胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞的研究进展

<正>胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)是一类源于囊胚时期内细胞团的特定细胞群,是具有分化为体内三个胚层来源的各种类型组织细胞潜能的全能干细胞。其基本特征是体外培养可长期保     

胚胎干细胞向胆管上皮细胞定向分化的体外实验

背景：在胚胎干细胞向肝细胞诱导分化的培养条件基础上增加向胆管上皮细胞分化的培养条件，使其向胆管上皮细胞方向分化在理论上是可行的。 目的：验证在细胞生长因子胚胎干细胞体外定向分化为胆管上皮细胞的可行性。设计：单一样本观察。 单位：中山大学附属第一医院。 材料：选用BALB／c系小鼠胚胎干细胞（BALB／c—ES）由中山大学实验动物中心建系和保存。分化生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、上皮生长因子、角化细胞生长因子均为美国Sigma公司产品，实验用抗小鼠细胞角蛋白7（CK7）和细胞角蛋白19（CK19）购自丹麦DAKO公司，间接免疫荧光试剂盒为美国Biodesign产品，IX70-S8F2倒置相差荧光显微镜为日本OLYMPUS产品。 方法：实验于2004—10／2005-06在中山大学附属第一医院中心实验室完成。①将小鼠胚胎干细胞进行拟胚体分化，在培养系统中按不同时间段分别添加分化生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、上皮生长因子、角化细胞生长因子，使胚胎干细胞向胆管上皮细胞方向分化。以培养液中不添加上述细胞生长因子为对照组，使胚胎干细胞自然分化。②采用倒置相差荧光显微镜动态观察细胞生长及三维的环状结构形成情况。③于细胞分化第10天开始采用免疫细胞化学方法检测胆管上皮细胞标记物CK7、CK19，γ-谷胺酰转肽酶（GGT）表达变化，同时观察γ-谷胺酰转肽酶阳性细胞的形态学特点。 主要观察指标：①细胞生长及三维环状结构形成情况。②胆管上皮细胞标记蛋白CK7、CK19的表达。③胆管上皮细胞标记酶GGT表达及其阳性细胞形态学情况。结果：①细胞生长及三维的环状结构形成情况：胚胎干细胞悬浮培养10h后即可见小的拟胚体形成并悬浮在培养液中。分化第10天在拟胚体细胞分化群落中出现～种三维的环状结构，细胞呈同心圆层状排列，内层细胞排列紧密，继续培养，内层细胞逐渐排列疏松，分化20d左右时细胞活力达到最好，其后活力开始下降，分化36d时三维结构裂解并呈条索状悬浮于培养液中。对照组环状结构于第13天出现，细胞结构于27d裂解。②CK7，CK19表达：胆管上皮细胞环状结构形成当日即有CK7表达，分化第13天时CK19表达，其后两者同时表达于三维结构细胞中并随培养时间增加而表达逐渐增强。对照组细胞在分化第13，15天开始出现CK7，CK19表达。③胆管上皮细胞标记酶GGT表达及其阳性细胞形态学变化：加入生长因子后，细胞环状结构形成初始即表达GGT，说明此结构中含有胆管上皮细胞。在环状结构形成初始，细胞间连接紧密，不能分清单个细胞结构，随着培养时间增长，单细胞结构逐渐清晰。GGT阳性细胞呈多角型或方形排列，核位于中央，细胞器较少，胞质染色较浅，符合立方上皮细胞特点，体现出胆管上皮细胞的形态学特点。 结论：胚胎干细胞在细胞生长因子的作用下可定向分化为胆管上皮细胞并可以形成类胆管样结构。     

