β—L—2‘,3’—双脱氧—5—氟胞苷在体外对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

目的：研究β－Ｌ－２＇，３＇－双脱氧－５－氟胞苷的抗乙型肝炎病毒作用。方法：从２．２．１５细胞培养液中提取乙肝病毒ＤＮＡ，用ＤＮＡ印迹法分别药物对乙肝病毒ＤＮＡ复制的影响。观察药物对人Ｔ－成淋巴样细胞的生长抑制作用，用狭线印迹法检测人Ｔ－成淋巴样细胞的线粒体ＤＮＡ。结果：β－Ｌ－２＇，３＇－双脱氧－５－氟胞苷对乙肝病毒ＤＮＡ合成的半数抑制浓度为０．０５μｍｏｌ／Ｌ，但其抗乙肝病毒作用是可逆的。对人     

2＇-氟代核苷酸类衍生物的合成

目的合成2’-氟代核苷酸类衍生物,包括尿苷、胞苷与腺苷类衍生物。方法将1,3,5-三苯甲酰-β—D-2-脱氧-2-氟代阿拉伯糖溴化3,5-三苯甲酰-β—D-2-脱氧-2氟代-1溴代阿拉伯糖生成分别与硅醚化的尿嘧啶、胞嘧啶以及腺嘌呤发生氮烷基化反应生成对应的3,5-0-二苯甲酰-2-脱氧-2-氟代尿苷、胞苷、以及腺苷。再将3,5—0-二苯甲酰-2-脱氧-2-氟代尿苷经过水解生成2-脱氧-2-氟代-尿苷,再经醚化反应生成5-二对甲氧基三苯甲基-2-脱氧-2-氟代-尿苷。将3,5-0-二苯甲酰-2-脱氧-2-氟代胞苷经过N-乙酰化生成3,5-二苯甲酰-2-脱氧-2-氟代-N-乙酰化胞苷,再经水解生成2-脱氧-2-氟代-N-乙酰化胞苷。结果成功合成出5-二对甲氧基三苯甲基-2-脱氧-2-氟代-尿苷、2-脱氧-2-氟代-N-乙酰化胞苷和3,5-。-二苯甲酰-2-脱氧-2-氟代腺苷。结论通过1,3,5-三苯甲酰-β—D-2-脱氧-2-氟代阿拉伯糖的溴代以及其产物与硅醚化的尿嘧啶、胞嘧啶和乌嘌呤的氮烷基化反应,可生成3,5-0-二苯甲酰-2-脱氧-2-氟代尿苷、胞苷、以及腺苷,再各自通过水解、醚化;N-乙酰化,水解等步骤可得到目标化合物。     

脱氧胆酸对HBV复制及肝癌细胞自噬影响的研究

目的 观察脱氧胆酸(deoxycholic acid, DCA)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)复制的影响，及其对肝癌细胞自噬的影响程度，探讨其可能的作用机制。方法 观察不同浓度DCA对HepG2及HepG2.215细胞活性的影响，进而测定不同浓度DCA对HepG2.215细胞HBV DNA的载量及HBsAg、HBeAg和HBcAg表达水平的影响，蛋白免疫印迹检测自噬水平；将HepG2.215细胞转染乙型肝炎病毒X(HBX)蛋白突变表达质粒后，观察HBX对DCA处理的HepG2及HepG2.215细胞的HBV DNA载量以及HBsAg、HBeAg和HBcAg表达水平的影响，蛋白免疫印迹检测细胞自噬水平。结果 (1)CCK-8实验结果显示随着DCA浓度的升高，细胞活力均呈现梯度下降趋势(P<0.01);(2)HepG2.215细胞的HBV DNA载量以及HBsAg、HBeAg、HBcAg水平均随着DCA浓度的提高而上升(P<0.01);(3)HepG2与HepG2.215细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高(P<0.01),HepG2细胞的...     

