自杀基因联合放射对食管癌细胞株的实验研究

目的自杀基因具有能将无细胞毒性的前体药物转化为有细胞毒性作用的药物而使细胞死亡,通过观察大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶/氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因系统对食管癌EC109细胞杀伤效应及与放射联合应用对食管癌肿瘤细胞协同杀伤效应。方法采用PCR方法从大肠杆菌基因组DNA中扩增出CD基因;构建重组真核载体pcDNA3.1-CD;用脂质体转染法转染EC109细胞;观察CD/5-FC体系对EC109细胞的杀伤效应和旁观者效应及对放射的增敏效应。结果RT-PCR分析结果表明CD基因已转入EC109细胞并表达。离体实验证实5-FC对转CD基因后的食管癌细胞株有明显的细胞毒作用,含5%的转基因食管癌细胞加入5-FC后的细胞存活比率为41.8%±14.2%,低于对照组的94.6%±4.3%结果(t=3.14,P<0.05);加入10%的转基因细胞的存活比率为37.8%±4.4%,低于对照组的95.6%±5.4%结果(t=9.75,P<0.01)。CD/5-FC体系对肿瘤细胞放射增敏效果明显,加前药5-FC及放射组细胞存活曲线低于单纯加前药5-FC对照组或单纯放射对照组,重复测量数据方差分析结果显示F=11.50,P<0.01;治疗组分别与5-FC对照组及单纯放射对照组相比F值分别为4.11、10.53,P值分别<0.05、0.01。结论CD/5-FC体系的旁观者效应和放射增敏效果明显。     

胞嘧啶脱氨酶基因联合5-Fc治疗结肠癌的实验研究

目的研究胞嘧啶脱氨酶基因(CD)联合前体药物5-氟胞嘧啶(5-Fc)对结肠癌细胞的生长抑制作用。方法应用逆转录病毒介导的方法,将逆转录病毒载体pLXSN中含有大肠杆菌CD基因的重组质粒pCD2转染到病毒包装细胞PA317后,感染人结肠癌细胞株SW1116。对转基因的细胞进行RT-PCR检测和体内外药物敏感实验。结果获得了稳定表达EC—CD基因的结肠癌细胞株SWCD2,与野生型SW1116细胞相比,SWCD2细胞对基本无毒性的原药5-Fc的敏感性增加,50％细胞生长抑制率(IC50)浓度由野生型SW1116细胞的16000μmol／L降低到SWCD2的66μmol／L。经5-Fc治疗后,SWCD2细胞的裸鼠移植瘤生长明显缩小。结论CD基因联合5-Fc对人结肠癌细胞具有实验性基因治疗作用。     

癌胚抗原启动子控制胞嘧啶脱氨酶基因体外对结肠癌细胞专一性杀伤

目的：研究癌胚抗原（CEA）启动子是否能控制大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（EC－CD）基因在CEA阳性结肠癌细胞中专一性表达和杀伤结肠癌细胞。方法：构建由CEA启动子驱动的含EC－CD基因的重组腺病毒载体AdCEACD与由巨细胞病毒（CMV）启动子驱动的含EC－CD基因的腺病毒载体AdCMVCD，分别感染CEA阳性的人结肠癌细胞株Lovo细胞和CEA阴性的Hela细胞，用RT－PCR法检测受染细胞中EC－CD基因的表达，并用MTT法检测感染后细胞对5－氟胞嘧啶（5－FC）的敏感性。结果：Lovo细胞在AdCMVCD与AdCEACD感染后均有EC－CDmRNA表达，且对5－FC的敏感性明显增强，Hela细胞在AdCMVCD感染后有EC－CDmRNA表达，对5－FC的敏感性增强，而在AdCEACD感染后则没有EC－CDmRNA表达，5－FC对其亦无杀伤作用。结论：CEA启动子能够控制EC－CD基因专一性地在CEA阳性的结肠癌细胞中表达，从而实现EC－CD基因的靶向性作用。     

