短发夹RNA沉默血红素氧合酶-1基因表达对胃癌细胞系SGC-7901生物学行为的影响

目的 观察血红素氧合酶-1(HO-1)基因沉默对胃癌细胞系SGC-7901生长、增殖的影响.方法 构建靶向HO-1的短发夹RNA(shRNA-HO-1)干扰质粒转染人胃癌细胞系SGC-7901,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、细胞免疫化学分别在mRNA、蛋白质水平检测抑制效果.流式细胞仪和噻唑蓝(MTT)检测HO-1基因沉默后细胞的细胞周期和生长情况.结果 shRNA-HO-1在mRNA、蛋白质水平高效特异地抑制了细胞SGC-7901中HO-1的表达(抑制率分别为62.4%、67.6%);较对照质粒组,HO-1的表达被抑制后,G0/G1期细胞百分比明显减少(52.025±1.638比67.525±1.938,P<0.05),细胞生长受抑制[2.036±0.072比2.783±0.067(72 h A值),P<0.05].结论 shRNA-HO-1可有效抑制胃癌细胞中HO-1的表达;HO-1的表达减少抑制肿瘤细胞生长.     

shRNA抑制SGC7901胃癌细胞绿色荧光蛋白基因的表达

目的：观察针对绿色荧光蛋白(GFP)基因的发夹结构RNA(small hairpin RNA，shRNA)表达载体(SHi—pU6-GFP)对SGC7901胃癌细胞中GFP的抑制作用。方法：设计针对GFP基因的shRNA序列．构建SHi—pU6-GFP质粒。采用质粒pCX—GFP(5510bp)和含有鼠U6启动子pU6（3．3kb)质粒，应用Lipofectamine^TM2000将pCX-GFP质粒和SHi—pU6-GFP质粒转染SGC7901细胞。荧光显微镜观察转染效果和不同时间的转染效率。结果：质粒SHi-pU6-GFP经酶切电泳后，出现3．3kh和约350bp条带，与实验设计的针对GFP的shRNA长度相符。说明本实验已成功构建了针对绿色荧光蛋白GFP基因的SHi—pU6-GFP质粒。SGC7901细胞中观察到转染pCX—EGFP质粒和SHi—pU6-GFP质粒前后发绿色荧光的细胞数目明显减少：结论：shRNA可以有效地抑制SGC7901细胞中GFP基因的表达。     

HO-1与肿瘤的发生发展

血红素氧合酶（HO）是生物体内催化血红素分解代谢的限速酶。近年来发现,血红素氧合酶-1（HO-1）在许多重要的生理和病理过程中起调节作用,与肿瘤的发生发展密切相关。本文就HO-1与肿瘤发生发展的关系作一综述。     

靶向沉默SPHK1基因诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡

目的探讨用小干扰核酸（SmallinterferingRNA,siRNA）靶向沉默神经鞘氨酸激酶1（sDhingosinekinasel,SPHKl）基因敲除后对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响。方法人工化学合成SPHKlsiRNA和对照siRNA,分别转染胃癌SGC-7901细胞。Westernblot法检测SPHKl、Bcl-2和Bax蛋白的表达;流式细胞术（FlowCytometry,FCM）检测细胞凋亡的变化。结果SPHKlsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞后,SPHKl蛋白表达明显下调;与对照组相比,SPHKlsiRNA转染组Bcl一2蛋白表达下调了55％（P〈0．01）,Bax蛋白表达差异无统计学意义,Bcl-2／Bax比值下调54％（P〈0．05）;SPHKlsiRNA转染组早期凋亡细胞明显增多（P〈0．01）,晚期凋亡细胞无明显变化。结论SPHKl特异性siRNA可阻断SGC-7901细胞SPHKl蛋白的表达,并通过影响Bcl-2通路诱导细胞凋亡。     

