混合脐血成人移植定量监测植入状态的实验研究

为了定量监测和研究双份异基因脐血用于成人白血病患者移植后两份脐血的植入状态、嵌合体类型、供者细胞相对数量的动态变化及演变规律 ,采用荧光标记复合扩增短串联重复 (STR)位点嵌合体定量检测技术 ,对 1例急性髓细胞白血病成人患者移植两份 (脐血 1有核细胞数为 2 .5× 10 7/kg ,脐血 2有核细胞数为 1.5 3× 10 7/kg)HLA各 1个位点不相合的异基因脐血前后的序列血样进行 9个STR位点的检测 ;利用供、受者之间的差异位点定性判断脐血是否植入以及嵌合体类型 ;而后根据 377XLDNA测序仪上荧光扫描后两供者差异基因检出峰的峰面积计算脐血植入后患者体内两份脐血的细胞相对数量 ,定量分析供体细胞植入程度及演变规律 ;并与采用HLA差异基因对植入状态的分析结果进行对比。结果表明 :移植后 15天两份脐血同时植入 ,植入状态为完全双份供者嵌合体 ,患者体内脐血 1的相对细胞数量占 5 1.3% ,脐血 2占 4 8.7% ;30天时脐血 1嵌合体细胞上升为 70 .0 % ,脐血2嵌合体细胞下降为 30 .0 %。 5 2天时只检测到脐血 1的基因 ,植入状态转为完全单份供者嵌合体 ,有核细胞数少的一份脐血被排斥 ,有核细胞数多的一份长期植入。结论 :荧光标记复合扩增STR嵌合体定量检测可精确地描述两份脐血的植入程度及变化过程 ,为临床脐     

HLA-B位点不合两份脐血混合移植植入状态的动态观察

目的动态观察分析两份HLA不全相合异基因混合脐血移植后的植入状态.方法一例成人急性髓细胞白血病患者采用了两份HLA-B位点不全相合非血缘脐血移植(脐血1有核细胞数为2.5×107/kg,脐血2有核细胞数为1.53×107/kg),对其移植前、移植后15天、30天、52天和69天的外周血进行HLA及STR基因两种遗传学标记物的检测.采用PCR-SSP基因分型试剂盒对HLA-B位点进行差异分析,用"Profiler Plus"及"Cofiler"试剂盒检测15个STR位点,对移植前后的检测结果进行对比分析.结果 HLA及STR检测均显示移植后15天、30天基因型为完全两份脐血的嵌合型,移植后52天、69天只表达脐血1的基因型.结论两份脐血移植初期可同时植入,而后其中有核细胞数高的一份脐血可长期植入.HLA及STR基因作为植入证据为临床脐血混合应用及治疗提供了直接的实验依据.     

造血干细胞移植后植入状态的动态定量监测研究

目的 通过对造血干细胞移植后患者的短串联重复多态性序列(short tandem repeats,STR)位点进行定性和定量检测,实时动态监测供体细胞(doner cell,DC)的植入程度及嵌合体变化过程.方法 采用荧光标记多重PCR扩增技术,对36对移植前供、受者血样及移植后受者不同时间点的血样进行15个STR位点的检测,根据供、受者之间的差异位点判断DC在受者体内的植人情况,进而对患者的移植是否成功以及嵌合体类型[完全供者嵌合体(complete chimerism,CC)或混合嵌合体(mixed chimerism,MC)]进行定性判断;根据混合嵌合体中供、受者细胞的相对数量定量分析供体细胞的植入程度及演变规律.结果 36对供受体中检出有差别的STR位点为8～15个(平均为11.9个),移植后患者体内最早可检测到供者STR基因的时间为5～14 d(平均为7.56 d).动态监测结果表明36例患者中有31例形成稳定CC,STR位点由受者型向完全供者型转化的平均时间为14.17 d[(9～23)d].有5例形成MC,其中4例为持续MC,1例在移植后49 d转为CC并持续保持.结论 造血干细胞移植中,供受者STR基因位点的定性和定量检测,不仅可为临床提供判断移植是否成功的早期直接证据,且通过分析移植物的嵌合状态及其变化,有助于预警白血病的复发和原发疾病治疗.