α-鹅膏毒肽对2.2.15细胞乙肝病毒HBsAg和HBeAg分泌的影响

目的 观察α-鹕膏毒肽(α-Amallitin)对HepG2 2.2.15细胞(2.2.15细胞)乙肝病毒(HBV)HBsAg和HBeAg分泌的影响.方法 用不同浓度的α-鹅膏毒肽作用2.2.15细胞,用MTT法检测细胞毒性,时间分辨免疫荧光法(TRFIA)测定上清HBsAg和HBeAg浓度.结果 α-鹅膏毒肽在0.006～0.800μg/mL时,对HepG2 2.2.15细胞无明显毒性作用.当浓度达到4.000～20.000μg/mL时毒性较明显,TC50为10.190μg/mL;其对上清液HBsAg和HBeAg的抑制随浓度的增加而加强,其半数抑制浓度分别为0.495μg/mL和0.346μg/mL.结论 在无毒或低毒浓度下α-Amanitin能抑制2.2.15细胞株HBsAg和HBeAg的分泌,可能与α-Amanitin抑制HBV DNA的复制有关.     

MXA蛋白抑制HBV复制的体外研究

目的 研究MXA蛋白抑制HBV复制的活性.方法 将pcDNA3.1-MXA重组质粒和PU19-1.24 HBV重组质粒分别按1:1、2:1共转染HepG2细胞(MXA组),对照组使用空pcDNA3.1、Salon DNA和PU19-1.24 HBV重组质粒共转染,3 d后Western blot检测MXA蛋白表达,Abbott法检测细胞上清HBeAg和HBsAg分泌量,定量PCR检测上清和胞内HBV DNA水平,统计学分析结果 .pcDNA3.1-MXA与PU19-1.24HBV重组质粒共转染HepG2细胞,对照组为pcDNA3.1-MXA重组质粒、PU19空质粒和Salon DNA共转染,3 d后裂解细胞Western blot检测MXA蛋白表达.结果 Western blot显示MXA组有MXA蛋白表达;与对照组相比,pcDNA3.1-MXA和PU19-1.24 HBV重组质粒按1:1转染时,MXA组HBeAg下降27%,上清HBV DNA和细胞内HBV DNA分别下降1个log值和0.6个log值;按2:1比例转染时MXA组HBeAg较对照组下降66%,上清HBV DNA和细胞内HBV DNA水平分别下降1.9个和1.7个log值,差异均具有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测显示MXA蛋白抑制HBV组与对照组MXA蛋白表达没有明显差别.结论 MXA蛋白在HepG2细胞具有抑制HBV复制活性,抑制活性与蛋白的表达量相关;在抑制HBV复制过程中MXA蛋白自身可能不发生降解.     

吉西他滨致急性肺水肿1例护理体会

吉西他滨是阿糖胞苷类抗代谢抗癌药物。其在体内被转化为双氟脱氧三磷酸胞苷掺人DNA使DNA断裂，从而起到细胞毒作用，为细胞周期特异性药物，主要作用于S期（DNA合成期）和G1期（细胞有丝分裂的第一间歇期），由于其还能抑制脱氧胞嘧啶脱氧酶，减少细胞内代谢药物降解，具有细胞内浓度白增强作用，因而对多种实体瘤有效。     

免疫荧光双标记技术检测胎盘HBsAg-抗-HBs复合物

目的：探讨乙肝病毒（HBV）以保种形式感染胎盘滋养层细胞。方法：通过免疫荧光双标记技术检测12例血清HBsAg阳性母亲的胎盘滋养层细胞HBsAg-抗-HBs复合物。结果：血清学HBsAg阳性母亲胎盘滋养层细胞中存在HBsAg-抗-HBs复合物。结论：提示HBV可能通过HBsAg与抗-HBs结合成复合物的方式进入胞内，导致胎盘屏障的第一层细胞受到HBV感染。     

靶向HBVX基因的shRNA表达质粒对HBV复制的抑制作用

目的 观察靶向HBVX基因的RNA干扰(RNAi)对HBV复制的抑制作用.方法 选择HBV基因组X区的Nt1681-1708作为靶序列,合成相应的正、反义寡核苷酸,退火后形成双链,克隆入shRNA表达质粒,将得到的质粒与HBV质粒共转染HepG2细胞,观察HepG2细胞中HBsAg、HBeAg、HBV DNA和pgRNA的受抑制情况.结果 HBsAg、HBeAg的表达、HBV DNA和pgRNA的拷贝数均明显受到抑制.结论 所选靶区通过RNAi可有效抑制HBV复制.     