胞嘧啶脱氨酶/氟胞嘧啶体系对人乳腺癌基因的实验治疗作用

目的：研究胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）／氟胞嘧啶（５－ＦＣ）体系对人乳腺癌的实验治疗作用。方法：应用ＭＴＴ法测定人乳腺细胞对５－ＦＣ的敏感性。结果：５－ＦＣ对导入ＣＤ基因的人乳腺癌细胞有明显的细胞毒作用,而对未导入ＣＤ基因的人乳腺癌细胞的毒性较低,５－ＦＣ对导入ＣＤ基因的人乳腺癌细胞的ＩＣ５０分别为４１８μｇ／ｍｌ和１４２９μｇ／ｍｌ。结论：ＣＤ／４－ＦＣ体系对体外转基因的人乳腺癌细胞具有抗肿瘤作用。     

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因，构建真核表达载体，本研究拟探索该基因在肿瘤基因治疗中的应用基础。方法 根据GenBank数据库提供的CD基因核苷酸序列，设计并合成一对引物，采用PCR方法，从大肠杆菌基因组DNA中扩增出CD基因，并与pcDNA3．1定向连接，构建受控于人巨细胞病毒启动子的重组真核载体pcDNA3．1-CD，并用限制性内切酶、PCR和DNA测序进行鉴定。结果克隆了大肠杆菌CD基因，并构建了真核表达载体，经限制性内切酶酶切、PCR扩增和DNA测序证实了其正确性。结论 pcDNA3．1-CD真核表达载体构建成功。     

5-氟胞嘧啶对表达胞嘧啶脱氨酶的人肾母细胞瘤裸鼠异种移植瘤的疗效

目的　以人肾母细胞瘤裸鼠异种移植瘤模型 ,研究 5 氟胞嘧啶 (5 FC)作为原药对表达胞嘧啶脱氨酶 (CD)的肾母细胞瘤治疗 (以下简称CD/ 5 FC)的作用。方法　 1例低分化肾母细胞瘤组织 ,移植于无胸腺BALB/c裸鼠 ,经连续传代 ,建立了人肾母细胞瘤异种移植瘤模型。以腺病毒为载体 ,分别建立CD基因 (Ad/CMV CD)和lac基因 (Ad/CMV lac)的表达载体。瘤内注射基因表达载体 ,使基因转导入肿瘤细胞。用RT PCR检测转导基因在瘤细胞内的表达。腹腔注射 5 FC ,5 0 0mg·kg-1·d-1,连续 10d ,观察移植瘤生长情况。结果　经 5 FC治疗的小鼠 ,表达lac基因的移植瘤生长情况与未转导基因的移植瘤并无两样 ;表达CD基因的移植瘤生长则受到显著抑制。根据接种肿瘤后 8周的肿瘤重量 ,5 FC治疗对CD基因转导的移植瘤生长抑制率为 6 5 %。病理检查可见瘤细胞坏死 ,细胞器出现空泡。结论　在瘤内转导CD基因的基础上施以 5 FC治疗 ,对人肾母细胞瘤裸鼠移植瘤有明显疗效。     

CD基因转移及与放射联合对宫颈癌细胞株作用的体外实验研究

目的：研究胞嘧啶脱氨酶（CD）基因转移联合5－氟胞嘧啶（5－Fc）在体外对人宫颈癌细胞株Hela生长的影响及放射增敏作用。方法：将CD基因转入Hela细胞，加入含5－Fc的培养基，联合放射，采用MTT法和克隆形成试验分别比较单一CD／5－Fc体系及与放射治疗联合对该细胞生长的影响。结果：5－Fc能显著抑制转入了CD基因的Hela细胞的生长，并能通过旁观者效应杀死基因转移细胞周围未转入该基因的细胞。CD／5－Fc体系联合放射作用于Hela细胞，其生长抑制强度与单一治疗相比显著增强，两者的联合作用具有协同效应（P＜0．05）。结论：CD基因转移联合5－Fc作用对Hela细胞具有显著的杀伤作用，对放射具有增敏作用。     

