肥大细胞在良性前列腺增生和前列腺腺癌组织的分布及生物学意义

目的　研究良性前列腺增生和前列腺腺癌组织中肥大细胞分布及其生物学意义。方法　以肥大细胞特异的类胰蛋白酶作为标记蛋白 ,采用免疫组织化学染色法观察前列腺增生和前列腺腺癌组织内肥大细胞的分布。结果　良性前列腺增生组织肥大细胞平均数与合并有炎症的良性前列腺增生组织肥大细胞平均数差异无统计学意义 (P>0 .0 5 )。前列腺癌区肥大细胞数量明显少于前列腺癌旁间质 (P<0 .0 5 )。分化程度不同的前列腺癌旁间质的肥大细胞数量不同 (P<0 .0 5 )。结论　前列腺癌组织肥大细胞数量分布的差异提示肥大细胞可能参与机体抗肿瘤反应     

人血清类胰蛋白酶含量测定方法的建立

目的：检测正常人血清类胰蛋白酶含量，为肥大细胞相关疾病的诊断提供依据。方法：随机抽取正常人血清标本和1例过敏性休克死亡患者血清，用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测类胰蛋白酶的水平。结果：206份正常血清类胰蛋白酶含量的平均值为2.24ng/mL。过敏性休克死者血清胰蛋白酶含量为正常人的50倍。结论：本实验建立了较灵敏的检测类胰蛋白酶的ELISA法，为临床肥大细胞相关疾病的诊断提供依据。     

一种改良小鼠肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法的建立

目的:探讨并改良肠道黏膜固有层淋巴细胞(LPL)分离方法。方法:参照Sanos等方法进行改进。用分离液和消化液处理肠组织片段后,通过100μm的尼龙滤网过滤,行零加减速密度梯度离心,观察分析细胞获得率、细胞活率和细胞纯度。结果:每只小鼠肠道LPL的获得量为(5.5±1.7)×106个,细胞活力>92%;细胞平均直径为(7.5±0.8)μm,细胞平均圆度为0.93±0.03,细胞结团率为(0.4±0.2)%;流式细胞仪检测细胞活率为(94.5±3.2)%,CD4+T细胞的含量为(72.5±5.2)%。结论:与国内外其他分离方法相比较,该方法简化、高效、稳定,且获取的LPL的细胞数量多、活率高、纯度高,可为肠道黏膜免疫的研究提供可靠的方法,值得推广。     

一种简便人绒毛滋养细胞体外原代培养方法的建立

目的 探索一种简便、实用的原代人早孕滋养细胞培养方法。方法 原代组织块法培养人早孕绒毛滋养细胞，Ficoll离心及差速贴壁法进行纯化，CK-7及Vimentin检测细胞纯度。结果 所得人早孕滋养细胞纯度高达95％。结论 组织块法培养，Ficoll离心及差速贴壁法纯化是一种较有效的人早孕绒毛滋养细胞培养方法。     

人黄韧带细胞体外原代培养方法的比较

目的 比较不同的人黄韧带细胞(LFCs)原代培养方法,优化培养条件,提高培养成功率.方法 采集成年腰椎间盘突出症患者后路椎间盘摘除术中的黄韧带,分别采用组织块法、酶消化法、胶原酶消化加组织块法体外原代培养LFCs,传代培养;倒置相差显微镜下观察细胞从组织块内迁出时间、细胞形态和生长状态;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测...     

内毒素对肥大细胞脱颗粒释放组胺和类胰蛋白酶的影响

目的通过体外分离培养大鼠腹腔肥大细胞（RPMC）,进而探讨内毒素（endotoxin,ET）对RPMC脱颗粒释放组胺和类胰蛋白酶的影响。方法将悬浮培养的RPMC分为5组：①无ET处理组;②0.5μg/mlET处理组;③1μg/mlET处理组;④2μg/mlET处理组;⑤4μg/mlET处理组。37℃孵育2h,收集RPMC上清,荧光法测定RPMC培养上清中组胺含量;专性底物α-N-苯甲酰-DL-精氨酸-P-硝基苯胺（BAPNA）测定RPMC培养上清中类胰蛋白酶含量,分析不同浓度ET对RPMC释放组胺和类胰蛋白酶的影响。结果不同浓度ET处理组与无ET处理组相比RPMC脱颗粒现象明显;不同浓度ET处理组刺激RPMC释放组胺和类胰蛋白酶的量均高于无ET处理组（P〈0.05）,与ET剂量依赖性不明显（P〉0.05）,并且给予1μg/mlET处理时组胺和类胰蛋白酶的释放量最高。结论ET体外可刺激RPMC脱颗粒释放组胺和类胰蛋白酶,但与ET剂量依赖性不明显。     