Abstract：

Objective To monitor the transplantation level of donor-cell and the variation of the chimera at real-time, according to a qualitative and quantitative detection of the short tandem repeat (STR)loci labeling with fluorescence in the hematopoietic stem cell of transplantation patients. Methods Using multiplex polymerase chain reaction (PCR) method, we detected 15 STR loci labeling with fluorescence in blood samples of 36 donor-recipient pairs. According to the different genotypes of STR loci between donors and recipients, we qualitatively evaluated whether the donor cells were successfully transplanted and the type of chimera (mixed or completed). According to the relative quantity of donor cells and recipient cells in the mixed chimera, we quantitatively analyzed the transplantation level and the variation regularity of the donor cells. Results Eight to fifteen different STR loci were found in the 36 donor-recipient pairs (means at 11.9). The first time of the donor's STR gene which detected in the recipient was range from 5 to 14 days (means at 7.56 days). The ambulant monitoring results indicated that 31 of 36 recipients were transformed as completed chimera(CC) and the average completely transformed time of STR genotypes from recipient to donor was 14.17 days (from 9 to 23 days). Five recipients were found as mixed chimera (MC), among them, 4 recipients were found as continuous MC and the other one was transformed as continuous CC after 49 days. Conclusion In hematopoietic stem cell transplantation, qualitative and quantitative detection of STR loci in donor-recipient pairs could provide the early direct evidence to evaluate whether the donor cells are successfully transplanted. It also alarms the relapse of leukemia and the treatment of protopathy by analyzing the type and the variation of the chimera.     

短串联重复序列监测异基因造血干细胞移植后的植入状态及其演变过程

目的:监测和观察异基因造血干细胞移植后的植入状态及其演变过程。方法:于2003-01/2004-12在中国造血干细胞库深圳分库采集完成人类白细胞抗原配型的6对供受者标本。采用荧光标记复合扩增短串联重复序列检测技术,对6对供受者标本移植前后的系列血样进行D8S1179,D21S11,D18S51,D5S818,D13S317,D7S820,D3S1358,vWA,FGA共9个短串联重复序列位点和Amelogenin性别位点的检测,找出供受者间的差异基因,通过移植后不同时间段患者基因型的转变情况,判断供者细胞是否植入以及嵌合体类型。结果:供受者6对样本均获得满意的9个短串联重复序列位点和1个性别位点的分型结果。6对移植标本短串联重复序列差异基因由受者型向供者型转化的时间为14～23d。6对样本间存在明显差异。第3对、第5对在第14天已为供者完全嵌合状态,而第1对在第16天、第4对在第18天尚为供受者混合嵌合体。但6对样本都是一个从混合嵌合向完全嵌合发展的良好趋势。结论:①6对移植标本短串联重复序列差异基因由受者型向供者型转化的时间为14～23d,6对样本都有从混合嵌合向完全嵌合发展的良好趋势。②采用荧光标记复合扩增短串联重复序列方法可精确地测量聚合酶链反应产物的数量,描述造血干细胞的植入程度及植入的整个演变过程。     

系列特异性嵌合体检测在异基因造血干细胞移植中的应用

异基因造血干细胞移植（allo—SCT）后动态监测供受者嵌合状态,因其在判断allo—SCT后转归,提高移植成功率等方面的重要意义,现已成为allo—SCT后患者的常规检测项目。采用STR—PCR方法从分子遗传学上检测嵌合状态已在国内外广泛开展。而近年来开展的系列特异性嵌合体的检测,其敏感性和特异性较混合细胞检测为高,临床指导作用更强。本文就系列特异性嵌合体的检测及临床意义作一综述。     

