MHC-肽四聚体技术在造血干细胞移植中的应用

MHC-肽四聚体技术是一种直接监测抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)的新方法,具有较强的特异性和敏感性。本文就MHC-肽四聚体技术在造血干细胞移植后巨细胞病毒特异性CTL、次要组织相容性抗原(mHags)特异性CTL以及肿瘤抗原特异性CTL的检测及其意义进行综述。     

MHC四聚体技术的应用研究进展

通过描述免疫应答和免疫反应特征来定义抗原特异性T淋巴细胞反应类型的方法具有繁杂、准确性差等缺点。为精确辨别T淋巴细胞反应类型,发展了可直接对抗原特异性T淋巴细胞进行标记的MHC四聚体(tetramer)技术。利用T细胞受体(TCR)与MHC分子识别结合机制在T细胞表面结合肽-主要组织相容性复合物(peptide major histocompatibility complex,p MHC)配基,T细胞聚合形成可溶性肽-MHC四聚体,增加特异性T细胞检测的灵敏度,该技术即四聚体技术。该文主要论述MHC四聚体技术的原理和临床应用。     

应用免疫球蛋白重链可变区上框架区来源的抗原九肽获得的细胞毒T细胞功能分析

目的明确存B淋巴细胞肿瘤表面的免疫球蛋白重链可变区(IgHV)的框架区(FR)上是否存在可以激发细胞毒T淋巴细胞(CTL)的抗原表位，这些来源于FR的抗原肽是否能够激发家族特异性的免疫反应，探讨按照B淋巴细胞肿瘤的IgHV基因分型进行家族性的免疫治疗的可能性，方法利用生物信息学系统预测了40例B淋巴细胞肿瘤表面的免疫球蛋白序列的抗原表位，人工合成不同基因家族的抗原几肽，利用1、2细胞结合实验检测预测的抗原肽和HLA分子的亲合力利用体外CTL刺激扩增体系。诱导特异性的CTL细胞增殖，用肽／HLA四聚体检测特异性CTL的数目，应用LDH释放实验检测CTL的细胞毒活性并验证其家族特异性。结果在B淋巴细胞肿瘤的7个IgHV基因家族中找到了12个高亲和力的抗原九肽，其中10个(83％)位于FR，以HLA-A*0201正常供的外周血单个核细胞(PBMNC)负荷该九肽作为抗原呈递细胞去刺激自身PBMNC，经过4轮刺激，CD8和肽／HLA四聚体双阳性细胞从0．38％上升到49．38％LDH释放实验证明对HLA—A*0201( )、IgHV1( )靶细胞有明显的杀伤作用，并且被IgHV1肽刺激出的CTL不能识别负荷IgHV3肽的靶细胞：结论IgHV基因FR抗原儿肽可以刺激产生具有HLA限制性的并且肽特异性的CTL，同时这样的杀伤作用具有家族特异性，以此为靶位有望对B淋巴细胞肿瘤进行家族特异性的免疫治疗。     

IL-4基因修饰HL-60细胞增强CTL杀伤活性机制初探

目的 进一步探讨IL－4基因修饰瘤苗增强细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性的机制。方法 通过逆转录病毒载体PL－IL－4－SN将人IL－4基因导入白血病细胞系HL－60细胞,以IL－4基因修饰瘤苗和野生型瘤细胞作刺激细胞诱导CTL反应,通过流式细胞仪检查肿瘤细胞表面MHC－Ⅰ、MHC－Ⅱ类抗原及B7－1、ZCAM－1等分子表达。结果 IL－4基因修饰诱导瘤细胞表达MHC－Ⅱ类抗原、B7－1及ICAM－1等细胞表面分子,对MHC－Ⅰ类抗原表达无影响,其瘤苗诱导的CTL杀伤活性为野生型瘤细胞的7倍（P＜0．01）,加入抗IL－4单抗可完全阻断IL－4诱声细胞表面MHC－Ⅱ类抗原及B7－1、ICAM－1分子的表达,IL－4基因修饰瘤苗诱导CTL反应时培养上清可测及IL－2产生。抗IL-4灌抗细胞MHC－Ⅱ类抗原等表面分子单抗可降低IL－2产生及抑制CTL反应。结论 诱导MHC－Ⅱ类抗原等表面分子表达,促进IL－2产生,可能是IL－4基因修饰增强CTL杀伤活性的作用机制之一。     