玉屏风散对紫外线致人皮肤成纤维细胞光老化的防护作用

目的研究玉屏风散对人皮肤成纤维细胞光老化的保护作用及其作用机制。方法紫外线(UVA+UVB)照射人皮肤成纤维细胞,建立光老化模型,使用三种不同浓度的玉屏风散含药血清进行干预,通过β-半乳糖苷酶染色法检测细胞的衰老情况,ELISA法检测细胞DNA总体甲基化水平,透射电镜观察细胞超微结构的变化。结果与正常组相比,模型组细胞β-半乳糖苷酶染色结果阳性率明显上升,DNA总体甲基化水平降低,细胞形态发生明显改变,胞浆中可见大量空泡形成,线粒体显著肿胀变形,形态不规则。经玉屏风散干预后,人皮肤成纤维细胞的衰老程度有所减轻,β-半乳糖苷酶染色结果细胞阳性率明显下降,细胞的DNA总体甲基化水平有所升高,对成纤维细胞内细胞器尤其是线粒体的破坏明显减轻,细胞形态也有明显的改善。结论玉屏风散可能通过调控细胞DNA总体甲基化水平,保护细胞的形态,进而对于人皮肤成纤维细胞的光老化具有防护作用,其中又以大剂量玉屏风散的抗衰效果为佳。     

吉西他滨在非小细胞肺癌中的应用及其放射增敏研究

吉西他滨-2’-脱氧-2’，2’-二氟胞苷盐酸盐(β异构体)是一种新型的脱氧胞苷类似物，属嘧啶类抗代谢药物。分子量为299．66，分子式为C9H11F2N3O4。结构与阿糖胞苷相似，不同之处在于吉西他滨脱氧胞苷胞嘧啶糖环第2碳上的2个氢原子被2个氟原子取代。     

乙型肝炎病毒YVDD和YIDD变异株的构建

WHO估计全世界乙肝病毒感染为3．5亿。中国感染总人数1．2亿。因为乙肝病毒感染易慢性化，可引起肝硬化甚至肝癌。因此人们在不断探索新的治疗方法以改善HBV感染的预后。拉米夫定等核苷类药物抗HBV治疗是继干扰素后一种新的抗HBV疗法。现在临床已广泛使用。治疗有效者HBV复制可受到很大程度的抑制。血清转氨酶稳定。临床症状明显改善。但长期服用可使HBVP区聚合酶基因发生变异。由野生型YMDD变异成YVDD或YIDD型。从而产生抗药性，HBV DNA阳性。因此笔者构建HBV YVDD和YIDD变异株。为建立拉米夫定耐药模型。筛选抗乙肝病毒药物打下前期基础。     

限制性因子黏液病毒抗性蛋白Ⅱ对乙型肝炎病毒复制的影响

目的 研究干扰素α(IFNα)对限制性因子黏液病毒抗性蛋白Ⅱ（MX2）的诱导作用,以及MX2对乙型肝炎病毒（HBV）复制的影响。方法 使用不同剂量的IFNα处理肝癌细胞HepG2、含有牛磺胆酸钠协同转运肽（NTCP）的HepG2细胞（简称HepG2-NTCP细胞）;采用荧光定量聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质印迹技术检测MX2在转录或翻译后的表达水平;采用DNA印迹技术及qPCR检测过表达mx2对HBVDNA和HBV前基因组RNA (pgRNA)的抑制作用;通过siRNA敲低内源性的mx2,DNA印迹技术检测其对HBV病毒复制的影响。结果 在HepG2和HepG2-NTCP细胞中,经IFNα处理后,MX2的蛋白及mRNA水平升高（P <0.05）;过表达mx2后,其HBV DNA和HBV pgRNA水平均降低（P <0.05）。结论 在HepG2、HepG2-NTCP细胞中,IFNα可诱导MX2表达上调,并且过表达MX2可抑制HBV的复制。     

衣霉素通过诱导内质网应激抑制乙型肝炎e抗原分泌

目的研究N-糖基化抑制剂衣霉素抑制乙型肝炎e抗原(HBeAg)分泌的机制,为今后探索直接抑制HBeAg分泌的高效抗HBV方法提供基础。方法观察衣霉素在HepG2.2.15细胞模型上对HBeAg分泌和内质网应激的影响;采用Western印迹比较研究衣霉素对胞质和包含内质网的非胞质中的HBeAg前体的影响。结果在HepG2.2.15细胞上,衣霉素显著减少HBeAg在培养上清中的含量,并诱导代表内质网应激的拼接xbp-1 mRNA形成。衣霉素在不显著影响胞质中HBeAg前体和β-肌动蛋白的情况下显著减少非胞质中这些蛋白的水平。结论衣霉素抑制HBeAg分泌不是糖基化抑制的直接结果,而是诱导内质网应激的效应。     

