FⅧ基因内含子22倒位及X染色体非随机灭活导致的女性血友病A

目的 对1例女性血友病A(HA)患者进行产前诊断,探讨其分子发病机制.方法 利用测定FⅧ活性(FⅧ:C)、出血时间(BT)、血管性血友病因子(VWF)等指标进行HA表型诊断;用长链PCR及序列特异PCR进行FⅧ基凶内含子22及1倒位检测,对FⅧ基因的所有外显子及其侧翼序列进行测序.联合FⅧ基因内外的8个多态性位点进行遗传连锁分析,DXS 52(ST14)位点多态性以PCR产物凝胶电泳法榆测,7个微卫星位点(F8Civs13、CA22、DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073、DXS1108)的多态性以多重荧光PCR法检测,产前诊断加用性别位点(Amelo).利用甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ对基因组DNA进行酶切,荧光PCR法对HpaⅡ酶切前后的基因组DNA进行人类雄激素受体基丙(HUMARA)中CAG重复序列的扩增,荧光扫描法对扩增产物进行检测,根据酶切前后PCR产物的峰值变化来分析判断X染色体的随机灭活模式.结果 先证者的FⅧ:C为2.1%,其余表型检测结果均正常,其家系成员表型检测结果均正常.FⅧ基因内含子22倒位检测示先证者为22倒位阳性携带者,家系其他成员及胎儿均为22倒位阴性;先证者FⅧ基因内含子1倒位检测结果为阴性,其FⅧ基因测序未发现突变.遗传连锁分析发现先证者的X染色体分别遗传自其父亲、母亲;其胎儿为女性且遗传了先证者来源于其母亲的1条X染色体.先证者为X染色体非随机灭活,其来自母亲的x染色体被大部分灭活,而来自父亲的x染色体大部分被保留活性.结论 FⅧ基冈内含子22倒位及X染色体非随机灭活导致了该例女性血发病A的发生,其胎儿为正常女性.     

无先证者血友病A家系的基因诊断

目的 :探讨无先证者血友病A(hemophilia A,HA)家系的基因诊断。方法 :对5个无先证者的HA家系,采用长距离PCR及序列特异PCR直接检测疑似携带者的凝血因子Ⅷ(coagulation factorⅧ,FⅧ)基因内含子22倒位及1倒位;对其中未检测出的家系通过联合FⅧ基因内外的7个STR位点(FⅧCivs13、Intron25、3_486、5_147、5_226、DXS8069、DXS1073)进行遗传连锁分析,对于有产前诊断要求的孕妇则结合其男性胎儿脐带血的FⅧ活性检测结果作出分析。结果 :5个HA家系中,有3例疑似携带者的FⅧ基因内含子22倒位检测结果为阳性,1例疑似携带者的FⅧ基因内含子1倒位检测结果为阳性。对于另1例22倒位、1倒位检测结果均为阴性但有产前诊断要求的孕妇,通过联合FⅧ基因内外的7个STR位点进行遗传连锁分析,发现胎儿是携带1条致病X染色体的男性,且胎儿脐带血的FⅧ活性为1%,故联合诊断胎儿为男性HA患者。结论:在无HA先证者情况下,通过FⅧ基因内含子22及1倒位筛检,联合FⅧ基因内、外多个位点的遗传连锁分析及胎儿脐带血FⅧ活性检测,可为家系女性携带者的诊断及产前诊断提供有用信息。     

同时存在血友病A及血友病B患者家系的基因诊断

目的:对1个同时存在血友病A(HA)及血友病B(HB)患者的家系进行分子发病机制研究,并对家系女性成员进行携带者检测。方法:采用活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(Fg)、凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性(FⅧ:C)、FⅨ活性(FⅨ:C)及血管性血友病因子(vWF)等测定进行HA及HB表型诊断;用长链聚合酶链反应(LD-PCR)进行F8基因内含子22倒位检测,2组序列特异的PCR对F8基因内含子1倒位进行检测;采用直接核苷酸测序法对F9基因各外显子及其侧翼序列进行检测,联合F9基因相关的6个微卫星位点(DXS8094、DXS1211、DXS1192、DXS102、DXS1227及DXS8013)进行家系遗传连锁分析。结果:先证者1是由F8基因内含子22倒位引起的HA。先证者2是由F9基因突变nt32772A→T突变(p.Ser365Cys,GI:22385320)引起的HB,其突变基因遗传自其母亲,来源于先证者2外公的X染色体,其外公为该突变的体细胞和生殖细胞嵌合体,其阿姨口腔细胞DNA未检出该突变。结论:该家系2名先证者的基因诊断结果与表型诊断相符。单碱基延伸法可用于突变嵌合率的检测,并为血友病散发家系的突变来源提供可靠的信息。     