短串联重复序列监测异基因造血干细胞移植后的植入状态及其演变过程

目的：监测和观察异基因造血干细胞移植后的植入状态及其演变过程。方法：于2003—01／2004—12在中国造血干细胞库深圳分库采集完成人类白细胞抗原配型的6对供受者标本。采用荧光标记复合扩增短串联重复序列检测技术，对6对供受者标本移植前后的系列血样进行DSS1179，1321S11，D18S51，D5S818，D13S317，D7S820，D3S1358，vWA，FGA共9个短串联重复序列位点和Amelogenin性别位点的检测，找出供受者间的差异基因，通过移植后不同时间段患者基因型的转变情况，判断供者细胞是否植入以及嵌合体类型。结果：供受者6对样本均获得满意的9个短串联重复序列位点和1个性别位点的分型结果。6对移植标本短串联重复序列差异基因由受者型向供者型转化的时间为14～23d。6对样本间存在明显差异。第3对、第5对在第14天已为供者完全嵌合状态，而第1对在第16天、第4对在第18天尚为供受者混合嵌合体。但6对样本都是一个从混合嵌合向完全嵌合发展的良好趋势。结论：①6对移植标本短串联重复序列差异基因由受者型向供者型转化的时间为14～23d，6对样本都有从混合嵌合向完全嵌合发展的良好趋势。②采用荧光标记复合扩增短串联重复序列方法可精确地测量聚合酶链反应产物的数量，描述造血干细胞的植入程度及植入的整个演变过程。     

1例双份非血缘脐血移植的护理

脐血移植现已成为根治性治疗白血病的主要手段之一,但由于单份脐中细胞数量有限而限制了它在成人患者中的应用.我科于2002年7月为1例急性单核细胞白血病的成人患者应用双份非血缘脐血移植获得成功.现将护理体会报告如下.     

短串联重复序列检测在异基因造血干细胞移植植入状态中的应用

背景:移植后造血干细胞植活的判断主要依赖于体内各种遗传标记,其在敏感性和有效性方面各不相同,故亟待建立一种鉴别力强、敏感性高、不受性别限制的检测方法。目的:观察异基因造血干细胞移植供受者移植前及受者移植后不同时间段的血样DNA短串联重复序列遗传位点检测情况。设计:观察测量实验。单位:深圳市血液中心输血医学研究所免疫遗传重点实验室。对象:选择2004-02/2005-12在深圳市血液中心输血医学研究所免疫遗传实验室配型成功并进行造血干细胞移植的18对供受者血样,18例患者中,男10例,女8例,平均35岁。接受血缘关系供者移植6例,无关供者移植12例。所有受试对象均对检测项目知情同意。方法:采用荧光标记复合扩增短串联重复序列(STR)检测技术,对18例进行造血干细胞移植的血液病患者移植后的系列血样及移植前供、受者的血样进行15个STR位点和1个性别位点的检测,找出供受者间的差异基因,观察移植后供者的STR基因在受者体内的植入情况及变化过程,找出最早检测到供者STR基因的时间及完全嵌合体最早出现的时间。主要观察指标:①观察移植前供受者差异基因。②供者STR基因及完全嵌合体最早出现时间。结果:供受者18对均进入结果分析。①供受者中能区分出彼此差别的平均STR差异位点数为12.4(8～15)个。②患者移植后最早可检测到供者STR基因的平均时间为8(5～14)d,由受者型向完全供者型转化的平均时间为14(9～23)d。植入状态由供受者嵌合型转为完全供者嵌合型。结论:荧光标记复合扩增STR检测方法可精确地描述异基因造血干细胞移植植入状态及其演变过程,可为临床提供一个准确、可靠的实验依据。     

成人双份非亲缘脐血联合移植护理一例报告

脐血造血干细胞移植 (CBSCT)是目前根治小儿白血病、恶性肿瘤及再生障碍性贫血最有效的方法之一。但移植成功与否与造血干细胞的有核细胞数密切相关。成人由于体重偏重导致一份脐血有核细胞数不足 ,而双份脐血联合移植是解决单份脐血有核细胞数偏低问题的途径之一。我院于 2 0 0 2年1月通过HLA(人类白细胞抗原 )配型 ,对一例成人慢性髓细胞性白血病 (CML)患者施行了双份脐血联合移植并获成功 ,现将体会浅谈如下。1　病例资料患者女性 ,2 9岁 ,体重 4 9kg ,身高 1 5 7cm ,血型“B” ,确诊“CML” ,骨髓象示慢性期。 2 0 0 2年 1月经全…     

双份脐血造血干细胞移植的现状

异基因造血干细胞移植是治疗血液系统恶性及非恶性疾病的一种有效的根治方法。与骨髓和外周血干细胞移植相比,脐血干细胞移植以其来源丰富,取材方便,术后移植物抗宿主病发生率较低及程度较轻等优势而获得了越来越广泛的运用。但因单份脐血中所含有的有核细胞数较少等问题限制了脐血移植的适用范围。为此,人们尝试采用双份脐血造血干细胞移植。本文就其近年来的发展现状作一综述。     

非血缘脐血移植的展望

近年,非血缘脐血移植(UCBT)的广泛开展,为恶性及非恶性血液病患者的治疗提供了更多选择.本文将从脐血的选择、预处理方案、植入前综合征(PES)、植入失败和复发的处理等方面,对UCBT的最新进展及前景进行总结.     

