PPARγ基因靶向shRNA真核表达载体的构建及表达

目的研究短发夹RNA(shorthairpin RNA,shRNA)真核表达载体在人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendo-thelial cell,HUVECs)中对人过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因表达的抑制作用。方法设计3条靶向PPARγ的shRNA,经退火成互补双链,克隆到质粒pGPU6/GFP/Neo中构建重组载体,经酶切鉴定和测序确认后,将3个重组表达载体转染到HUVECs,利用Western blot检测并筛选出抑制效果最好的重组表达载体。结果通过酶切鉴定和测序分析,靶向PPARγ的3个pGPU6/GFP/Neo-shR-NA重组载体构建成功,Western blot结果显示pGPU6/GFP/NeoshRNAPPARγ3可有效抑制高糖诱导HUVECs中PPARγ基因的表达,抑制率为63.2%。结论 PPARγ基因靶向shRNA真核表达载体构建成功,且能有效抑制HUVECs中PPARγ基因的表达。     

SARI基因真核表达载体的构建及稳定转染HeLa细胞系的建立

目的构建人SARI基因真核表达载体,并建立稳定转染的HeLa细胞系。方法采用RT-PCR技术从正常人外周血单个核细胞cDNA文库中扩增SARI基因序列,连接插入至pCMV-N-Flag真核表达载体,并对重组质粒进行酶切及测序鉴定;阳离子聚合物介导重组质粒转染HeLa细胞后,用G418抗生素筛选稳定转染的细胞系。间接免疫荧光检测Flag-SARI融合蛋白在HeLa细胞系中的表达定位。RT-PCR及Western blot检测SARI mRNA及蛋白的表达变化。结果双酶切和DNA测序表明pCMV-Flag-SARI真核表达质粒构建成功。经G418筛选后,RT-PCR和Western blot表明,转染重组质粒的HeLa细胞系中SARI mRNA及蛋白的表达明显升高。间接免疫荧光结果显示,Flag-SARI融合蛋白在HeLa细胞系的胞质和胞核中均有表达,且胞质荧光信号强于胞核。结论成功构建pCMV-Flag-SARI真核表达载体,表达的FlagSARI蛋白主要定位于HeLa细胞系的胞质中。     

人survivin基因反义真核表达载体的构建及初步鉴定

目的 构建人survivin基因反义真核表达载体。方法 采用分子克隆技术。用SacⅠ和SacⅡ双酶切pGEM-T Easy-survivin．然后将该片段反向插入真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点。最后对产生重组子进行琼脂糖凝胶电泳。结果 经琼脂糖凝胶电泳鉴定，将目的片段成功的连接到pIRES2-EGFP上。结论 成功地将survivin目的片段反向插入到pIRES2-EGFP中，构建了人survivin反义真核表达裁体pIRES2-EGFP-survivin。     

携带人PPARα基因高效真核表达载体的构建及其意义

目的构建可以高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体(αhPPARα)的真核细胞表达载体,为筛选作用于PPARα受体的药物提供分子平台。方法将HepG2细胞总RNA经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆hPPARα全长基因,用BamHⅠ、SalⅠ双酶切后,与相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建phPPARα-IRES2-EGFP重组质粒,用酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARα基因的完整性和可靠性;重组质粒转染293细胞,荧光显微镜观察EGFP报告基因表达强度,并对转染细胞的hPPARα表达进行荧光定量PCR及免疫细胞化学检测。结果经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPARα的高效表达。结论成功构建重组质粒phPPARα-IRES2-EG-FP,为基于hPPARα受体靶点的药物筛选平台的建立提供了高效表达hPPARα的重组载体。     

CYP2C19基因多态性真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建细胞色素P450CYP2C19*1、*2、*3真核表达载体,并分别转染人肝癌细胞(HepG2),建立高表达目的基因的稳定转染细胞系。方法:应用化学合成法合成CYP2C19*1(野生型)序列,再以此为模板,体外定点突变PCR法构建*2、*3(突变型)。DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.l(-),经菌落PCR、酶切以及测序鉴定后,脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR、Western Blot分别检测CYP2C19*1、*2、*3 mRNA以及蛋白的表达。结果:成功构建了pcDNA3.1(-)-CYP2C19*1、*2、*3表达质粒,并建立了相应稳定转染细胞系。进一步的RT-PCR和Western Blot检测结果表明,目的基因均得到了稳定的表达。结论:人CYP2C19*1、*2、*3稳定表达细胞系为研究创新药物或新药先导化合物临床前代谢性质的筛选和预测以及为临床潜在药物相互作用提供了有效实验平台。     