5—氟胞嘧啶对表达胞嘧啶脱氨酶的人肾母细胞瘤裸鼠异种移植瘤 …

OBJECTIVE: To study the effect of 5-fluorocytosine (5-FC) as prodrug in the treatment of Wilms' tumor xenografts transduced with cytosine deaminase (CD) gene. METHODS: An in vivo model of a poorly differentiated Wilms' tumor transplanted in nude mice was established. Expression adenoviral-vector of CD gene (Ad/CMV-CD) or lac gene (Ad/CMV-lac) was transduced to the tumor xenografts by intratumoral injections. Expression of the transduced genes were confirmed by RT-PCR. Mice with Wilms' tumor xenograft were treated with 5-FC (500 mg.kg-1.d-1 x 10 d). Tumor growth was monitored. RESULTS: The growth of tumor xenografts transduced with lac gene grew as quick as the untransduced ones. In contrast, the growth of the tumor xenografts transduced with CD gene was significantly inhibited as compared to untransduced and lac gene transduced xenografts. The average rate of inhibition was 65% according to the tumor weight at 8 wk. Cell necrosis was observed in the CD gene transduced tumors. CONCLUSION: Intratumoral cytosine deaminase gene transduction followed by systemic 5-fluorocytosine is effective in the treatment of Wilms' tumor.     

含胞嘧啶脱氨酶基因的靶向腺病毒载体的构建及应用

目的　建立癌胚抗原 (CEA )启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶基因 (CD )自杀基因的腺病毒载体AdCEACD ,使CD基因只能在CEA阳性的细胞中表达。方法　采用同源重组法在人胚肾细胞株 2 93细胞中重组腺病毒 ,用点杂交、PCR法进行鉴定 ,并进行纯化和滴度测定 ,分别感染CEA阳性和CEA阴性的细胞 ,采用MTT法检测感染细胞对 5 Fc的敏感性。结果　重组腺病毒中含有CEA基因及CD基因 ,纯化后滴度可以达到 5 .0× 10 11pfu/ml ,CEA阴性的Hela细胞感染AdCMVCD后对 5 Fc很敏感 ,而感染AdCEACD后不能被 5 Fc杀伤 ,与之相反 ,CEA阳性的Lovo细胞感染AdCMVCD和AdCEACD后有相似的表达活性 ,均对5 Fc敏感。AdCEACD/ 5 Fc系统有明显的“旁观者”效应。结论　本实验建立的CEA启动子驱动的含CD自杀基因的腺病毒载体AdCEACD ,能使CD基因专一性地在CEA阳性细胞中表达 ,有助于对CEA阳性的肿瘤细胞靶向性自杀基因治疗。     

胞嘧啶脱氨酶基因突变体D314A对人结肠癌细胞的抑制作用

目的：构建大肠埃希菌胞嘧啶脱氨酶（E. coli cytosine deaminase, ECCD）基因突变体:D314A: （即ECCD基因开放阅读框第314位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸）并研究其抗肿瘤作用。方法：构建含ECCD基因的真核表达质粒pcDNA3.1CDwt,应用点突变技术将pcDNA3.1CD中ECCD基因开放阅读框第314位氨基酸的碱基由A突变为C,即构成pcDNA3.1CDD314A。用LipofectamineTM2000将ECCD基因或:D314A: 基因转入人结肠癌细胞系LoVo细胞,以G418筛选出稳定表达的阳性克隆LoVoCDwt及LoVoCDD314A。应用MTT法检测ECCD基因及:D314A: 基因对LoVo细胞的直接杀伤作用及旁观者效应。结果：成功构建ECCD基因突变体:D314A: 并经测序确认。LoVo细胞转染ECCD基因及:D314A: 基因后均能表达相应的mRNA,LovoCDD314A细胞对5FC的IC50为(85.13±0.60) mmol/L,显著低于LoVoCDwt细胞的（689.76±0.45）μmol/L,(P=0.000);在旁观者试验中,当LoVoCDwt细胞和LoVoCDD314A细胞比例均为30%时,细胞存活率分别为(48.5±0.49)%与(17.3±0.40)%（P=0.000）。结论：ECCD基因突变体:D314A: 的抗LoVo细胞作用显著强于野生型ECCD基因,有望成为新的肿瘤基因治疗候选基因。     

AdTK治疗肺癌的实验研究

目的：构建含HSV—TK基因的重组腺病毒AdTK，在两种肺癌细胞和鼠肺癌模型中对AdTK／GCV系统进行抑瘤买验研究。方法：采用同源重组法构建AdTK，用MTT法测定AdTK／GCV系统对H460、PG49人肺癌细胞的生长抑制率，建立T739鼠肺癌模型，观察AdTK／GCV系统对瘤体大小及鼠存活期的影响。结果：成功构建AdTK，AdTK转染H460、PG49细胞后对细胞抑制率随AdTK、GCV及药物作用时间的增加而增高，有显著性差异，小鼠体内实验中观察到AdTK／GCV系统对鼠肺癌有明显生长抑制作用，且明显延长了小鼠的存活期。结论：本文建立的AdTK／GCV系统在体内外对肺癌细胞均有明显抑制作用，为AdTK用于基因治疗奠定了基础。     