活化B淋巴细胞诱导健康人外周血HBcAg 短肽特异性细胞毒性T淋巴细胞

目的 探讨负载乙型肝炎病毒核心抗原18-27(HBcAg 18-27)序列肽的活化B淋巴细胞诱导自体外周血单个核细胞(PBMC)产生HBcAg 18-27特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力.方法 免疫磁珠法分选B淋巴细胞,与CpG寡核苷酸(CpG-ODN)(2 μg/mL)和白细胞介素-4(IL-4)(2 ng/mL)共培养48 h,再加入人工合成的HBcAg 18-27肽(50 μg/mL),继续温育12 h.将负载抗原肽的活化B淋巴细胞与自体PBMC进行混合淋巴细胞培养5 d,采用Pro5TM MHC Pentamers技术检测HBcAg 18-27特异性CTL.结果 免疫磁珠法分选B淋巴细胞纯度为89.60%.荧光显微镜观察到HBcAg 18-27抗原肽进入活化B细胞,流式细胞仪定量检测抗原负载率为41.3%.以此作为HBcAg 18-27特异性抗原递呈细胞(APC)能够从自体PBMC中诱导出HBcAg 18-27特异性CTL.对照组(不加APC)HBcAg 18-27特异性CTL为(0.20±0.10)%,实验组(加APC)为(0.50±0.19)%,2组差异有统计学意义(P<0.01).结论 负载了HBcAg 18-27肽的活化B淋巴细胞能够诱导自体PBMC产生HBcAg 18-27特异性CTL.     

组织相容性抗原-肽四聚体流式的细胞技术检测乙型肝炎患者特异性CD8+T细胞

目的　探讨组织相容性抗原 (HLA) 肽四聚体流式细胞技术检测乙型肝炎病毒特异性CD8 T细胞的临床应用价值。方法　采用HLA A2分子胞外段与乙型肝炎病毒 (HBV)核心表位肽core 18 2 7结合的HLA 肽四聚体 (Tetramer) ,设计流式细胞技术检测乙肝患者外周血中针对该肽段的特异性CD8 T细胞数量 ,以占总计数CD8 细胞数的百分比表示。结果　 11例HLA A2 的急性乙肝患者外周血特异性CD8 T细胞为 0 0 2 %～ 2 0 4 % ,中位数为 0 2 0 % ,16例HLA A2 的慢乙肝患者为<0 0 1%～ 0 6 5 % ,中位数为 0 0 5 % ,二组之间差有显著性 (P <0 0 1)。 15例HLA A2 正常对照组、13例HLA A2 -急性乙肝对照组和 19例HLA A2 -慢性乙肝对照组的特异性的CD8 T细胞均不超过0 0 2 %。结论　HLA 肽四聚体流式细胞技术能在体外直接检测HBV特异性的CD8 T细胞数量 ,其水平一定程度上反映了特异性CTL应答状况 ,且与乙肝的不同临床转归有关。     

肿瘤抗原特异性细胞毒T细胞和肿瘤免疫治疗

肿瘤抗原特异性细胞毒T细胞(CTL)是重要的抗肿瘤细胞。本文介绍了抗原呈递及CTL识别的分子基础，并对肿瘤相关抗原(TAA)及T细胞表位的鉴定、肿瘤相关抗原肽诱导特异性CTL应答的免疫原性、肿瘤相关抗原肽疫苗治疗肿瘤的原理以及T细胞免疫应用前景做一综述。     