血友病A患者凝血因子Ⅷ基因内含子1及22倒位分析

目的 对血友病A(HA)患者及其家系携带者进行凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子1及22倒位分析,并探讨其与FⅧ抗体产生的相关性.方法 对157例HA患者进行FⅧ活性(FⅧ:C)及FⅧ抗体检测;同时采用双管多重PCR及长距离PCR(LD-PCR)技术对其中81例HA患者进行FⅧ内含子1及内含子22倒位分析;并对其中6例患者进行家系调查.结果 81例HA患者中3例为内含子1倒位,均为重型,占重型HA的4.6%(65例中3例);内含子1倒位患者中1例为FⅧ抗体阳性.用该基因信息对1个内含子1倒位患者家系的2名女性进行了检测,1例为携带者,1例为非携带者.81例HA患者中25例为内含子22倒位,均为重型,占重型HA的38.5%(65例中25例),内含子22倒位患者中发现1例为FⅧ抗体阳性.用该基因信息对5个内含子22倒位患者家系的9名女性进行了检测,7例为携带者,2例为非携带者.结论 内含子1倒位是继内含子22倒位外导致重型HA的另一重要分子发病机制.FⅧ内含子倒位检测不仅可用于血友病直接基因诊断、进行家系调查;同时还可纠正表型分型的偏差.FⅧ内含子1和内含子22倒位可能是抗体产生的高危因素之一.     

两个同源重组血友病家系的基因诊断

目的探讨特殊血友病家系的基因诊断。方法通过FⅧ基因内含子22倒位及内含子1倒位的直接检测与遗传连锁分析的间接诊断相结合对1个血友病A（HA）家系进行基因诊断；采用核酸直接测序法对FⅨ各外显子及其侧翼序列进行检测，并联合FⅨ基因相关的6个微卫星（STR）位点对1个血友病B（HB）家系进行基因诊断。结果HA家系先证者为FⅧ内含子1倒位阳性，家系中要求做携带者诊断的女性成员为内含子1倒位携带者；而FⅧ基因内外8个多态性位点遗传连锁分析证实该女性成员发生同源染色体重组。HB家系先证者除7号外显子测序未成功外，其余部分均未找到突变，家系中要求做携带者与产前诊断的女性，其羊水细胞经直接核酸测序未找到突变，利用FⅨ相关的6个STR位点进行遗传连锁分析发现该女性有染色体同源重组现象存在，胎儿为正常男性。结论在应用间接诊断方法进行HA和HB的携带者及产前基因诊断时，要考虑到染色体同源重组现象的发生可能导致误诊与漏诊的情况。在中国人群中应该开发更多的FⅧ和FⅨ分子中信息量大的多态性位点，以提高HA和HB的携带者及产前诊断的准确率。     

倒位PCR法检测血友病A FⅧ基因内含子22/1倒位

目的建立血友病A（hemophilia A,HA）FⅧ基因第22内含子倒位PCR检测法,并初步应用于HA直接基因诊断。方法应用倒位PCR（inversion-PCR,I-PCR）方法对24个HA家系中所有先证者的FⅧ基因22内含子倒位进行检测,对检测阳性者的母亲进一步用上述方法行携带者诊断,并对其中1例进行羊水产前基因诊断。检测阴性者再行内含子1倒位筛查。结果 24个HA家系中,7例先证者的F基因内含子22倒位检测为阳性,阳性检出率、可诊断率分别为29.17%、100%,未发现内含子1倒位;7例内含子22倒位突变阳性患者的母亲有6例为倒位携带者,羊水诊断未发现内含子22/1倒位。结论 I-PCR法能准确地检测F基因22内含子倒位突变,可应用于HA患者及携带者FⅧ基因22内含子倒位基因诊断及产前诊断。     