胚胎干细胞向心肌细胞的分化

目的：了解国内外在胚胎干细胞向心肌细胞分化的机理及其应用潜能等方面的研究现状。资料来源：应用计算机检索Medline，检索时间为1997／2005，检索词限定为“embryonic stem cell，cardiomyocyte／cardiac myocyte．differentiation”，并限定语言种类为英文。资料选择：对所检索到的文献进行初审，纳入标准：符合胚胎干细胞向心肌细胞分化的文章。排除标准：重复性研究。资料提炼：共查找文献200余篇，筛选出26篇。资料综合：收集到多篇关于胚胎干细胞分化为心肌细胞的文章，从最初获得胚胎干细胞源性心肌细胞的实验方法的建立到在单细胞水平对胚胎干细胞源性心肌细胞进行电生理研究。进一步，很多研究者从转录因子的角度研究了控制心脏发育的转录因子在胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中的表达，研究表明心脏转录因子GATA4、肌细胞增强因子2C和NKx2．5控制着心脏基因的表达，它们在心脏发生过程中发挥重要的转录调控作用。研究同时发现，钙调神经磷酸酶信号通路、MAPK信号通路以及其他信号通路参与了心肌细胞分化的调节。此外，从胚胎干细胞纯化分化的心肌细胞用于治疗心肌梗死亦是一个关键问题。结论：当胚胎干细胞以胚小体的形式在没有白血病抑制因子的条件下培养时，一些干细胞可以分化成心肌细胞。干细胞来源的心肌细胞表达一些收缩蛋白，如MHC和肌球蛋白轻链-2V。转录因子GATA4、肌细胞增强因子2C和NKx2．5在心肌细胞分化中发挥重要作用，并且可以触发特异基因如α-肌动蛋白、MHC和肌球蛋白轻链-2V的表达，然而，胚胎细胞向心肌细胞分化的分子机制还有待进一步研究，鉴别出促进心脏分化的因子是研究心脏分化的基础所在。     

胚胎干细胞诱导分化为造血细胞的研究进展

干细胞研究是生命科学中最受重视的领域之一,而胚胎干细胞分离、培养的成功和体外诱导分化为各类型组织细胞潜能的发现,使该领域的研究实现了一次革命性的突破。本文就胚胎干细胞的来源和特性,在造血细胞分化发育、基因调控研究中的应用,以及诱导分化为造血细胞的方法和重建造血功能的情况进行综述。     

人胚胎干细胞HuES17向造血干细胞的分化

背景:人类胚胎干细胞是来源于着床前囊胚的内细胞团,能在长期培养中无限增殖并保持未分化状态,且具有分化成人体组织各种细胞类型能力的细胞。目的:进一步验证人胚胎干细胞HuES17细胞株向造血干细胞分化的能力。方法:人胚胎干细胞HuES17采用与人包皮成纤维细胞二维共培养的方式培养,采用人胚胎干细胞与小鼠骨髓基质细胞(OP9)二维共培养的方法诱导胚胎干细胞向造血干细胞分化。结果与结论:人胚胎干细胞与小鼠骨髓基质细胞(OP9)二维共培养诱导造血分化的第四五天即开始出现OP9细胞逐渐老化,很快死亡;可以观察到人胚胎干细胞分化,然而,随着OP9细胞死亡,分化的人胚胎干细胞亦死亡,不能诱导人胚胎干细胞向造血干细胞分化。提示人胚胎干细胞HuES17细胞株可能不能向造血干细胞分化,或向造血干细胞分化的能力较低。     

胚胎干细胞向心肌细胞的分化

目的:了解国内外在胚胎干细胞向心肌细胞分化的机理及其应用潜能等方面的研究现状。资料来源:应用计算机检索Medline,检索时间为1997/2005,检索词限定为“embryonicstemcell,cardiomyocyte/cardiacmyocyte,differentia-tion”,并限定语言种类为英文。资料选择:对所检索到的文献进行初审,纳入标准:符合胚胎干细胞向心肌细胞分化的文章。排除标准:重复性研究。资料提炼:共查找文献200余篇,筛选出26篇。资料综合:收集到多篇关于胚胎干细胞分化为心肌细胞的文章,从最初获得胚胎干细胞源性心肌细胞的实验方法的建立到在单细胞水平对胚胎干细胞源性心肌细胞进行电生理研究。进一步,很多研究者从转录因子的角度研究了控制心脏发育的转录因子在胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中的表达,研究表明心脏转录因子GATA4、肌细胞增强因子2C和NKx2.5控制着心脏基因的表达,它们在心脏发生过程中发挥重要的转录调控作用。研究同时发现,钙调神经磷酸酶信号通路、MAPK信号通路以及其他信号通路参与了心肌细胞分化的调节。此外,从胚胎干细胞纯化分化的心肌细胞用于治疗心肌梗死亦是一个关键问题。结论:当胚胎干细胞以胚小体的形式在没有白血病抑制因子的条件下培养时,一些干细胞可以分化成心肌细胞。干细胞来源的心肌细胞表达一些收缩蛋白,如MHC和肌球蛋白轻链-2V。转录因子GATA4、肌细胞增强因子2C和NKx2.5在心肌细胞分化中发挥重要作用,并且可以触发特异基因如α-肌动蛋白、MHC和肌球蛋白轻链-2V的表达,然而,胚胎细胞向心肌细胞分化的分子机制还有待进一步研究,鉴别出促进心脏分化的因子是研究心脏分化的基础所在。     