B7—CD28／CTLA—4共刺激途径与GVHD

异基因骨髓移植是目前治疗血液系统疾病的一个有效的方法，移植物抗宿主病（GVHD）则是影响移植效果的主要并发症。移植物中所含有的成熟T细胞是导致GVHD的免疫活性细胞，而T细胞的活化不仅需T细胞上TCR分子识别APC细胞所提呈的MHC－多肽复合物，还必须有辅助分子传递的共刺激信号，否则即可造成T细胞的免疫无反应状态，B7是其中最重要的共刺激分子，为此干预B7－CD28共刺激途径诱导抗原特异性的无反应状成，近年来成为GVHD预防策略的研究热点。     

负载人恶性黑素瘤相关抗原gp100抗原肽HLA-A^＊2402四聚体制备及鉴定

目的：构建负载人恶性黑素瘤相关抗原gp100抗原肽的HLA-A^＊2402四聚体并进行鉴定,为分析gp100抗原肽诱发的特异性细胞免疫应答创造条件。方法：以羧基端融合生物素化酶BirA底物肽的HLA-A^＊2402重链胞外域融合蛋白、人β2-微球蛋白、gp100 VYFFLPDHL抗原肽、PE-链亲和素为材料,制备HLA-A^＊2402/VYF四聚体;非还原SDS-PAGE鉴定四聚体四聚化程度;三色免疫荧光标记流式细胞术分析HLA-A^＊2402＋健康志愿者外周血gp100特异性CD8＋T细胞的频率。结果：HLA-A^＊2402/VYF四聚体形成率为83%,所制备的四聚体具有与HLA-A^＊2402＋供者抗原特异性CD8＋T细胞的结合活性,特异性CD8＋T细胞的频率为外周血总CD8＋T细胞的0.02%～0.06%。结论：成功制备HLA-A^＊2402/VYF四聚体并用于检测gp100特异性CD8＋T细胞,为研究HLA-A^＊2402＋黑素瘤患者免疫治疗的机制及疗效监测创造了条件。     

负载人恶性黑素瘤相关抗原gp100抗原肽HLA-A*2402四聚体制备及鉴定

目的:构建负载人恶性黑素瘤相关抗原gp100抗原肽的HLA-A*2402四聚体并进行鉴定,为分析gp100抗原肽诱发的特异性细胞免疫应答创造条件。方法:以羧基端融合生物素化酶BirA底物肽的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白、人β2-微球蛋白、gp100 VYFFLPDHL抗原肽、PE-链亲和素为材料,制备HLA-A*2402/VYF四聚体;非还原SDS-PAGE鉴定四聚体四聚化程度;三色免疫荧光标记流式细胞术分析HLA-A*2402+健康志愿者外周血gp100特异性CD8+T细胞的频率。结果:HLA-A*2402/VYF四聚体形成率为83%,所制备的四聚体具有与HLA-A*2402+供者抗原特异性CD8+T细胞的结合活性,特异性CD8+T细胞的频率为外周血总CD8+T细胞的0.02%～0.06%。结论:成功制备HLA-A*2402/VYF四聚体并用于检测gp100特异性CD8+T细胞,为研究HLA-A*2402+黑素瘤患者免疫治疗的机制及疗效监测创造了条件。     

负载人恶性黑素瘤相关抗原gp100抗原肽HLA-A~*2402四聚体制备及鉴定

目的:构建负载人恶性黑素瘤相关抗原gp100抗原肽的HLA-A*2402四聚体并进行鉴定,为分析gp100抗原肽诱发的特异性细胞免疫应答创造条件。方法:以羧基端融合生物素化酶BirA底物肽的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白、人β2-微球蛋白、gp100 VYFFLPDHL抗原肽、PE-链亲和素为材料,制备HLA-A*2402/VYF四聚体;非还原SDS-PAGE鉴定四聚体四聚化程度;三色免疫荧光标记流式细胞术分析HLA-A*2402+健康志愿者外周血gp100特异性CD8+T细胞的频率。结果:HLA-A*2402/VYF四聚体形成率为83%,所制备的四聚体具有与HLA-A*2402+供者抗原特异性CD8+T细胞的结合活性,特异性CD8+T细胞的频率为外周血总CD8+T细胞的0.02%～0.06%。结论:成功制备HLA-A*2402/VYF四聚体并用于检测gp100特异性CD8+T细胞,为研究HLA-A*2402+黑素瘤患者免疫治疗的机制及疗效监测创造了条件。     