PTEN基因对人胃癌细胞SGC-7901的生物学效应

目的 研究PFEN基因对人胃癌细胞SGC-7901增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法 将携带有PTEN基因的真核表达载体pBabe-Puro-PTEN以及pBabe-Puro，以脂质体介导的基因转染方法转入SGC-7901细胞系中，嘌呤霉素筛选获得稳定表达PTEN基因的转染细胞，通过细胞活力实验、流式细胞仪和DNA凝胶电泳，观察PTEN基因对SGC-7901细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。结果 稳定转染PTEN基因的SGC-7901细胞中PTEN蛋白稳定表达，转染PTEN基因的SGC-7901细胞生长速度较对照组明显减慢。流式细胞仪显示，细胞周期发生G1期阻滞。转染PTEN的细胞在透射电镜下可出现典型的凋亡形态学的改变；细胞核DNA琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞特有的“梯状”条带，而对照组没有出现。结论 外源性PTEN基因导入SGC-7901细胞后，可引起SGC-7901细胞G1期阻滞，抑制肿瘤细胞增殖，并促进凋亡的发生。     

shRNA靶向抑制COX-2基因表达对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响

目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)短发夹RNA(shRNA)对胃癌细胞SGC-7901的生长和细胞周期的影响.方法 构建COX-2基因的特异性小RNA干扰质粒,构建靶向抑制COX-2基因的重组表达载体pshRNA-COX-2.实验分3组:未转染胃癌细胞组,阴性对照HK组,pshRNA-COX-2转染组.用质脂体lipofectamine~(TM) 2000转染胃癌细胞SGC-7901,RT-PCR和Western blot分别检测COX-2基因mRNA和蛋白表达情况,流式细胞术检测细胞周期,细胞计数检测细胞的生长变化.结果 与阴性对照组相比,pshRNA-COX-2重组表达载体抑制COX-2 mRNA及蛋白表达的抑制率分别为70.1%和43.2%;G_0～G_1期细胞由61.5%上升至70.2%,S期细胞由27.3%下降至21.7%;细胞生长明显减慢.结论 pshRNA-COX-2重组表达载体能显著抑制COX-2的表达,从而抑制胃癌细胞生长.     

PTEN基因对人胃癌细胞SGC-7901的生物学效应

目的　研究PTEN基因对人胃癌细胞SGC 790 1增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法　将携带有PTEN基因的真核表达载体pBabe Puro PTEN以及pBabe Puro ,以脂质体介导的基因转染方法转入SGC 790 1细胞系中 ,嘌呤霉素筛选获得稳定表达PTEN基因的转染细胞 ,通过细胞活力实验、流式细胞仪和DNA凝胶电泳 ,观察PTEN基因对SGC 790 1细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。结果稳定转染PTEN基因的SGC 790 1细胞中PTEN蛋白稳定表达 ,转染PTEN基因的SGC 790 1细胞生长速度较对照组明显减慢。流式细胞仪显示 ,细胞周期发生G1期阻滞。转染PTEN的细胞在透射电镜下可出现典型的凋亡形态学的改变 ;细胞核DNA琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞特有的“梯状”条带 ,而对照组没有出现。结论　外源性PTEN基因导入SGC 790 1细胞后 ,可引起SGC 790 1细胞G1期阻滞 ,抑制肿瘤细胞增殖 ,并促进凋亡的发生     

zebularine对人胃癌SGC-7901细胞株抑癌基因p16表达的影响

目的:观察甲基化转移酶抑制剂zebularine对人胃癌SGC-7901细胞株抑癌基因p16表达的影响。方法:采用MTT法和划痕实验检测zebularine对人胃癌SGC-7901细胞株的抑制率及其细胞迁移率的影响,采用real-time PCR检测作用前后抑癌基因p16表达的变化。结果:⑴终浓度100μmol/L的zebularine作用24 h能显著抑制SGC-7901细胞株的增殖率和迁移率。MTT法对照组吸光度为0.50±0.01,实验组为0.45±0.02,两组间差异有统计学意义(P0.05);对照组划痕愈合率为(47.45±10.05)%低于实验组的(88.23±5.45)%(P0.05)。⑵zebularine作用24 h能显著增加抑癌基因p16mRNA的表达,实验组为5.21±0.67显著高于对照组的1.04±0.09(P0.05)。结论:甲基化转移酶抑制剂zebularine可以有效抑制SGC-7901细胞株的增殖和迁移并提高抑癌基因p16mRNA的表达。     