脐血移植后患者的T淋巴细胞免疫重建特点

目前,造血干细胞移植(HSCT)为根治各种恶性血液病和免疫缺陷性疾病的唯一手段,脐血移植(UCBT)作为HSCT的一种,已凭借其诸多优势越来越广泛地被应用于多种疾病的治疗.但是由于脐血所含造血干细胞数量有限,UCBT后患者的T淋巴细胞免疫重建相对延迟,导致感染的发生风险显著增高.为了更好地了解UCBT后机体的免疫功能状态,笔者拟就UCBT后患者T淋巴细胞免疫重建的特点、影响因素,以及如何加速T淋巴细胞免疫重建进行综述.     

非清髓性双份脐血移植治疗成人重型再生障碍性贫血8例

选择1998-06/2007-12广州市第一人民医院收治的成人重型再生障碍性贫血患者8例进行非清髓性双份供者脐血移植,预处理方案采用减量环磷酰胺+抗淋巴细胞球蛋白方案,输入的脐血总有核细胞数为5.69×107/kg,CD34+细胞数为4.10×105/kg.移植物抗宿主病的预防采用短程甲氨蝶呤联合甲基强的松龙方案.结果中性粒细胞绝对值＞0.5×109L-1的中位时间为移植后17 d(7～25 d),血小板计数回升＞20×109L-1的中位时间为移植后35 d(13～102 d).7例患者DNA指纹图检测显示为供受者嵌合体;2例患者出现Ⅰ～Ⅱ度急性移植物抗宿主病,均得到控制;1例患者出现Ⅱ度慢性移植物抗宿主病,予甲基强的松龙后控制.目前5例患者无病存活10～108个月.提示对于成人受者接受非清髓性双份脐血移植在临床上是可行的,非清髓性预处理可保证脐血干细胞的有效植入.     

Potential role of N-Succinyl-Chitosan in immune reconstitution after umbilical cord blood transplantation in mice

How to shorten the immune convalescence required after transplantation in recipients is still an austere medicinal problem. Speed-up recovery means less infection opportunity and high survival. In this study, an immune-deficient mouse model was developed by lethally irradiation to evaluate the immune reconstitution effect of N-Succinyl-Chitosan (NSC), a water soluble low molecular weight chitosan derivative, after umbilical cord blood stem cells transplantation, including hematopoiesis parameters detection, T-cell phenotype analysis and pathological comparison; effects of NSC on proliferation of umbilical cord blood stem cell has also been evaluated in vitro. By comparison and analysis, we found the combination of NSC and hematopoietic growth factors could dramatically shorten the time required for the recovery of hematopoiesis, T-cell phenotype and injured spleen after transplantation, suggesting that NSC may hasten the immune recovery and therefore may shorten the time of exposure to life-threatening opportunistic infections in transplant recipients. Moreover, we demonstrated that NSC was effective on the proliferation and clone of umbilical cord stem cell in vitro, suggesting NSC could speed up the immune reconstitution in umbilical cord blood transplantation by enlarge the number of umbilical cord blood stem cell.     