氟脲脱氧核苷, 顺铂配合外照射治疗鼻咽癌的临床研究

 目的　观察比较氟脲脱氧核苷 ( FUDR)或氟脲嘧啶 ( 5 - FU)联合顺铂 ( DDP)配合外照射治疗鼻咽癌的近期疗效和急性毒副反应。方法 46例 期以上有颈部淋巴结转移病灶的鼻咽癌患者被随机分为 FUDR组和 5 - FU组。放疗前分别给予 FUDR1 0 0 0 mg/日 ,DDP2 0 mg/日或 5 -FU1 0 0 0 mg/日 ,DDP2 0 mg/日 ,静脉滴注 ,连续 5天。休息 3天后开始放疗 ,两组放疗剂量和方法相同。结果两组患者的总有效率 ( CR+ PR)分别为 96% ( FUDR组 )和 91 % ( 5 - FU组 ) ,无显著差异。重度口咽炎的发生率 FUDR组为 30 % ,5 - FU组为 65 % ( P<0 .0 5 ) .结论 FUDR加 DDP与 5 - FU加 DDP用于鼻咽癌诱导化疗相比较具有毒副作用小 ,患者易耐受的优点。     

介入治疗配合适形放疗治疗不适合手术原发性肝癌的临床研究

目的: 为探讨合理的TACE与3DCRT的结合方式、剂量分割方式和总剂量,为原发性肝癌的综合治疗提供循证医学依据和标准模式。 方法: 60例原发性肝癌患者被随机分为3DCRT+TACE(治疗组30例)和单纯TACE(对照组30例),TACE先用顺铂(DDP)100mg、5氟脲嘧啶(5-Fu)1000mg,再将表阿霉素(EPI-ADM)50～100mg与超液化碘油10～30ml充分混合成乳剂缓慢注入,然后用1～2mm的明胶海绵栓塞供血动脉。对照组TACE2次,每次间隔4周,治疗组在TACE1次后1～3周行3DCRT。3DCRT采用6MVX射线,计划靶体积(PTV)单次剂量5Gy,5次/w,总DT55Gy。 结果: 治疗组近期疗效90%(27/30),对照组63.3%(19/30),两组差异有显著性意义(χ²=5.963P=0.015),1、2、3年生存率分别为:治疗组86.7%(26/30)、53.3%(16/30)、33.3%(10/30);对照组53.3%(16/30)、36.7%(11/30)、16.7%(5/30),中位生存期分别为:治疗组26.5个月(5.4～59.3个月)、对照组15.8个月(6.3～40.7个月),χ²=7.68P<0.01。合并门脉癌栓患者:综合组1、2年生存率分别为69%(9/13)、7.7%(1/13);对照组12.5%(1/8)、0%(0/8)中位生存期分别为:综合组13个月(5.4～25.5个月)、对照组8个月(6.3～12.6个月),P=0.0237。 结论: TACE+3DCRT对不宜手术的原发性肝癌疗效好,计划靶体积单次剂量为5Gy,5次/w,总D_T55Gy是可行的。当PTV>1000cm³     

术前配合放化疗治疗宫颈癌100例临床分析

目的:观察术前腔内后装配合VBP化疗方案治疗宫颈癌的疗效及毒副反应。方法:1996年~1998年1月住院宫颈癌患者100例,随机分为放化疗组50例(术前腔内放疗配合化疗),对照组50例(术前单纯腔内放疗),分析两组近期有效率、毒副反应及3、5、7年生存率。结果:放化疗组的近期有效率86%,对照组76%,(P<0.05)有显著性差异。放化疗组3、5、7年生存率分别为98%、94%、86%,对照组为94%、76%、58%。两组比较3年生存率无明显差异(P>0.05),5、7年生存率有显著差异(P<0.05)。研究组3、5、7年复发率分别为0%、5%、11%,对照组3、5、7年复发率分别为16%、24%、40%。两组比较3、5、7年复发转移率均有显著差异(P<0.05)。结论:宫颈癌术前放疗配合化疗、明显提高有效率及生存率,降低局部复发与转移。     