人雌激素受体β绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人雌激素受体β(ERβ)绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体,并稳定转染乳腺癌MCF-7细胞。方法通过双酶切将pCMV5-hERβ中的人ERβcDNA克隆到pEGFP-C3中,构建并鉴定重组质粒pEGFP-hERβ,然后转染乳腺癌MCF-7细胞,采用G418(500μg/mL)筛选出稳定转染的细胞系,在荧光显微镜下观察融合蛋白质在真核细胞内的表达分布,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测ERβ的mRNA转录水平。结果成功构建重组表达载体pEGFP-hERβ,有效转染并筛选出稳定转染ERβ基因的MCF-7细胞系,外源性ERβ基因在MCF-7细胞中获得了有效转录,并在细胞质和细胞核中均广泛分布。结论建立了稳定表达ERβ的MCF-7细胞系,为筛选ERβ调节剂和进一步研究ERβ在乳腺癌中的作用及其机制奠定基础。     

人转化生长因子β1质粒真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定人转化生长因子β1(TGF-β1)基因真核表达栽体。方法设计含XbaI和XhoI酶切住点的TGF-β1cDNA引物，采用RT-PCR法，扩增TGF-β1cDNA片段，纯化PCR产物，XbaI和XhoI双酶切并连接至pcDNA3。转化感受态大肠杆菌DH5α。酶切鉴定阳性重组子，并进行序列测定。结果琼脂糖凝胶电泳显示，用XbaI和XhoI双酶切后可形成两条带，分子量分别为1．2kb和5．38kb。符合物理图谱，表明栽体成功构建，并且测序结果与预期结果完全一致。结论成功构建了人TGF-β1基因真核表达栽体。     

preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达

目的研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)的跨膜特性。方法依据乙肝病毒大外膜蛋白的计算机模拟图将其分为分别命名为HBsAg1(1-174),HBsAg2(1-245),HBsAg3(1-294),HBsAg4(1-341),HBsAg5(1-373),HBsAg6(1-400),最终累加成一条连续的长链状态,贯穿在细胞内外形成四次跨膜区,并以此6个片段为模板设计6对引物。从含有乙肝病毒外膜蛋白基因的质粒pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg中扩增出前S1,S2基因,采用重叠延伸PCR方法连接人尿激酶原信号肽+6×组氨酸(His)+前S1蛋白、前S2蛋白+HBsAg(1～6)+血细胞凝集素(HA);PCR产物经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入经同样处理的真核表达载体pIRES2-EGFP,构建含有Pro-UK,6×His,preS1,preS2,HBsAg跨膜序列及HA的表达载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA,该表达载体应能够共表达乙肝病毒外膜蛋白和绿色荧光蛋白。采用阳离子脂质体法将构建好的表达载体转染293细胞,经G418加压筛选阳性克隆,并进一步通过荧光观察、蛋白质免疫印迹、免疫双标等方法检测目的蛋白在293细胞的表达。结果 PCR结果显示,电泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600,810,957,1098,1194和1275 bp理论值。酶切鉴定正确的重组质粒测序结果与预期序列完全一致。转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1～HBsAg6的293细胞,呈亮绿色,细胞形态良好,荧光表达强度高;Western印迹结果显示,在相对分子质量31 000,34 000,44 000,47000,54 000和60 000处有明显的阶梯状蛋白信号,条带清晰并与理论值相一致。结论成功构建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表达载体,并获得了能共表达乙肝外膜蛋白跨膜序列和绿色荧光蛋白的293细胞系。     

猪干扰素-γ基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆猪的干扰素-γ基因(PoIFN-γ),构建重组真核表达质粒,转染细胞。方法从猪的肝脏组织中提取出基因组DNA,以其为模板通过长链PCR扩增出干扰素-γ全基因。将猪干扰素γ基因克隆到真核表达载体PCI-neo载体中,组装成真核表达载体PCI-neo-PoIFNγ。利用脂质体转染法将重组载体PCI-neo-PoIFN-γ转染入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中,在G418的存在下进行筛选培养。结果构建出重组真核表达质粒,获得转染细胞系。结论成功克隆了猪的干扰素-γ基因,获得了转染细胞系。     

携带p16基因真核表达质粒载体的构建

p16基因定位于9p21,编码一个16kD的蛋白质,此蛋白质是一种细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）的抑制因子（CDK4I）。有研究发现将全长p16基因的cDNA导入无p16基因的人类胶质瘤细胞中可显抑制其生长。因此,构建p16真核表达载体,针对恢复p16基因功能的基因治疗策略,将对肿瘤的治疗产生积极的意义。     

人神经营养素-3基因克隆及原核表达

目的通过基因工程的方法克隆人神经营养素-3成熟蛋白(hNT-3)的基因,并在大肠杆菌中进行表达,为研究hNT-3的生物学作用提供材料。方法以人胎脑cDNA为模板,采用PCR方法扩增hNT-3基因,并将其克隆在pGEM-T载体上,将经过序列分析确定的hNT-3基因插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达载体pGEX-6p-1-NT-3,用SDS-PAGE法测定其在大肠杆菌中的表达。结果经序列测定分析,所克隆DNA片断与文献发表序列(GenBank,MW002527)同源性为99.7%,并获得了高效表达hNT-3蛋白的重组菌株。结论体外成功扩增hNT-3基因,并在原核细胞中高效表达。     