慢性乙型肝炎患者外周血抗原特异性CD8~+T细胞功能的初步分析

目的评价慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血抗原特异性CD8+T细胞的功能及与临床相关指标的关系。方法采用主要组织相容性复合物(MHC)-抗原肽四聚体标记技术检测CHB患者外周血乙型肝炎病毒(HBV)抗原特异性CD8+T细胞,并对其细胞因子分泌能力进行检测,分析其与临床生化和病毒学指标的关系。结果 35例人类白细胞相关抗原(HLA)-A基因型为A02或A24的患者中有9例患者至少检出1种被四聚体识别的HBV抗原特异性CD8+T细胞,其白细胞介素2(IL-2)和γ干扰素(IFN-γ)的分泌能力明显低于其自身的外周血总CD8+T细胞。检出抗原特异性CD8+T细胞患者的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平明显高于阴性患者,而HBV DNA水平低于阴性患者。结论 CHB患者外周血抗原特异性CD8+T细胞存在明显的功能缺陷,可能因病毒抗原持续刺激造成功能耗竭,但外周血出现抗原特异性CD8+T细胞仍表明患者体内出现较强抗病毒免疫反应。     

HBV组织相容性复合物-抗原肽五聚体在特异性细胞毒T淋巴细胞检测中的应用

组织相容性复合物(MHC)-抗原肽五聚体(Pentamer)复合物是目前检测特异性细胞毒T淋巴细胞(eytotoxicT lymphocytes,CTL)最为敏感而特异的方法之一,正被广泛应用于多种病毒感染性疾病发病机制的研究以及作为临床感染转归的预测指标.但由于外周血淋巴细胞中特异性CTL的数量非常低,对于如何确定特异性CTL频数存在相当大的困难.     

T细胞与移植物抗宿主病的关系

T细胞在移植物抗宿主病（GVHD）的发生发展中起关键作用。T细胞包括主要组织相容性抗原（MHC）限制性T细胞和非MHC限制性T细胞两种类型，前者指CD4^ T细胞和CD8^ T细胞，后者包括NK－T细胞和γδT细胞。CD4^ T细胞和CD8^ T细胞与GVHD密切相关，NK－T细胞和γδT细胞主要介导移植物抗白血病（GVL）效应。     

隐球菌抗原MP98的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定

目的鉴定隐球菌抗原MP98中的HLA-A＊0201限制性CD8＋CTL表住。方法应用数据库SYFPEITHI预测隐球菌MP98中可能存在的HLA-A＊0201限制性CD8＋CTL表位，经流式细胞术分析各抗原肽与HLA-A＊0201的亲合力，经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞（PBMCs）对各抗原肽产生的增殖反应，经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性T细胞的细胞毒杀伤活性，逐步鉴定MP98的HLA-A＊0201限制性CD8＋CTL表位。结果位于MP98氨基酸序列肽5（436-444aa）与HLA-A＊0201分子具有较高的亲合力，并都能刺激HLA-A＊0201阳性个体者PBMC增殖，并诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL。结论肽5GMFDGLSGV（436-444aa）是MP98上HLA-A＊0201限制性CD8＋CTL的优势表位，可作为隐球菌疫苗设计的候选表位。     

细胞毒性T淋巴细胞治疗人巨细胞病毒感染在造血干细胞移植中的应用

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染是造血干细胞移植后的常见并发症,是造成移植后患者死亡的主要原因之一。细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)是控制HCMV感染的重要免疫细胞,过继输注病毒特异性CTL对预防及治疗HCMV感染均安全有效。目前针对HCMV特异性CTL的制备方法仍在探索中。利用抗原递呈细胞刺激外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)制备CTL的方法操作简单,易于开展大规模临床实验;利用肽特异性四聚体或病毒特异性γ-干扰素抗体直接从供者PBMC筛选CTL的方法需要大量的供者外周血,且制备成本高;第三方CTL作为一种产品可以随时使用,但仍需解决HLA不相合的问题。另外,不同方法的临床疗效及安全性也存在差异。本文对目前采用的制备HCMV特异性T淋巴细胞的方法及其疗效进行综述。     