血友病的携带者与产前分子诊断

目的：建立一种简便、快速的血友病携带者检测与产前诊断体系。方法：用聚合酶链反应(PCR)方法分别检测FⅧ内含子22倒位及血友病A家系中FⅧ基因内的BclⅠ位点、内含子13和22中STR和FⅧ基因外的DXS 52(ST14)位点的多态性；对血友病B家系检测FⅨ基因外6个STR位点(DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXSS013、DXS1227、DXS102)的多态性。结果：综合应用直接检测倒位和遗传连锁分析。21个血友病A家系的可诊断率为94．7％；联合FⅨ基因外6个STR位点对血友病B家系进行遗传连锁分析。使10个家系全部得到诊断。结论：FⅧ内含子22倒位检测阳性，可以直接诊断血友病A的携带者及患儿；检测FⅧ基因内、外及FⅨ基因外多个位点的多态性并进行遗传连锁分析，是血友病携带者检测与产前诊断的简便、快速的方法。     

凝血因子Ⅷ内含子ⅩbaⅠ多态位点检测及其在血友病A产前诊断中的应用

目的建立凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因内含子22的Ⅹba Ⅰ多态位点高特异的基因连锁分析法，并应用于血友病A（HA）家系中孕妇携带者检测及产前基因诊断。方法用长距离PCR特异性扩增206个无血缘关系个体中FⅧ基因内含子226．2kb片段并进行Ⅹba Ⅰ酶切，计算Ⅹba Ⅰ多态性位点的基凶频率和多态信息量；用内含子22例位检测及FⅧ基因内Ⅹba Ⅰ，BclⅠ，HindⅢ和（CA）n二核苷酸重复序列多态性位点和FⅧ基因外DXS52多态性位点对20个HA家系进行间接基因诊断。结果ⅩbaⅠ多态性位点的基因频率和多态信息量分别是0．5475和0．4955；20个HA家系中，7个为内含子22倒位，13个非倒位家系中有6个家系Ⅹba Ⅰ均提供多态信息，其中2个家系只能用Ⅹba Ⅰ作出分子诊断，诊断率达46．15％；两个或两个以上连锁分析方法均提供多态信息的有8个家系。结论改进的FⅧ基因内Ⅹba Ⅰ多态位点是一个特异性高，信息量大的分子诊断标志。联合用22内含子倒位及Ⅹba Ⅰ等5种间接检测方法大大地提高了HA基因诊断率。是防止患儿出生，阻断致病基因传递的有效措施。     

直接核酸测序法进行血友病A携带者及产前诊断

目的：对一血友病AfHA)家系进行携带及产前诊断。方法：用活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(Fg)和血浆因子Ⅷ促凝活性(FⅧ：C)测定进行表型诊断；用FⅧ内含子22倒位直接检测以及FⅧ基因内外4个位点的多态性进行遗传连锁分析：用核酸直接测序法对FⅧ各外显子及其侧翼序列进行检测。结果：表型检测证明先证为重型HA，其妹妹FⅧ：C正常；FⅧ内含子22倒位直接检测及FⅧ基因内外4个位点的多态性遗传连锁分析均未获得有诊断意义的信息；直接核酸测序证实先证及其妹妹FⅦ基因24号外显子第2209位氨基酸存在Arg→Gin(CGA→CAA)错义突变，酶切结果与此一致，其妹为携带，后胎儿羊水细胞DNA检测为正常男性。结论：FⅧ基因24号外显子错义突变Arg209Gln(CGA→CAA)是该HA先证发病的分子机制。此突变位点为国内首次报道，且该家系为国内首例运用直接核酸测序法进行HA携带及产前诊断的家系。     