人黄韧带细胞体外原代培养方法的比较研究

摘要：目的 比较不同的人黄韧带细胞（LFCs）原代培养方法,优化培养条件,提高培养成功率。方法 采集成年腰椎间盘突出症患者后路椎间盘摘除术中的黄韧带,分别采用组织块法、酶消化法、胶原酶消化加组织块法体外原代培养LFCs,传代培养;倒置相差显微镜下观察细胞从组织块内迁出时间、细胞形态和生长状态;四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）测定其吸光度（OD）值,评价细胞增殖状况,绘制细胞生长曲线;用免疫荧光染色法检测传3代细胞的波形蛋白和Ⅰ型胶原的表达。结果 胶原酶消化加组织块法中组织块解离、贴附和细胞游出状况均优于单纯组织块法或单纯酶消化法,成功率较高。原代培养细胞的波形蛋白和Ⅰ型胶原免疫荧光染色呈阳性。结论 胶原酶消化加组织块法可提高LFCs原代培养的成功率。     

食管癌细胞诱导肥大细胞迁移的小鼠模型

目的建立小鼠肥大细胞 (mast cell, MC) 迁移模型,探讨化疗药物三氧化二砷对人食管癌EC109细胞株生长的杀伤机理。方法利用肥大细胞的特征性蛋白酶抗体及其免疫荧光标记MC和PI标记EC109细胞内DNA;以流式细胞术分析小鼠腹腔液中肥大细胞各亚型的百分率及肿瘤细胞周期变化;使用激光扫描共聚焦显微镜显示肥大细胞内分泌颗粒的分布。并通过组织化学方法,观察各种诱导处理后小鼠肠组织肥大细胞由肠道向腹腔移动的变化。结果① 根据流式细胞仪点图分布分析,将小鼠肥大细胞分为:类胰蛋白酶阳性、类糜蛋白酶阴性(MC T); 类糜蛋白酶阳性、类胰蛋白酶阴性(MC C)和类胰蛋白酶阳性、类糜蛋白酶阳性(MC TC)三种亚型,且T型MC明显多余TC型和C型(P<0.05);以共聚焦显微镜显示三种亚型的MC均含有丰富的分泌颗粒并分布于细胞膜内侧,为其出芽突起形成储备的状态。② 经组织切片观察到诱导处理后小鼠肠组织MC由肠道向腹腔移动,且胰酶对MC的诱导作用大于食管癌细胞和As₂O₃。③ 经诱导迁移入腹腔的MC可能与癌细胞周期由S期向G₂/M期跨越相关;As₂O₃能延迟食管癌细胞的G₀/G₁期,阻碍细胞向S期跨越,从而抑制食管癌细胞的生长。结论食管癌细胞移入小鼠腹腔,主要诱导T型MC参与免疫反应。在生物机体内环境(这里指MC影响)的条件下,As₂O₃对肿瘤细胞生长的作用主要表现为促使癌细胞周期的G₀/G₁期向S期跨越延迟,或G₂/M期进入细胞分裂的延迟。     

肥大细胞类胰蛋白酶促进人乳腺癌细胞系MDA-MB-435的跨膜侵袭

 目的 研究类胰蛋白酶对人乳腺癌细胞系MDA-MB-435侵袭力的影响及其机制。方法 通过体外细胞侵袭力试验观察不同浓度、不同时间类胰蛋白酶对乳腺癌MDA-MB-435细胞跨膜侵袭力的影响，并利用RT-PCR以及明胶酶谱法研究类胰蛋白酶对基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和金属蛋白酶组织抑制物（tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP-2）表达水平的调节。结果 150～500pmol/L的类胰蛋白酶可以促进MDA-MB-435细胞的跨膜侵袭；还可以促进MMP-2、TIMP-2的mRNA表达（P<0.01）和MMP-2的蛋白表达（P<0.05）。 结论 类胰蛋白酶可以促进人乳腺癌细胞系MDA-MB-435细胞的跨膜侵袭，该作用可能与增加MMP-2的mRNA和蛋白表达、TIMP-2的mRNA表达相关。     