双份无关供者脐血移植治疗成人血液系统恶性疾病临床研究

目的 观察双份无关供者脐血移植(CBT)治疗成人血液系统恶性疾病的植入、合并症以及患者生存情况.方法 12例成人血液系统恶性疾病患者,稳定期10例,进展期2例.预处理除除1例患者采用非清髓方案外,其余11例采用改良Bu/Cy或Cy/TBI方案,所有患者均联合应用抗人胸腺细胞球蛋白.移植物抗宿主病(GVHD)的预防采用环孢素、霉酚酸酯联合短程甲氨蝶呤方案.12例患者均接受2份脐血移植,HLA配型0～2个位点不合,输入总有核细胞(TNC)中位数为5.55(2.99～8.18)×107/kg.结果 11例(91.7%)患者血常规指标达到植活标准,中性粒细胞(ANC)植入时间为(21.6±5.1)d,血小板植入时间为(34.9±9.5)d.1例患者移植后3个月被排斥,白血病复发,10例患者获得稳定植入,稳定植入率83.3%.经HLA差异性分析、DNA位点短串联重复序列多态性(STR)检测、性染色体及血型抗体滴度测定等检查证实,9例患者最终为细胞数较多的1份脐血获得植入,1例为细胞数较少的1份脐血获得植入.3例患者在移植后早期呈2份脐血混合嵌合状态,但1份脐血占优势.细胞数相对较多的脐血与优势植活相关(P=0.011).11例植活的患者中,Ⅰ度急性GVHD(aGVHD)5例,Ⅱ度aGVHD 1例,无Ⅲ～Ⅳ度aGVHD发生,10例存活超过100天的患者中,慢性GVHD(cGVHD)2例,均为局限性.全部12例患者中位随访时间11(1.5～82)个月,8例患者无事件生存(EFS),3年EFS率为(66.7±13.6)%,10例稳定期患者7例EFS,3年EFS率为(70.0±14.5)%.结论 成人血液系统恶性疾病患者接受HLA配型部分相合的2份脐血移植在临床上是可行的,可以克服单份脐血因细胞数较少植入缓慢的缺点.细胞数是决定哪份脐血获得长期稳定植入的主要因素.     

脐带血干细胞制备的检测分析

目的对脐带血干细胞制备进行检测,为临床安全、有效地应用提供依据。方法测定母体和脐带血标本的人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒(HCV)、梅毒螺旋体(TP)、巨细胞病毒(CMV)、内毒素、支原体和病原微生物。应用体外分离纯化试剂盒,分离干细胞,计数提取后单个核细胞数,经台酚兰染色检测干细胞活力。应用流式细胞仪检测CD34干细胞、淋巴细胞亚群。结果提取后有核细胞数为(5.4±1.09)×107,脐血的量和提取干细胞数成正相关。干细胞活力检测分离的活性率为(98.7±1.3)%。流式细胞仪测得脐血干细胞CD34+为(1.55±0.67)%(n=19)。淋巴细胞亚群检测结果显示,脐血CD3细胞数较少,CD4和CD8细胞数之和明显高于CD3细胞数,且选择脐血CD4/CD8小于1.3,这也是脐血移植时GVHD表现轻微的一个重要原因。结论脐血干细胞制剂的制备,符合细胞治疗的相关安全性指标。     

Cost of umbilical cord blood units released for transplantation

BACKGROUND: A large number of institutions have started programs banking umbilical cord blood (UCB) for allogeneic unrelated-donor and related-donor transplantation. However, limited information is available on the financial issues surrounding these activities. STUDY DESIGN AND METHODS: The aim of this study was to determine the fee per UCB unit released for transplantation that would allow cost recovery after 10 years. Three organizational models were considered suitable to provide units for five UCB transplants per 1 million population per year, a figure that would translate into an annual need for 280 units in Italy. Models A, B, and C included, respectively, seven networked banks, each with an inventory of 1,500 units; two networked banks, each with an inventory of 5,000 units; and one bank with an inventory of 10,000 units. It was estimated that it would take 3 years to develop the cryopreserved inventory and that approximately 3 percent of the inventory could be released and replaced each year during the 7-year interval between the fourth and tenth years of activity. The data on the costs of labor, reagents and diagnostics, disposables, depreciation and maintenance, laboratory tests, and overhead, as well as the operational data used in the analysis were collected at the Milano Cord Blood Bank in 1996. RESULTS: Fees of US $15,061, $12,666, and $11,602 per unit released during the fourth through the tenth years of activity allow full cost recovery (principle and interest) under Models A, B, and C, respectively. CONCLUSION: Although UCB procurement costs compare favorably with those of other hematopoietic cell sources, these results and the current fee of US $15,300 used in some institutions show that UCB is an expensive resource. Therefore, judicious planning of banking programs with high quality standards is necessary to prevent economic losses. The advantages of lower fees associated with the centralized banking approach of Model C should be balanced with the more flexible collection offered by Model A.