两个特殊血友病A患者家系的基因诊断

目的 探讨特殊血友病A(HA)家系的基因诊断。方法 用内含子22倒位检测及FⅧ基因内外4个位点的多态性进行遗传连锁分析;用核酸直接测序法对FⅧ各外显子及其侧翼序列进行检测。结果 家系1先证者表型为重型HA,FⅧ内含子22倒位检测及FⅧ基因内外4个位点的多态性遗传连锁分析未获得诊断信息;直接核酸测序证实先证者及其妹FⅧ基因24号外显子第2209位氨基酸存在R2209Q错义突变,后者胎儿DNA检测为正常男性。家系2中HA先证者已去世,一名要求做携带者检测的女性表型正常,内含子22倒位检测及直接核酸测序没有发现基因缺陷,用FⅧ基因内外4个位点的多态性遗传连锁分析均显示该成员未携带血友病A基因。结论 联合应用直接核酸测序法及多态性遗传连锁分析可以对特殊血友病A家系进行基因诊断。     

凝血因子Ⅷ内含子X ba Ⅰ多态位点检测及其在血友病A产前诊断中的应用

目的建立凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子22的 Xba Ⅰ多态位点高特异的基因连锁分析法,并应用于血友病 A(HA)家系中孕妇携带者检测及产前基因诊断。方法用长距离 PCR 特异性扩增206个无血缘关系个体中 FⅧ基因内含子226.2 kb 片段并进行Ⅹba Ⅰ酶切,计算Ⅹba Ⅰ多态性位点的基因频率和多态信息量;用内含子22倒位检测及 FⅧ基因内Ⅹba Ⅰ,Bcl Ⅰ,Hind Ⅲ和(CA)n 二核苷酸重复序列多态性位点和 FⅧ基因外 DXS52多态性位点对20个 HA 家系进行间接基因诊断。结果ⅩbaⅠ多态性位点的基因频率和多态信息量分别是0.5475和0.4955;20个 HA 家系中,7个为内含子22倒位,13个非倒位家系中有6个家系Ⅹha Ⅰ均提供多态信息,其中2个家系只能用Ⅹba Ⅰ作出分子诊断,诊断率达46.15%;两个或两个以上连锁分析方法均提供多态信息的有8个家系。结论改进的 FⅧ基因内Ⅹba Ⅰ多态位点是一个特异性高,信息量大的分子诊断标志。联合用22内含子倒位及Ⅹba Ⅰ等5种间接检测方法大大地提高了 HA 基因诊断率,是防止患儿出生,阻断致病基因传递的有效措施。     

血友病A／B的携带者和产前诊断研究

目的：建立一套简易、快速且准确率高的血友病携带者和产前诊断体系。方法：对血友病A（HA）家系采用长距离聚合酶链反应（LD-PCR）及序列特异PCR进行F8基因内含子22及内含子1倒位检测。对有家族史的HA家系可联合F8基因内外的8个多态性位点进行遗传连锁分析．产前诊断加测性别位点（Amelo）。而对散发家系，则通过直接核苷酸测序查找先证者的基因突变，继而对家系女性成员进行携带者与产前诊断。对血友病B（HB）家系，采用直接核苷酸测序法确定其基因突变．结果：100个HA家系中。22例先证者的F8基因内含子22倒位检测结果为阳性；2例患者母亲为F8基因内含子1倒位的携带者：对有家族史的家系，综合应用倒位检测和遗传连锁分析，携带者与产前诊断率均为100％。34个HA散发家系除2个家系外均可找到致病突变：发现可能携带者105例，产前诊断65例，总诊断率为95．9％：23个HB家系中19个家系通过直接测序可找到突变．而联合F9基因外6个STR位点对HB家系进行遗传连锁分析，发现31例可能携带者及需产前诊断者16例，总诊断率为95．7％。结论：F8基因内含子22及1倒位筛检联合F8基因内、外多个位点的遗传连锁分析．可作为HA的携带者检测及产前诊断的方法；直接核苷酸测序可确定F9基因突变．而联合基因外多个多态性位点检测并进行遗传连锁分析．是HB携带者检测及产前诊断的简便、快速方法。     