一种新型MCC-478衍生物抗乙型肝炎病毒活性及体外毒性实验

目的：研究一种具有新结构类型的MCC-478衍生物030705的抗乙肝病毒活性和体外毒性。方法：实验组以不同浓度受试化合物030705（0.01、0.03、0.10、0.30和1.0 μmol•L^-1）、对照组以不同浓度阿德福韦酯（0.10、0.30、1.0、3.0和10.0 μ mol•L^-1），分别作用于HepG2.2.15细胞，采用Southern blotting杂交法测定其对HBV DNA的抑制率，计算其50%抑制浓度（IC₅₀ ）和90%抑制浓（IC₉₀）值，采用ELISA法测定不同药物浓度受试化合物030705对HBeAg分泌的抑制率。采用MTT法测定不同浓度受试化合物030705（10、30、100、300和1 000　μmol•L^-1）对HepG2细胞毒性，计算其50%致死浓度（CC₅₀）值。采用Dot blotting法分别测定不同浓度受试化合物030705（0.10、1.0和10.0　μmol•L^-1）对HepG2细胞线粒体含量的抑制率；同时设相应浓度双脱氧胞苷（ddC）阳性药物对照组和仅加入培养基的阴性对照组。结果：受试化合物030705抑制HepG2.2.15细胞HBV DNA作用与阿德福韦酯对照组比较差异无显著性（P>0.05），显示其具有与阿德福韦酯相近的抗乙肝病毒活性。不同浓度受试化合物030705（0.01、0.03、0.10、0.30和1.0 μmol•L^-1）对HBeAg分泌的抑制率分别为5.94%、6.08%、6.32%、10.31%和12.49%，与阴性对照组比较差异均无显著性（P>0.05）。受试化合物030705对HepG2细胞毒性的CC₅₀值为2 014 μmol•L^-1(>1 000 μmol•L^-1)，属于低细胞毒性药物。阳性对照药物ddC在不同浓度下（0.10、1.0和10.0 μmol•L^-1），对HepG2细胞线粒体含量的抑制率分别为38.43%、46.51 %、56.51%，与阴性对照组比较差异均有显著性（P＜0.05）。相同浓度下受试化合物030705抑制率分别为7.00%、5.81%、5.78%，与阴性对照组比较差异均无显著性（P>0.05）。 结论：受试化合物030705对HepG2.2.15细胞HBV DNA的抑制作用与阿德福韦酯的作用相近，对HepG2细胞毒性的CC₅₀值2 014 μmol•L^-1，无明显线粒体毒性，是一种低毒、高效的新型核苷类抗乙肝病毒药物。     

体外诱导骨髓基质细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的：探讨体外诱导骨髓基质细胞向心肌细胞转化的条件。方法：分离大鼠骨髓，体外培养、传代得到骨髓基质细胞，观察不同浓度的诱导剂5-氮胞苷对骨髓基质细胞的生长和诱导作用，进行形态学和免疫组织化学鉴定。结果：5-氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞，在诱导后2周转化率为29％。心肌特异性肌钙蛋白T(TnT)免疫组织化学染色阳性。结论：MSCs在体外条件下经5-氮胞苷诱导可分化成心肌样细胞。     

脱氧核酶抑制乙型肝炎病毒基因表达的实验研究

目的：探讨乙型肝炎病毒(HBV)s基因和c基因特异性的脱氧核酶(DNAzyme)对HBV表面抗原(HB—sAg)和e抗原(HBeAg)表达的抑制效应。方法：设计合成针对HBVs基因ORF A^157UG、e基因ORF A^1816UG的DNAzyme DrzBS、DrzBC，在2.2．15细胞上观察其对HBVs基因、c基因的表达抑制效应。结果：DrzBS、DrzBC作用于2．2．15细胞后，可显著抑制HBVs基因、c基因的表达，有效浓度为0．1—2．5μmol／L并呈剂量依赖性，最高抑制率分别为94．2％和91．8％；有效抑制持续时间可达72h，DrzBS、DrzBC在细胞内对HbeAg、HbeAg表达的抑制效率，明显高于作为对照的反义寡核苷酸AsBS、AsBC，有效浓度较后者低至少l0倍。其对2．2．15细胞的HBVDNA复制无明显影响，亦未见明显的细胞毒性作用。结论：在2．2．15HBV细胞模型系统，DrzBS、DrzBC能高效阻断HBVs基因、e基因的表达，是一种特异性的、高效的抗HBV基因治疗剂。     