本期专题：胚胎干细胞向心肌细胞的分化

1胚胎干细胞向心肌诱导分化及其在心脏组织工程中的应用——见2008年12卷34期6719-6722页。2胚胎干细胞梗死区中心和周边移植治疗急性心肌梗死——见2009年13卷23期4543-4547页。3悬滴三步法体外诱导小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞的分化——见2011年15卷1期92-95页。     

胚胎干细胞的体外诱导分化模型

目的：胚胎干细胞是具有全能性及无限制自我更新与分化能力的一类特殊细胞群体，通过对胚胎干细胞诱导分化研究的回顾和总结，期望能给胚胎干细胞的临床应用提供理论参考。资料来源：应用计算机检索Highwire press以及Medline数据库2000／2004期间的相关章。检索词为“Embryonic stem cell，differentiation．induce”，同时计算机检索万方数据库2000／2004期间的相关章，检索词为“胚胎干细胞”，限定章类型为中。资料选择：对资料进行初审，选取与诱导分化有关的章，纳入标准为研究原。资料提炼：选取与诱导分化有关的章共369篇(其中外364篇)。通过阅读相关献的要，从中选取15篇较全面介绍胚胎干细胞的诱导分化以及应用的章。其中，全面介绍胚胎干细胞各种细胞模型，神经细胞模型，心肌细胞模型，上皮细胞模型，造血细胞模型。资料综合：7篇献较为全面的介绍胚胎干细胞可以诱导分化为神经细胞、心肌细胞、上皮细胞以及造血细胞等细胞模型，从以上献以及单独介绍各种细胞模型的章中分别对各种细胞模型的研究概况进行归纳整理。结论：胚胎干细胞经过定向诱导分化后可获得神经细胞．心肌细胞．上皮细胞以及造血细胞等细胞模型，这些模型可以用于细胞发育分化的分子机制．并对药物筛选和临床细胞治疗提供良好应用前景．     

体外诱导胚胎干细胞向甲状腺细胞的分化

背景：胚胎干细胞来源于发育早期囊胚的内细胞团，适当条件下能在体外维持未分化状态、正常二倍体核型及无限增碹能力，且具有多向分化潜能，能够发育分化成机体3个胚层的所有类型细胞。目的：观察体外定向诱导胚胎干细胞分化为甲状腺细胞的可行性及相关分子表达检测。设计、时间及地点：以细胞为对象的观察实验，于2004-01／2006—12在中山大学附属第二医院脐血库完成。材料：孕12．5～14．5d的Balb／c孕鼠用于胚成纤维细胞饲养层的制备。E14小鼠胚胎干细胞细胞株由美国哈佛大学Dr．Xu教授惠赠。成年昆明种小鼠用于甲状腺细胞的提取。方法：将制备的鼠胚成纤维饲养层接种于E14小鼠胚胎干细胞进行扩增培养。将脱离饲养层细胞后呈稳定克隆生长的胚胎干细胞诱导发育为胚胎体，再逐步添加促甲状腺素、胰岛素、碘化钾等共培养。以培养的成年昆明种小鼠甲状腺细胞为阳性对照。主要观察指标：①观察分化过程中细胞形态的变化。②免疫荧光法检测分化细胞标记物TSHR，PAX8，TTF-2，TTF-1的表达。③RT-PCR法检测分化细胞相关基因TSHR、PAX8，NIS，TPO，Tg的表达。结果：分化细胞边界清晰，呈圆形、类圆形、梭形或多角形贴壁生长。诱导培养第6天分化细胞中有甲状腺细胞特有基因PAX8，NIS，TPO，Tg，TSHR的表达，第8天检测到分化细胞中甲状腺细胞标记物TSHR，TTF-1，PAX8，TTF-2的表达，阳性细胞形态类似对照甲状腺细胞。结论：胚眙干细胞经胚胎体发育阶段，在特定条件下可定向分化为甲状腺细胞。     