含MGMT及增强荧光蛋白真核表达载体的构建

目的 克隆O^6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）基因,测序鉴定正确后构建含增强荧光蛋白（EGFP）的真核表达载体.方法 利用RT-PCR从人正常肝细胞中克隆MGMT并与克隆载体pGEM-T载体相连接.经PCR、酶切及测序鉴定证明克隆成功后用限制性内切酶切下MG-MT片段,同时酶切载体pIRES2-EGFP.凝胶纯化回收后重组构建真核表达载体并鉴定.结果 测序结果显示所克隆的编码序列与GeneBank公布MGMT cDNA序列一致.真核表达载体的PCR及酶切鉴定结果与预期结果一致.结论 成功克隆了耐药基因MGMT并构建了含EGFP编码序列的真核表达载体pIRES2-MGMT-EGFP,为MGMT的进一步相关研究奠定了坚实基础.     

STAT3基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建携带信号传导和转录激活子3(STAT3)基因短发夹状干扰RNA(shRNA)的真核表达载体.方法 从GenBank STAT3 mRNA上寻找到3条符合特征的靶序列,合成靶序列的DNA寡核苷酸链,合成双链DNA,并和BamH Ⅰ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/Neo载体质粒连接产生重组质粒,PCR筛选阳性克隆,并行测序鉴定.重组质粒转染大肠癌LoVo细胞,RT-PCR检测STAT3的表达.结果 PCR和测序证实重组质粒构建正确.3种重组质粒对大肠癌LoVo细胞STAT3的表达有较强的抑制作用.结论 成功构建了携带有STAT3基因的短发夹状干扰RNA的重组质粒.     

五甲基槲皮素对3T3-L1前脂肪细胞分化及对脂肪细胞PPAR-γ和脂联素mRNA表达的影响

目的：比较PMQ和罗格列酮3T3-L1前脂肪细胞分化及脂肪细胞PPA脚和脂联素mRNA表达的影响。方法：待细胞融合2天后，加用胰岛素诱导3T3-L1前脂肪细胞分化。分化的过程中全程分别给予0.1，0.3，1,3，10，30，100μM的五甲基槲皮素和1，10μM的罗格列酮。诱导分化第12天，油红O染色，异丙醇洗脱后，570nm波长测值，     

重组人肝细胞生长因子真核表达载体的构建

目的构建重组人肝细胞生长因子(rhHGF)的真核表达载体,为后续毕赤酵母蛋白高效表达提供基础。方法根据酵母表达偏爱密码子合成rhHGFcDNA全长序列,将rhHGF和pGAPZαA质粒双酶切后行连接转化,构建穿梭载体pGAPZαA-rhHGF,并鉴定。结果重组真核表达载体pGAPZA-rhHGF经限制性内切酶分析,与理论值相符,测序结果未见碱基变异。结论成功构建了pGAPZαA-rhHGF真核表达载体,为后续毕赤酵母高效表达rhHGF蛋白提供了可行性。     

pcDNA3.1(+)/人前脑啡肽原基因真核表达载体的构建

<正>目前慢性疼痛及癌症晚期疼痛的治疗方法仍主要依靠三阶梯药物疗法,三阶梯药物中以外源性镇痛药吗啡为主,其不良反应大,成瘾性高,限制了其大量使用,因此研究新的镇痛药及新的镇痛方法成为最近研究的热点。20世纪50年代以来,人们着力于研究新的镇痛物质,之后内源性镇痛物质[1]的发现及基因克隆技术[2]的应用为开辟新的镇痛研究奠定了基础。     

MCHR1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建有效针对小鼠黑色素浓集激素受体1(melanin-concentrating hormone receptor 1,MCHR1)的shRNA(small hairpin RNA)真核表达载体。方法设计合成3条小鼠MCHR1基因的shRNA序列以及1条无同源性的shRNA序列作为阴性对照,与质粒重组构建sh-MCHR1干扰载体,并进行菌液PCR和DNA测序鉴定;脂质体法转染小鼠3T3-L1细胞后观察MCHR1 mRNA和蛋白表达的变化。结果经菌液PCR及DNA测序鉴定表明各shRNA载体构建成功;转染3T3-L1细胞后,与空载体组相比,阴性对照组MCHR1 mRNA和蛋白的表达均无明显差异,但实验组3种干扰载体均能显著抑制MCHR1 mRNA和蛋白的表达(P<0.05),且3种载体的抑制程度有一定的差异,以sh-MCHR1-1载体沉默效果最佳。结论 sh-MCHR1干扰载体构建成功,为进一步探究MCHR1与肥胖症之间的关系奠定了实验基础。