磷酸钙骨水泥支架复合培养,分别利用四甲基偶氮唑蓝MTT法及扫描电镜等检测细胞在材料中的增殖和生长情况。[结果]用酶标仪检测OD值提示共培养后,支架内的细胞数量逐渐增加。扫描电镜结果显示支架材料内部为多孔结构,孔内见有细胞生长,细胞表面可见分泌颗粒。[结论]速固化壳聚糖-磷酸钙骨水泥对人骨髓间充质干细胞有较好的细胞相容性,细胞可在材料内黏附和增殖,是理想的骨组织工程支架材料。     

改良复合磷酸钙骨水泥诱导分化成骨作用的体外研究

目的 通过体外实验观察兔骨髓基质干细胞(BMSCs)与改良复合磷酸钙骨水泥(BCPC)共培养的生物相容性及诱导成骨活性,探讨其可能的机制.方法 配制相同大小规格的BCPC及普通磷酸钙骨水泥(CPC)块,实验分为4组:空白对照组(不加载体)、普通CPC组、BCPC组、加BMP组(加BMP的BCPC).将各组材料与兔BMSCs复合培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况,进行细胞计数,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞合成ALP活性变化,扫描电镜观察细胞在材料表面的生长及长入情况,real-time PCR检测成骨及成软骨相关基因mRNA表达情况并比较表达差别.结果 复合培养后倒置显微镜观察各组细胞与载体边缘接触良好,各组细胞增殖差异无统计学意义(P＞0.05);扫描电镜观察细胞在BCPC表面生长增殖良好,逐渐伸出伪足并长入材料孔隙;复合培养7 d后,BCPC组及加BMP组比CPC组和空白对照组表达更高的ALP活性,差异有统计学意义(P＜0.05);复合培养第10天,BCPC组及加BMP组分别与CPC组及空白对照组比较,其成骨及成软骨相关基因mRNA表达差异有统计学意义(P＜0.05).结论 配制的BCPC具有良好的生物相容性和一定的成骨诱导能力,其疏松的结构及更大的孔径适宜细胞长入材料内部.