靶向环氧合酶-2的RNA干扰诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡

目的探讨靶向环氧合酶-2(COX-2)的RNA干扰(RNAi)对胃癌SGC-7901细胞增生和凋亡的影响。方法设计并合成6条COX-2小分子干扰RNA(siRNA)和1条阴性对照siR- NA,用TOPtranfection介导转染胃癌SGC7901细胞,荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测胃癌SGC7901细胞中COX-2基因和蛋白的表达,用流式细胞仪检测胃癌细胞凋亡情况,并与对照组进行比较。结果TOPtranfection能够有效介导COX-2 siRNA和阴性对照siRNA转染胃癌SGC7901细胞；TOPtranfection介导的COX-2 siRNA有效抑制了胃癌细胞COX-2 mRNA表达,与对照组相比抑制效率90．0%以上,最高达98．3%,同时抑制胃癌SGC7901细胞COX-2蛋白表达,与阴性对照组及对照组相比,COX-2蛋白抑制率分别为72．0%和72．1%。试验组、阴性对照组及对照组胃癌细胞凋亡率分别为：22．28±3．62、1．23±0．27和1．03±0．14。试验组与阴性对照组(t= 14．214,P＜0．01)和对照组(t=14．378,P＜0．01)比较,差异均具有统计学意义,阴性对照组与对照组比较(t=1．635,P＞0．05)差异无统计学意义。结论靶向COX2的RNA干扰能有效抑制胃癌细胞中COX-2基因和蛋白的表达,同时能明显增加胃癌细胞凋亡、抑制胃癌细胞增生。     

PRL-3 miRNA重组慢病毒对胃癌SGC7901细胞增殖的抑制作用

目的 观察PRL-3在人胃癌SGC7901细胞增殖中的作用.方法 构建表达人工PRL-3 miRNA的慢病毒载体,转染SGC7901细胞,并检测其沉默PRL-3表达的效果;MTT试验评价沉默PRL-3表达对SGC7901细胞增殖的抑制作用.结果 成功构建表达PRL-3慢病毒载体.PRL-3慢病毒转染组,可沉默SGC7901细胞PRL-3的表达.MTT试验结果,沉默PRL-3的表达后,与空载体组比较,SGC7901细胞数下降了30.4%;生长曲线比较,SGC7901细胞的增殖受到明显抑制(P＜0.05).结论 PRL-3在胃癌生长中起着重要作用,可作为胃癌潜在的治疗靶点.     

小分子干扰RNA特异性抑制胃癌SGC7901细胞人端粒酶催化亚单位基因表达的研究

目的构建针对人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit,hTERT)基因的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体pU6-hTERT-siRNAs,观察其对胃癌SGC7901细胞hTERT基因的特异性抑制作用。方法采用报告基因质粒pCX-GFP(5510bp)和含有鼠U6启动子pU6(3300bp)质粒,设计合成针对绿色荧光蛋白(GFP)基因的发夹RNA(shRNA)序列,构建SHi-pU6-GFP质粒。应用Lipofeetamine^TM 2000将pCX-GFP质粒和SHi-pU6-GFP质粒转染K562细胞、SGC7901细胞,并用荧光显微镜观察转染效果。设计合成针对hTERT的siRNAs,构建重组pU6-hTERT-siRNAs质粒。Lipofectamine^TM 2000介导pU6-hTERT-siRNAs质粒转染SGC7901细胞。分别应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)定性和定量检测hTERT基因表达情况。结果质粒pU6和SHi-pU6-GFP经EcoRV和XbaⅠ酶切电泳后,前者出现3300bp和约300bp条带,而后者出现3300bp和约350bp条带,与实验设计的针对GFP的shRNA长度相符。说明本实验已成功构建了针对绿色荧光蛋白GFP基因的SHi-pU6-GFP质粒。K562细胞和SGC7901细胞中分别观察到转染pCX-GFP质粒和SHi-pU6-GFP质粒前后发绿色荧光的细胞数目明显减少。定性、定量检测SGC7901细胞转染pU6-hTERT-siRNAs组hTERT基因表达抑制。结论针对hTERT基因设计的siRNAs表达质粒可以特异性抑制SGC7901细胞hTERT基因表达。     