蛋白酶激活受体-2激动剂对人皮肤和扁桃体肥大细胞释放组胺和类胰蛋白酶的影响

目的:研究蛋白酶激活受体-2(PAR-2)激动剂对人皮肤和扁桃体肥大细胞释放组胺和类胰蛋白酶的影响.方法:用PAR-2激动剂激发经酶悬浮的人皮肤和扁桃体肥大细胞,并分别测量类胰蛋白酶和组胺的释放量.结果:PAR-2激动剂丝-亮-异亮-甘-赖-缬(SLIGKV)可引起皮肤肥大细胞组胺释放,但对类胰蛋白酶释放无影响.相反,SLIGKV可引起扁桃体肥大细胞的类胰蛋白酶,而不是组胺释放.另外一种PAR-2激动剂反肉桂酰-亮-异亮-甘-精-亮-鸟-[酰胺](te-LIG-RLO-NH2)比SLIGKV-NH2诱导类胰蛋白酶和组胺释放的作用弱.结论:我们首次报道了皮肤和扁桃体肥大细胞具有在体外释放类胰蛋白酶的特性.皮肤和扁桃体肥大细胞释放类胰蛋白酶和组胺的差别揭示了一种新的肥大细胞对刺激产生反应的异质性的类型,提示人类肥大细胞至少有2种脱颗粒信号的自我放大机制.     

Demonstration of inhibition of mediator release from human mast cells by azatadine base. In vivo and in vitro evaluation

In vitro experimentation using dispersed human lung mast cells demonstrated that azatadine base, a compound with known H1-antihistamine properties, inhibited anti-IgE-induced release of histamine and leukotriene C4 by 45% and 85%, respectively. To assess the clinical relevance of these findings and to compare in vitro mast cell data with results obtained in vivo, nasally instilled azatadine was tested in a double-blind, placebo-controlled clinical trial in which nasal challenges with antigen were performed on eight allergic individuals. Pretreatment with azatadine significantly suppressed the number of sneezes following antigen challenge and inhibited the associated elevations in histamine, kinins, and enzyme(s) hydrolyzing the artificial substrate N-alpha-tosyl-L-arginine-methyl-ester in nasal secretions, whereas placebo was inactive. Hence, we showed agreement between our in vitro and in vivo experimental models of the allergic reaction. Topical application of azatadine base has the potential to become an effective antiallergic treatment.     

原代人脂肪基质细胞体内成骨能力的检测

目的:检测原代人脂肪基质细胞(human adipose-derived stromal sells,hASCs)的体内成骨能力,为应用其构建组织工程化骨奠定基础。方法:酶消化法分离原代hASCs,细胞经成骨向和成脂肪向诱导后,碱性磷酸酶(al-kaline phosphatase,ALP)染色和茜素红矿化染色检测其成骨向分化的能力,油红O染色检测其成脂肪向分化的能力。体内实验使用12只裸鼠,于其背部一侧皮下植入原代hASCs+支架材料作为实验组,同一裸鼠的另一侧植入单纯支架材料作为对照组。植入4周和8周后取材,制成组织切片,进行HE染色和免疫组织化学染色观察。结果:300 mL脂肪组织中可以获得约6×107个原代hASCs。体外实验证实原代hASCs具有成骨向和成脂肪向分化的潜能。HE染色可见,植入4周和8周后植入物中有类骨组织形成,免疫组织化学染色显示骨钙素、ALP和抗人核抗体呈阳性表达。结论:原代人脂肪基质细胞与支架材料构建的复合物可以在裸鼠体内成骨。     

树突状细胞的体外培养及其诱导的抗肿瘤免疫作用

目的 建立体外培养扩增树突状细胞（DC）的方法,并观察其诱导的抗肿瘤免疫作用。方法 分离外周血单个核细胞,应用GM－CSF及IL－4诱导DC产生,用TNF－α和PGE2促进其成熟,并用肺癌细胞系GLC－82可溶性抗原致敏。将成熟DC与自体LAK细胞混合培养（DC－LAK）,用MTT法检测DC－LAK细胞及LAK细胞对多种肿瘤细胞系的杀伤作用。结果 经GM－CSF,IL－4,TNF－α,PGE2作用后,细胞表达CD1a阳性率为71．0％,CD8350．0％,CD14阳性率低于10．0％,高表HLA－I,HLA-Ⅱ和CD45,为典型的DC表型特征。DC－LAK和LAK细胞对4种肿瘤细胞（GLC－82,A549,moser和MCF－7）的杀伤率,前为84．7％,66．9％,49．3％和56．0％,后为43．5％,31．3％,45．0％和32．4％。结论 成功的诱导出具有典型形态特征及增强LAK细胞杀伤活性的DC。     