临床不同背景情况下血友病A的产前诊断方案

目的建立临床不同背景情况下HA患儿产前诊断方案.方法对前来要求作HA产前诊断的15例孕妇进行遗传咨询,根据孕周和临床资料不同采取不同诊断方法.孕妇孕周＜23周,有先证者且已明确基因突变类型,抽羊水进行直接基因诊断和间接遗传连锁分析;有先证者但未明确基因突变类型,抽脐血进行间接遗传连锁分析和FⅧ活性检测;孕妇孕周＞23周且无先证者,抽脐血做FⅧ活性检测和性别染色体检查,但不能诊断携带者.直接基因诊断采用长距离PCR技术,对F8基因内含子22和内含子1倒位进行检测,找不到倒位者,行核苷酸测序;连锁分析采用F8基因内外的7个位点(DXS1108,F8Civs13,INTRON22,DXS1073,DXS9901,DXS15,DXS8069)以及性别位点(Amelo).产前诊断标本均需做母血污染鉴定.结果 15例产前诊断标本均无母血污染.明确诊断血友病A胎儿5例,其中脐血FⅧ活性＜1%的3例,1例伴21三体;F8基因22内含子倒位1例;F8基因23外显子错义突变p.Arg2182Cys 1例.结论对临床不同背景情况下采取不同方案进行HA产前诊断,可提高HA患儿检出率和准确性,最大程度地预防出生缺陷儿的发生.     

血友病携带者与产前基因诊断

目的建立1种简便、快速的血友病携带者检测与产前诊断体系。方法对38个血友病A家系,用长链PCR及序列特异PCR作F8基因内含子22及1倒位检测;有家族史家系可联合F8基因内外的8个多态性位点进行遗传连锁分析,DXS 52(ST14)位点多态性以PCR产物凝胶电泳法检测,7个STR位点(F8C ivs13、CA22、DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073、DXS1108)的多态性以多重荧光PCR法检测,产前诊断加用性别位点(Amelo);对于散发家系,通过直接核苷酸测序查找先证者的基因突变,继而对家系女性成员作携带者与产前诊断。对12个血友病B家系采用直接核苷酸测序法确定基因突变,多重荧光PCR法检测F9基因外6个STR位点(DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXS8013、DXS1227、DXS102)的多态性。结果38个血友病A家系中,10名先证者的F8基因内含子22倒位检测为阳性,1例先证者为F8基因内含子1倒位阳性,对于有家族史的家系,综合应用倒位检测和遗传连锁分析,携带者与产前诊断率均为100%;4个散发家系均可找到致病突变;38个血友病A家系的携带者及产前诊断总诊断率为94.81%。12个血友病B家系中有10个家系通过直接测序可找到突变,联合F9基因外6个STR位点对血友病B家系的遗传连锁分析的可诊断率为96.88%。结论F8基因内含子22及1倒位筛检联合F8基因内、外多个位点的遗传连锁分析可以进行血友病A的携带者及产前诊断;直接核苷酸测序可确定F9基因突变,而联合基因外多个多态性位点检测并进行遗传连锁分析,是血友病B携带者检测与产前诊断的简便、快速的方法。     

血友病A携带者检测与产前诊断

目的 建立简便、快速的血友病A携带者检测与产前诊断体系。方法 用PCR方法直接检测FⅧ内含子22倒位或对FⅧ基因内的BclⅠ位点、内含子13和22中STR和FⅧ基因外的DXS52（ST14）位点的多态性进行遗传连锁分析。结果 应用内含子22例位的直接诊断率为47．6％;Bcl Ⅰ位点的可诊断率为27．8％;内含子13和22中STR的可诊断率分别为28．6％及29．4％;DCS52的可诊断率为81．3％;综合应用直接诊断和间接遗传连锁分析,对21个家系进行检测,可诊断率为94．7％。结论 血友病A的携带者检测与产前诊断可先进行内含子22倒位的检测,若结果为阳性即可作出诊断;若内含子22例位的检测结果为阴性,则可利用FⅧ基因内、外的多个位点多态性结果进行遗传连锁分析,以作出最终的诊断。     

因子Ⅷ基因内二核苷酸重复序列在检测血友病A携带者中的意义

目的 应用FⅧ基因内含子13（CA）n及内含子22（GT）n(AG)n两位点多态性的单倍体分析，对血友病A（HA）家系进行携带者的检测。方法 采用PCR法扩增FⅧ基因内13（CA）n及22（GT）n(AG)n的多态性片段（Amp-FLP)，银染色法显示扩增效果。结果 35个HA家庭中11个有家族史，此11个HA家系有21位女性（包括1例女性患者），检出携带者14人，正常4人，不能确定3人，8个家系可用此法诊断，可诊断率72．7％。结论 银染色法与Amp-FLP结合，在保证HA携带者检出结果可靠的同时，更具有省时、操作简单、无放射线污染的优点。     