LDL-ACM复合物对胃癌细胞株SGC-7901的抑制作用

目的：比较低密度脂蛋白-阿克拉霉素（LDL-ACM）复合物和游离ACM对胃癌细胞株SGC-7901的抑制作用,从而为以LDL为载体介导的癌瘤靶向治疗提供理论支持。方法：37℃、CO25%及饱和湿度培养箱培养人上皮样胃癌细胞株SGC-7901及取自胃壁经原代培养获得的胃成纤维细胞。以LDL作为脂溶性抗肿瘤药物ACM的载体,温育交换法制备LDL-ACM复合物。观察LDL-ACM复合物及游离ACM对胃癌细胞株SGC-7901及胃成纤维细胞的增殖、细胞DNA合成及蛋白质合成的抑制作用,并进行统计学分析。结果：LDL-ACM复合物对胃癌细胞株SGC-7901的生长、DNA及蛋白质合成的抑制作用均显著强于游离ACM,且差异有统计学意义（P分别〈0.01、0.05、0.005）,且在药物浓度为1.2500～5.0000μg/mL范围内对于细胞DNA合成的抑制作用更显著（P〈0.05）。而LDL-ACM复合物和游离ACM对正常胃成纤维细胞的生长、DNA的合成及蛋白质合成的抑制作用差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：以LDL为载体介导的肿瘤药物的细胞抑制作用强于游离抗肿瘤药物。     

Smac基因过表达对胃癌细胞株化疗敏感性影响的研究

目的：观察Smac基因过表达对胃癌细胞株化疗敏感性的影响。方法：采用脂质体lipofec-tamine2000介导的方法,将Smac基因转入胃癌细胞SGC-7901,RT-PCR和Western-blot法检测未转染对照组、空载体pcDNA3．1转染对照组、pcDNA3．1-Smac转染组胃癌细胞中Smac基因的表达。选用紫杉醇（1、5、10ug／mL）处理转染前后的胃癌细胞,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖活性,倒置显微镜下观察细胞形态变化并摄片。结果：同未转染对照组和空载体pcDNA31转染对照组比较,pcDNA31-Smac转染组SGC-7901细胞SmacmRNA和蛋白表达水平显著增高（F）〈O01）;紫杉醣处理24、48h后,pcDNA3．1-Smac转染组细胞生长抑制率增加（P〈O01）;使用化疗药物后,细胞明显变圆、折光增强、漂浮细胞增多,pcDNA3．1-Smac转染组细胞形态变化最为显著。结论：转染外源性Smac基因并使其在胃癌细胞中过表达,能提高SGC-7901细胞对化疗药物的敏感性。     

血红素加氧酶-1在脓毒症大鼠炎性反应中的作用

目的 评价血红素加氧酶-1(HO-1)在脓毒症大鼠炎性反应中的作用.方法 雄性Wistar 大鼠72只,10～ 14周龄,体重250～ 300 g,以盲肠结扎穿孔法(CLP)建立脓毒症模型.采用随机数字表法,将大鼠随机分为4组(n=18):对照组(C组)、脓毒症组(CLP组)、钴原卟啉Ⅸ组(Co组)及锌原卟啉Ⅸ组(Zn组).于术后6、12、24 h(T1-3)时随机取6只大鼠采集血样,采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-6和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的浓度.于T3时采集血样后取肺组织,采用RT-PCR法测定肺组织HMGB1 mRNA表达.另取40只相同条件的Wistar大鼠,按照上述方法分组,绘制生存曲线.结果 与C组比较,CLP组、Co组和Zn组血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度升高,肺组织HMGB1 mRNA表达上调,生存率降低(P＜0.05).与CLP组比较,Co组血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度降低,肺组织HMGB1 mRNA表达下调,生存率升高(P＜0.05),Zn组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05).结论 诱导HO-1表达有助于减轻脓毒症大鼠炎性反应.     