含临床病毒株聚合酶逆转录酶区的乙肝病毒DNA稳定复制细胞系的构建

目的构建含有临床病毒株聚合酶逆转录酶(RT)区的乙肝病毒(HBV)DNA稳定复制细胞系。方法采用巢式PCR从患者血清扩增HBV DNA片段,利用片段置换反应将该片段克隆到HBV DNA复制载体,并在该载体上引入新霉素抗性基因,在确认该重组DNA体外可复制后,将其转染HepG2细胞,G418筛选,采用real-time PCR结合ELISA及Southern blot检测初筛和鉴定HBV DNA稳定复制细胞系。结果从患者血清扩增出的HBV DNA片段nt55～1654被成功置换到HBV复制质粒pLL相应区域,得到质粒p11;新霉素抗性基因表达片段被克隆到p11中HBV DNA下游,获得质粒p11-neo,Southern blot检测证实p11-neo可支持体外复制;p11-neo转染HepG2后,经筛选鉴定,获得了可支持HBV DNA稳定复制的细胞系3-10。结论建立了含有临床病毒株聚合酶RT区的HBV DNA稳定复制细胞系,real-time PCR结合ELISA有助于HBV DNA稳定复制细胞系的快速初筛鉴定。     

连翘挥发油的成分分析及抗病毒活性的考察

目的：考察连翘挥发油及其主要成分α-蒎烯及β-蒎烯对甲、乙型流感病毒与乙肝病毒的活性。方法：①通过GC—MS分析翘挥发油的化学成分；②以2．2．15细胞为乙型肝炎病毒载体，分别测定它们抑制乙型肝炎病毒进行DNA复制和产生HBsAg、HBeAg的能力；③以MDCK（狗肾）细胞为病毒宿主，分别测定它们抑制病毒引起细胞病变的程度（CPE）。结果：①在最大无毒剂量时，即在连翘挥发油258．69μg／ml、α-蒎烯258．69μg／ml、β-蒎烯192．45μg／ml时，均无抗乙肝病毒活性；②连翘挥发油α-蒎烯、β-蒎烯的浓度分别是192．5μg/ml时，均无抗甲、乙型流感病毒活性；③连翘挥发油的主要成分是α-蒎烯及β-蒎烯，总相对含量为71．48％。结论：连翘挥发油、α-蒎烯及β-蒎烯均无抗甲、乙型流感病毒与乙肝病毒的活性。     

乙型肝炎病毒全基因在肝癌细胞中的转染与表达

目的 建立乙型肝炎病毒（HBV）复制状态模型。方法 体外连接HBV DNA获得6.4 kb的双拷贝DNA片段,然后将其插入pcDNA3载体的Eco RV位点,通过聚合酶链反应（PCR）和酶切筛选获得头尾串联双拷贝HBV全基因重组真核表达质粒,再通过脂质体介导法转染肝癌细胞。结果 通过G418筛选,对阳性克隆细胞进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western免疫印迹分析,证明已将HBV全基因重组真核表达质粒转染至肝癌细胞并获得稳定表达。结论 通过脂质体介导法将HBV全基因转染至肝癌细胞,成功建立了HBV复制状态的细胞模型。     

新型稀土杂多化合物对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

目的：研究稀土杂多化合物(PTW-6)体外抗乙型肝炎病毒（HBV）的活性。方法：MTT法检测PTW-6对Hep G2 2.2.15细胞的毒性,乙型肝炎病毒e（s）抗原诊断试剂盒检测上清液中HBeAg、HBsAg的含量,Southern blotting 法检测PTW-6对细胞内HBV DNA复制的抑制作用。荧光定量PCR分析PTW-6对细胞内HBV mRNA和上清液中HBV DNA含量的影响。结果：PTW-6对2.2.15细胞的半数中毒浓度为1590.46 mg•L^-1, PTW-6各浓度实验组对HBeAg和HBsAg的抑制率均高于对照组（P<0.05）;随着PTW-6浓度的增高,PTW-6对2.2.15细胞内外HBV DNA的抑制率增加,PTW-6对2.2.15细胞外HBV DNA和细胞内HBV mRNA半数抑制浓度分别为51.1和63.6 mg•L^-1。结论：PTW-6体外毒性较低, 且对HBV复制有较好的抑制作用。