MHC Ⅱ类基因修饰的小鼠黑色素瘤细胞对肿瘤特异性CTL诱导的实验研究

大多数的肿瘤细胞只表达MHC I类抗原，不表达Ⅱ类抗原，而Ⅱ类抗原主要与T辅助细胞作用，激活T辅助细胞，为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活化提供必需的辅助信息。如果肿瘤细胞是MHC Ⅱ类阳性的，就可以直接作为抗原提呈细胞来刺激T辅助细胞的增殖，进而产生有效的免疲反应，因此向肿瘤细胞内转移MHC Ⅱ类基因是目前正在尝试的一种新的基因治疗方法。为了探讨MHC Ⅱ类基因修饰的肿瘤细胞其免疫原性的变化，我们利用已经获得的表述MHC Ⅱ类基因的B16-DR细胞，进行CTL诱导的实验研究。结果表明，经MHC Ⅱ类基因修饰的B16-DR细胞可以在体内和体外诱导产生针对原始B16细胞的CTL反应，而未经修饰的B16细胞却无此作用。此CTL反应可用抗MHC Ⅱ的单克隆抗体封闭，并且封闭的程度随着加入的抗体量的增加而增加，说明此CTL反应的诱导与所转入的MHC Ⅱ类基因密切相关。抗CD4／CD8的单克隆抗体可以阻断CTL的诱导，表明T辅助细胞和杀伤性T细胞也参与了这一CTL诱导过程。总之。我们的实验结果提示所转入的MHC Ⅱ类基因以及CD4和CD8T细胞在CTL诱导反应中具有重要作用。     

DC/CIK免疫治疗的护理

肿瘤树突状细胞（DC）是体内最有效的专职抗原递呈细胞,通过MHCⅠ、Ⅱ类途径将外源性抗原呈递给CD3＋CD4及CD3＋CD8＋TC,诱导机体产生抗原特异性CTL,识别和杀灭肿瘤细胞,并抑制肿瘤血管生成,同时激发免疫记忆保护。     

抑制移植排斥的新途径--CⅡTA 反义RNA的生物学活性

为了探讨CⅡTA的反义RNA对细胞表面主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex,MHC,亦称HLA）Ⅱ类抗原表达的抑制作用,克隆与人类CⅡTA基因第114-523位点之间序列互补的反义RNA（arCⅡTA）cDNA序列,并稳定转染Raji细胞,用流式细胞术检测经典MHCⅡ类抗原（HLA-DR、-DP、-DQ）表达,并应用RT-PCR方法检测CⅡTA、经典MHCⅡ类及恒定链的mRNA水平.研究结果表明：arCⅡTA阳性Raji细胞与正义链组比较,HLA-DR、DP及DQ抗原表达分别降低了65.93%、54.14%、68.32%;同时CⅡTA、经典的MHCⅡ类及恒定链的mRNA含量均明显减少（P＜0.05）.结论：CⅡTA反义RNA抑制了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达,为移植物抗宿主病的研究提供了一种新方法.     

乙型肝炎患者特异性CTL细胞数量的研究

目的 检测我国北方地区乙型肝炎患者表位特异性CTL细胞反应水平,研究急性自限性和慢性持续性乙型肝炎患者体内免疫反应的差异。方法 使用HBV抗原表位肽五聚体（HBcAg18-27）对急性和慢性乙型肝炎感染患者外周血染色后,用流式细胞仪检测HBV特异性CTL细胞。结果 在20例急性乙型肝炎的急性期,可以检测到高水平的HBcAg特异性的CTL细胞,而在急性乙型肝炎的恢复期,HBcAg特异性CTL细胞的水平可以明显下降。在20例慢性乙型肝炎患者中,可以检测到低水平的HBcAg特异性的CTL细胞。结论 HBcAg特异性CTL细胞在急性肝炎患者清除乙型肝炎病毒的过程中可能起到至关重要的作用。