倒位PCR技术在血友病A基因诊断中的应用及改进

目的 对倒位PCR(I-PCR)技术进行改进并应用于血友病A凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因倒位突变的检测,探讨其产前诊断价值.方法 选取了8个无血缘关系的血友病A家系,应片j已改进的I-PCR技术直接检测FVS基因第22内含子倒位.对2名孕妇分别于妊娠22及26周抽取胎儿脐静脉血,在检测脐血血浆FⅧ活性的同时应用I-PCR技术进行产前FⅧ基因突变检测.结果 8个家系中检出4个家系为FⅧ基因倒位;根据FⅧ活性及基因突变检测结果 ,2名胎儿均诊断为正常胎儿.1名已出生.经随访与产前诊断结果 相符合.结论 应用I-PCR技术可以快速有效地进行血友病A FⅧ基因倒位突变的检测并可作为产前诊断的辅助手段.     

甜菜碱提高长距离PCR扩增效率的研究

目的:利用甜菜碱优化长距离PCR(LD-PCR),提高血友病A(HA)基因倒位检测效率。方法:在LD-PCR反应体系中加入DMSO、甘油及不同浓度的甜菜碱进行LD-PCR扩增,比较扩增结果。用甜菜碱优化LD-PCR检测正常人、不同程度HA患者及携带者的FⅧ基因是否存在FⅧ基因22号内含子(IVS22)倒位。结果:在反应体系中加入甜菜碱可获得更好的LD-PCR扩增结果;甜菜碱优化LD-PCR的最佳终浓度为0.8～1.8mol/L;应用甜菜碱优化LD-PCR检出3例HA患者、2例携带者和1例可疑携带者FⅧ基因有IVS22倒位。结论:一定浓度的甜菜碱可以显著提高LD-PCR的扩增效率,提高检测出HA患者的FⅧ基因IVS22倒位的效率。     

长距离PCR检测重型血友病A病人凝血因子Ⅷ基因倒位

为了筛查山东省重型血友病A(hemophiliaA，HA)凝血因子Ⅶ基因倒位的患并检出携带，采用长距离DNA扩增(LD-PCR)方法，以0．6％琼脂糖凝胶电泳技术，检测临床上确诊的55例重型HA患及其家系成员中是否存在凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因倒位。电泳出现11kb带，示凝血因子Ⅷ基因倒位；12kb带，示非倒位；这两条带同时出现为凝血因子Ⅷ基因倒位携带。结果表明：55例无亲缘关系的重型HA患中，发现22例患(或家系成员)有凝血因子Ⅷ基因倒位，占重型HA患的40%；15个家系中查出基因倒位携带5名。结论：运用LD-PCR技术可以准确、简便、快速地检测重型血友病A患是否存在凝血因子Ⅷ基因倒位。     

BclⅠ和HindⅢ位点在家系性血友病A基因诊断的意义

本研究旨在探讨FⅧ基因内含子18的BclⅠ及内含子19的HindⅢ多态性位点在血友病A(haemophiliaA,HA)患者及家系成员的基因诊断与携带者检出中的应用价值。对8个HA患者及其家系成员45人运用聚合酶链反应-限制性片断多态性(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法对X染色体FⅧ基因内含子18的BclⅠ及内含子19的HindⅢ位点进行多态性分析。应用中国遗传咨询网在线家系图绘制工具PediDraw软件绘制家系图。结果表明,联合检测BclⅠ及HindⅢ位点可对8个HA家系中的5个作出诊断,诊断率约为62.57%,且有2个家系同时伴有2个位点的突变。该8个家系11名可疑携带者中6名可作出携带者诊断,携带者的检出率为54.5%。结论:联合运用BclⅠ及HindⅢ位点进行HA患者家系分析可提高HA患者及携带者的诊断率。