悬滴三步法体外诱导小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞的分化

背景:研究胚胎干细胞分化为心肌细胞的条件和技术,进一步提高诱导分化率、细胞纯度,具有重要的理论和临床应用意义。目的:建立体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞模型,为体外研究心肌细胞发育提供合适的实验方法。方法:采用悬滴-悬浮-贴壁三步法(悬滴三步法)对未分化的胚胎干细胞进行体外诱导分化培养,并按诱导剂的不同分为6组,Ⅰ组:丹参+5-氮杂胞苷;Ⅱ组:丹参+维甲酸;Ⅲ组:5-氮杂胞苷;Ⅳ组:丹参;Ⅴ组:维甲酸;Ⅵ组:阴性对照。诱导剂加入后9d,免疫细胞化学方法检测拟胚体α-actinin、myosin、α-actin的表达。结果与结论:诱导剂加入后第2天,倒置显微镜下见拟胚体自发性收缩,每个拟胚体可有1个或多个收缩中心。免疫细胞化学示心肌特异性结构蛋白α-actinin、myosin、α-actin均成阳性表达。Ⅰ组心肌细胞的分化率最高,与Ⅱ、Ⅵ组心肌细胞分化率比较差异有非常显著性意义(P<0.01),与Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组比较差异有显著性意义(P<0.05)。结果显示悬滴三步法联合中药丹参与5-氮杂胞苷为诱导剂,可提高体外胚胎干细胞分化为心肌细胞的分化率。     

悬滴三步法体外诱导小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞的分化

背景：研究胚胎干细胞分化为心肌细胞的条件和技术,进一步提高诱导分化率、细胞纯度,具有重要的理论和临床应用意义。目的：建立体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞模型,为体外研究心肌细胞发育提供合适的实验方法。方法：采用悬滴-悬浮-贴壁三步法（悬滴三步法）对未分化的胚胎干细胞进行体外诱导分化培养,并按诱导剂的不同分为6组,Ⅰ组：丹参＋5-氮杂胞苷;Ⅱ组：丹参＋维甲酸;Ⅲ组：5-氮杂胞苷;Ⅳ组：丹参;Ⅴ组：维甲酸;Ⅵ组：阴性对照。诱导剂加入后9d,免疫细胞化学方法检测拟胚体α-actinin、myosin、α-actin的表达。结果与结论：诱导剂加入后第2天,倒置显微镜下见拟胚体自发性收缩,每个拟胚体可有1个或多个收缩中心。免疫细胞化学示心肌特异性结构蛋白α-actinin、myosin、α-actin均成阳性表达。Ⅰ组心肌细胞的分化率最高,与Ⅱ、Ⅵ组心肌细胞分化率比较差异有非常显著性意义（P〈0.01）,与Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组比较差异有显著性意义（P〈0.05）。结果显示悬滴三步法联合中药丹参与5-氮杂胞苷为诱导剂,可提高体外胚胎干细胞分化为心肌细胞的分化率。     

骨髓干细胞体外培养诱导为心肌样细胞的研究

目的:探讨应用5-氮胞苷(5-aza)诱导体外培养人骨髓干细胞向心肌细胞分化的作用.方法:采用正常志愿者髂后上棘为穿刺点获得骨髓干细胞,体外培养传3代后应用5×10-6 mmol/L 5-aza(Sigma公司)诱导20 h后继续原条件培养,相差显微镜下观察细胞形态并照相记录.诱导后细胞行a-action Trophonin T免疫组化染色.行透射电镜观察,进一步行RT-PCR分析诱导后细胞表达a-cardiac action,Cardiac tropponin T等mRNA.结果:诱导组人a-action Trophonin T免疫组化染色阳性,电镜下观察到细胞与细胞间见类心肌闰盘样结构,见线粒体空泡及微丝样结构,PCR结果发现有a-cardiac action、Cardiac tropponin T mRNA的高表达.结论:初步证实人骨髓干细胞在体外被5-aza诱导时,能够向心肌细胞分化.     