艾迪注射液配合放射疗法治疗食管癌临床疗效观察

目的:比较艾迪注射液加放疗与单纯放疗对食管癌的近期疗效及不良反应。方法:艾迪组43例放疗同期采用艾迪注射液60m l溶于5%葡萄糖注射液500m l中,静脉滴注,每天一次,疗程21天;对照组42例单纯放疗。结果:艾迪组近期有效率为79.1%,对照组为71.4%,统计学上差别无显著性(P>0.05),胃肠道及血液学不良反应,艾迪组均明显低于对照组(P<0.05)。结论:艾迪注射液配合放疗能有效降低食管癌放疗的不良反应。     

23例晚期胰腺癌三维适形放疗的疗效评价

目的:探讨三维适形放射治疗晚期胰腺癌的疗效。方法:23例晚期胰腺癌患者采用三维适形放射治疗,总量DT 60Gy-66Gy,分30次-33次,6周-7周内完成。结果:23例患者经放疗后1个月-3个月,经CT、 MRI复查肿瘤局部缓解率(CR PR)为:69．5％(16/23)。其中1例完全缓解,15例部分缓解。疼痛控制率(CR PR)为:83％(19/23)。1、2年生成率分别为:56．5％(13/23)、17％(3/23)中位生存期12．5个月。放疗副反应可以耐受。结论:三维适形放疗是晚期胰腺癌治疗的一种安全有效的姑息治疗手段。     

放射治疗后加化疗治疗中晚期鼻咽癌的临床观察

１９８９年３月至１９９１年１月，作者将经病理诊断且为初治的１６７例Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌病人，随机分为单纯放疗组和综合治疗组（放疗后加ＣＯＢ方案化疗），进行疗效对比。结果：单纯放疗组８８例的５年生存率为３０．７％，综合治疗组７９例为４０．５％；两个治疗组中的Ⅲ期病人，分别为３８．９％和５２．０％（Ｐ＞０．０５）；两组原发灶及颈淋巴结复发率，复发中位时间基本相同；两组Ⅲ期病人的远处转移发生率分别为２４．０％及３３．３％（Ｐ＞０．０５）；出现远处转移的中位时间，综合组比单纯放疗组延迟（Ｐ＜０．０５）；两组患者的主要死亡原因为复发和转移，两组死亡病例的中位生存期，综合组长于单纯放疗组（Ｐ＜０．０５）；远期后遗症的发生率，综合组高于单纯放疗组（Ｐ＜０．０１）。     

CD/5－FC体系对人乳腺癌基因治疗作用的实验研究

目的：探讨ＣＤ／５－ＦＣ体系对人乳腺癌的实验治疗作用。方法：应用ＭＴＴ法测定人乳腺癌细胞对５－ＦＣ的敏感性。结果：实验显示,５－ＦＣ对导入ＣＤ基因的人乳腺癌细胞有明显的细胞毒作用,而对未导入ＣＤ的人乳腺癌细胞的毒性较低,５－ＦＣ对导入和未导入ＣＤ基因的人乳腺癌细胞的ＩＣ５０分别为４１８μｇ／ｍｌ和１２４９μｇ／ｍｌ。结论：ＣＤ／５－ＦＣ体系对体外转基因的人乳腺癌细胞有一定的抗肿瘤作用。     

腺病毒介导的FasL基因转移及对胃癌细胞生长和凋亡的影响

目的：探讨FasL基因对人胃癌的作用以及FasL基因治疗胃癌的可能性。方法：通过腺病毒载体介导FasL基因转移到低水平表达FasL的人胃癌细胞系SGC－7901,对FasL基因的表达,细胞生长的抑制与机制和对肿瘤生长模型的治疗效果进行分析。结果：外源性FasL基因在靶细胞高水平的表达,显著抑制了SGC－7901的生长和集落形成,流式细胞仪检测显示细胞G1期阻滞并发生了凋亡。瘤内注射Ad-FasL对裸鼠体内移植瘤有一定的抑瘤作用。结论：FasL基因参与了肿瘤细胞凋亡的诱导,能抑制胃癌细胞的生长,因此该基因在肿瘤的基因治疗上有着广泛的应用前景。