拓扑替康杀伤骨髓增生异常综合征原始细胞的体外和动物实验研究

目的:研究拓扑替康(TPT)在体内外对骨髓增生异常综合征(MDS)细胞株(M utz-1)细胞的杀伤作用及其机制。方法:用MTT法测定TPT对M utz-1的生长抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡率,电镜观察凋亡细胞形态。对荷瘤小鼠用TPT腹腔注射,测量肿瘤大小和动物生存期作为评介TPT的抗肿瘤活性。结果:TPT显著抑制M utz-1细胞生长,呈剂量依赖性。半数生长抑制值(IC50)为272 ng/L。TPT作用48 h和72 h后细胞凋亡率分别为54.16%±4.29%和72.97%±6.12%,凋亡细胞具有典型的细胞凋亡形态学特征。用TPT治疗后5周内,荷瘤小鼠肿瘤生长速度减慢,显著低于对照组和A s2O3治疗组(P<0.05)。TPT治疗组小鼠平均生存期7周,而对照组和A s2O3组平均生存期为4周(P<0.001)。结论:在体外和动物实验中,TPT对MDS细胞株M utz-1细胞有显著的杀伤作用。     

原代培养大鼠前列腺细胞建立前列腺增生筛药模型

【摘要】目的：建立原代培养大鼠前列腺上皮细胞体外筛药模型。方法：无菌状态下取雄性SD大鼠腹侧叶前列腺,称量后,剪成1mm3小块,经Ⅱ型胶原酶消化1h后,过滤、离心获取前列腺细胞,接种于24孔板培养并对细胞进行形态学和免疫组织化学鉴定。获取的大鼠前列腺上皮细胞分别接种于96孔板和24孔板培养12d后给予系列剂量（0.1-1000µM）的他莫昔芬和阳性药物爱普列特处理72 h,利用CCK-8法检测前列腺上皮细胞存活率并计算药物IC50值,并进一步通过Giemsa染色后观察细胞生长及形态变化。结果：细胞鉴定结果显示,获取的细胞具典型上皮细胞形态特征,细胞角蛋白和前列腺特异性抗原表达阳性,提示所获细胞为前列腺上皮细胞。爱普列特与前列腺上皮细胞孵育72h后,CCK-8法检测结果显示能够明显抑制前列腺上皮细胞生长,其IC50值为42.7µM,进一步镜下观察结果显示,爱普列特未明显改变大鼠前列腺上皮细胞形态,但能导致存活细胞数减少。他莫昔芬则对大鼠前列腺上皮细胞生长无明显抑制作用,镜下观察前列腺上皮细胞数量和形态未见明显改变。结论：利用原代培养SD大鼠前列腺上皮细胞可以成功建立前列腺增生体外筛选模型。     

PEDF对人晶状体上皮细胞生长调控的体内外研究

目的:探讨在体内及体外色素上皮衍生因子(PEDF)对人晶状体上皮细胞(LEC)生长的调节作用?方法:体内研究用ELISA法检测年龄相关性白内障患眼房水PEDF浓度,术中取前囊膜标本检测LEC密度,分析PEDF水平与LEC数量?白内障类型的关系;体外研究,加PEDF培养人晶状体上皮细胞株(HLE-B3),CCK8法检测细胞生长活性,流式细胞仪通过Annexin V-FITC/7-AAD双染法检测细胞周期和凋亡变化? 结果:120例白内障患眼房水PEDF浓度为(156.2 ± 41.2)ng/ml,中央区前囊下LEC密度随房水PEDF水平下降而降低(r = 0.556,P < 0.01),控制年龄因素后仍呈正相关(r = 0.387,P < 0.05),皮质型白内障房水PEDF浓度较核硬化型更低(P < 0.05);体外培养的LEC细胞株加入PEDF后,细胞生长明显加快(F = 187.33,P < 0.01),细胞凋亡被显著抑制,凋亡率从13.50%降为2.08%(t = 7.90,P < 0.01),细胞分裂活性增强,G2期 + S期细胞比例从28.54%升为54.05%(t = 6.32,P < 0.01)? 结论:人眼内PEDF可能作为LEC营养因子发挥细胞周期调控和抗凋亡的重要作用,参与晶状体生理性状维持和白内障发生发展?     

反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响

目的观察反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响.方法克隆人VEGF基因,将VEGF-cDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA3,构建反义VEGF表达载体pcDNA3-VEGF(-);利用阳离子脂质体载体,稳定转染人喉癌Hep-2细胞,并通过流式细胞仪检测,观察转染细胞细胞周期的改变,在透射电镜下观察转染细胞超微结构的改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况.结果成功克隆了人VEGF基因,并构建了携带反义VEGF基因的真核表达载体pcDNA3-VEGF(-);将其稳定转染人喉癌Hep-2细胞,获得了稳定表达反义VEGF的细胞系,与正常Hep-2细胞相比,该细胞系细胞周期及超微结构均无明显改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,与对照组相比,肿瘤的生长速度明显减缓.结论反义VEGF基因转染可以有效地抑制喉癌的生长.