矢车菊素-3-葡萄糖苷诱导人胃癌细胞株SGC7901凋亡及其机制

目的 观察矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G)在体外诱导人胃癌SGC7901细胞凋亡的生物学效应,并初步探讨其分子机制.方法 分别采用不同浓度梯度的C3G处理SGC7901胃癌细胞,MTT比色法检测细胞生长率;激光共聚焦显微镜观察细胞形态改变;TUNEL法分析细胞凋亡率;Western blot法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3、ICAD蛋白表达的情况.结果 C3G在体外能明显抑制人胃癌SGC7901细胞的生长增殖,且呈浓度、时间依赖性(P＜0.01).激光共聚焦显微镜下可见Hoechst33258荧光染色细胞呈凋亡特征性改变;TUNEL法检测实验组细胞凋亡率均明显高于阴性对照组(P＜0.01);C3G可下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达,降低Bcl-2/Bax蛋白的比值,促使Caspase-3酶原蛋白活化,下调ICAD蛋白表达(P＜0.01).结论 C3G具有在体外抑制胃癌细胞增殖的作用,并能诱导其凋亡,其机制可能与Bcl-2/Bax降低导致Caspase-3活化、ICAD蛋白表达下降相关.     

二氢青蒿素对胃癌细胞株SGC7901增殖的影响

目的 观察二氢青蒿素(DHA)对胃癌细胞株SGC7901增殖的影响及作用机制.方法 SGC7901细胞分为DHA组和对照组,DHA组分别加入浓度为6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/LDHA的培养基,对照组加入等体积含0.1％ DMSO的培养基.不同浓度DHA处理SGC7901细胞24、48和72 h后,MTT法检测细胞的增殖情况.不同浓度DHA处理SGC7901细胞24h后,流式细胞仪测定细胞周期的分布;100 μmol/L DHA处理细胞24h后,采用Western blot法测定细胞周期蛋白A(Cyclin A)、Cyclin D1、Cyclin E、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和P16蛋白的表达水平;免疫共沉淀检查CDK4与Cyclin D1和P16之间的相互作用.采用单因素方差分析和t检验进行统计学分析.结果 6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L DHA分别处理SGC7901细胞24、48和72 h,均明显抑制细胞增殖(F =78.66,235.37,93.75,P＜0.05);与对照组比较,不同浓度DHA组G0/G1期细胞比例均明显上升(F=18.42,P＜0.05);100.00 μmol/L DHA处理细胞24h,Cyclin D1和CDK4蛋白的相对表达量分别为0.17±0.05、0.24±0.06,较对照组的0.67±0.15、0.64 ±0.18明显下降(t=7.746,5.164,P＜0.05);DHA组Cyclin E蛋白的相对表达量为0.35 ±0.06,较对照组的0.42±0.06也有下降,但差异无统计学意义(t=2.021,P＞0.05);DHA组和对照组Cyclin A蛋白的相对表达量分别为0.38 ± 0.08和0.35 ±0.09,两组比较,差异无统计学意义(t=1.266,P＞0.05);与对照组P16蛋白相对表达量(0.29±0.07)比较,DHA组P16蛋白相对表达量(0.54±0.12)显著升高(t=4.408,P＜0.05).免疫共沉淀结果示DHA处理SGC7901细胞后,CDK4与Cyclin D1结合减少,与P16结合增加.结论 DHA将SGC7901细胞周期阻滞于G0/G1期,其主要机制可能与下调Cyclin D1和CDK4表达、上调P16表达,抑制Cyclin D1与CDK4的结合,促进P16与CDK4的结合有关.     

血红素氧合酶-1在临床肝移植中肝脏保护作用的研究

目的 研究移植肝脏血红素氧合酶(HO-1)表达水平与缺血再灌注损伤和移植术后肝脏功能的关系.方法 研究28例人类临床原位肝脏移植,根据供肝血红素氧合酶(HO-1)表达的平均值将供肝分为两组:移植前供肝HO-1高表达组和移植前供肝HO-1低表达组.比较两组移植术后血浆AST、ALT水平、胆汁中胆盐含量以及术前术后HO-1 mRNA和蛋白表达情况.结果 再灌注后移植术前HO-1低表达组的HO-1 mRNA表达显著增加,而高表达组HO-1 mRNA表达却有所下降.肝脏移植后,术前HO-1低表达组与高表达组相比,血浆转氨酶显著降低,胆汁中胆盐含量明显高于后者.结论 移植术前HO-1低表达组供肝在再灌注过程中能够进一步诱导HO-1表达,与高表达组供肝相比其所遭受的缺血再灌注损伤较轻,移植术后肝脏功能较好.移植过程中HO-1表达的增强要比移植前HO-1高表达更具有细胞保护作用.免疫荧光染色证实枯否细胞是人类肝脏表达HO-1的主要部位.