脐血问充质干细胞体外定向诱导向心肌样细胞的转化

目的：观察脐血间充质干细胞经5一氮杂胞苷诱导在体外定向分化为心肌样细胞的形态学及分子生物学特征。方法：选取2003-05／2005-04在郧阳医学院附属十堰市太和医院妇产科患者12例，脐血来源者家属及本人知情同意。取脐静脉血50mL，分离并培养骨髓间充质干细胞，用5-氮杂胞苷定向诱导向心肌样细胞分化。每日采用相差显微镜、透射电镜观察心肌样细胞形态学变化及超微结构特征，采用RT-PCR检测心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结果：①形态学变化：5-氮杂胞苷诱导后，约1周出现短棒状或珠状结构。2周排列具有方向性，3周有肌管样结构形成。②超微结构：诱导四五周细胞内含大量线粒体，可见心房颗粒、肌丝形成。③RT-PCR检测：经5-氮杂胞苷诱导四五周骨髓间充质干细胞有心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。且心房利钠肽出现3条阳性带。结论：经5-氮杂胞苷诱导脐血间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞，是细胞移植的优良供体。     

脐血间充质干细胞体外定向诱导向心肌样细胞的转化

目的:观察脐血间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导在体外定向分化为心肌样细胞的形态学及分子生物学特征。方法:选取2003-05/2005-04在郧阳医学院附属十堰市太和医院妇产科患者12例,脐血来源者家属及本人知情同意。取脐静脉血50mL,分离并培养骨髓间充质干细胞,用5-氮杂胞苷定向诱导向心肌样细胞分化。每日采用相差显微镜、透射电镜观察心肌样细胞形态学变化及超微结构特征,采用RT-PCR检测心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结果:①形态学变化:5-氮杂胞苷诱导后,约1周出现短棒状或珠状结构,2周排列具有方向性,3周有肌管样结构形成。②超微结构:诱导四五周细胞内含大量线粒体,可见心房颗粒、肌丝形成。③RT-PCR检测:经5-氮杂胞苷诱导四五周骨髓间充质干细胞有心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。且心房利钠肽出现3条阳性带。结论:经5-氮杂胞苷诱导脐血间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞,是细胞移植的优良供体。     

5-氮胞苷体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的实验

目的:观察5-氮胞苷在体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的情况及GATA-4和Nkx2.5基因的表达,从而确定人骨髓间充质干细胞体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点。方法:实验于2005-08/2006-05在解放军沈阳军区总医院心血管外科和中国医科大学实验技术中心一部完成。取非血液疾病的5例胸科手术患者术中已切除掉的肋骨,抽取骨髓。利用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯骨髓间充质干细胞,并进行培养扩增。用流式细胞仪对第2代的骨髓间充质干细胞表面抗原进行测定。应用10μmol/L5-氮胞苷对第2代的骨髓间充质干细胞诱导24h,于诱导后1,2,3,4周,用反转录-聚合酶链反应检测GATA-4和Nkx2.5基因表达。结果:①3份第2代骨髓间充质干细胞样本重复测定,表达CD29,CD44,不表达CD34,CD45。②以5-氮胞苷诱导培养24h后,骨髓间充质干细胞形态和排列方式发生明显变化,诱导1周后,细胞体积增大,多呈长梭行,平行排列;诱导2周后,细胞变为短柱状,突起位于两端,相邻细胞的突起紧密接触;诱导3周后,短柱状细胞的突起相互连接,部分细胞可见类肌管样结构;诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构。③诱导组细胞GATA-4和Nkx2.5的聚合酶链反应产物凝胶电泳呈阳性,对照组为阴性,诱导组基因表达量均随着时间延长逐渐增加。结论:5-氮胞苷可诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化,其处于祖心肌细胞和分化的心肌细胞之间。