人单核细胞趋化因子-1基因重组卡介苗的构建与鉴定

目的构建能自动分泌性表达单核细胞趋化因子-1（MCP-1）的重组卡介苗。方法分别以卡介苗（BCG）和人MCP-1cDNA为模板,通过PCR扩增得到120bp的BCG Ag85B信号肽基因序列和300bp的MCP-1基因序列。将上述两片段基因序列插入大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒pMV261,得到重组质粒pMV261-Ag85B-MCP-1。测序鉴定完毕后,用电穿孔法将该重组质粒导入BCG中,构建重组卡介苗rBCG MCP-1。分别应用PCR扩增和Western blot检测rBCG MCP-1中MCP-1的基因和蛋白的表达。结果质粒pMV261-Ag85BMCP-1用双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实克隆基因BCGAg85B信号肽和MCP-1正确插入载体pMV261。Western blot显示rBCG MCP-1的培养上清和菌体中均可检测到MCP-1蛋白的表达。ELISA法可检测到培养上清中有高表达的MCP-1蛋白（340pg/mL）。结论成功构建了能分泌MCP-1的新型重组卡介苗rBCG MCP-1,为进一步研究其抗膀胱肿瘤的疗效打下了基础。     

重组卡介苗和传统卡介苗免疫原性的比较

目的 观察分泌人白细胞介素(IL)-2的重组卡介苗(rBCG)和传统卡介苗(BCG)对小鼠免疫应答的影响,评价其免疫原性,初步探讨rBCG免疫治疗的作用机制.方法 连续6周对BALB/C小鼠尾静脉注射rBCG和BCG,分别在第2、4和6周后杀死小鼠取腹腔巨噬细胞和脾脏.以一氧化氮(NO)释放量检测巨噬细胞吞噬活性,以淋巴细胞刺激指数(SI)反映细胞增殖能力,以流式细胞仪测定T淋巴细胞CD亚群分化和酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清细胞因子分泌的变化,比较rBCG治疗组和BCG治疗组之间的差异.结果 在连续6周观察期间,随着免疫时间的延长,rBCG对小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖能力逐渐增强,CD4+、CD8+T细胞和CD4+/CD8+的比例逐渐增高,腹腔巨噬细胞的吞噬活性逐渐增高,诱导小鼠脾淋巴细胞分泌的Th1型和Th2型细胞因子逐渐增多.在同一时点上,不同rBCG和BCG的上述作用均高于空白对照组(P均0.01),差异有统计学意义;rBCG治疗组的上述作用均高于BCG治疗组.结论 rBCG具有良好的免疫原性,能明显增强BALB/c小鼠的免疫应答反应.rBCG诱导的T细胞免疫应答主要是CD4+T细胞依赖的,CD4+细胞免疫应答主要是以Th1型细胞因子参与为主,Th2型细胞因子也发挥一定作用.     

卡介苗穿梭表达质粒pMS肿瘤坏死因子的构建与鉴定

目的构建分泌性表达肿瘤坏死因子(TNF)-α的重组卡介苗。方法分别以卡介苗(BCG)和TNF-α cDNA为模板，通过PCR扩增得到117bp的BCG—Ag85B信号肽序列和702bp的TNF-α基因序列。将BCG—Ag85B信号肽序列插入大肠杆菌一卡介苗穿梭质粒pMV261，得到重组质粒pMS。再将TNF—α基因序列克隆至pMS中，得到重组质粒pMSTNF。结果质粒pMSTNF用双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实，克隆基因BCG—Ag85B和TNF-α。正确插入载体pMV261。结论重组质粒pMSTNF可望在BCG中分泌性表达细胞因子TNF-α从而协同加强对肿瘤的杀伤作用，该质粒的成功构建为改造卡介苗、发展新型抗膀胱肿瘤疫苗提供了依据。     

phIFN-α-2 B穿梭质粒在卡介苗中的表达

目的建立一种新型、具有分泌hIFN-α-2B功能的卡介苗(BCG),为膀胱癌的治疗提供更合理的方法。方法利用基因工程技术构建出穿梭质粒phIFN-α-2B,转导至BCG内形成重组hIFN-α-2B-BCG,采用PCR、测序方法进行鉴定,ELISA方法对其表达情况进行检测。结果穿梭质粒phIFN-α-2B所插入的序列完全正确,可以转导入BCG内形成重组hIFN-α-2B-BCG。细菌外hIFN-α-2B浓度可达997.2pg/ml。结论利用基因工程技术构建了phIFN-α-2B穿梭质粒并转导入BCG内,构建出rBCG-hIFN-α-2B。重组BCG可将hIFN-α-2B分泌性表达到细菌外,为其应用于膀胱肿瘤的治疗提供了实验依据。     

pVAX1-Ag85B的构建及其免疫原性的初步探索

目的构建以Ag85B基因为基础的DNA疫苗,并对其在小鼠体内的免疫原性进行初步分析。方法以pET28a-Ag85B基因组DNA为模板,PCR扩增获得Ag85B全长基因;将PCR产物构建成pUCm-Ag85B亚克隆;经限制性内切酶消化后克隆入pVAX1载体中构建真核表达质粒pVAX1-Ag85B,酶切、DNA测序鉴定。并将构建的DNA疫苗经肌肉免疫荷瘤小鼠,检测血清特异性抗体水平和脾淋巴细胞的增殖活性,并与BCG组、空白质粒组、生理盐水组相比较。结果经NheⅠ和HindⅢ双酶切、DNA测序鉴定后证实,Ag85B基因定向克隆入pVAX1载体,碱基无突变,序列完全正确。免疫荷瘤小鼠后,pVAX1-Ag85B组和BCG组均可提高淋巴细胞增殖活性,但效果不及卡介苗;pVAX1-Ag85B组的抗体滴度为1∶400,BCG免疫组的抗体滴度为1∶800。结论成功地构建了pVAX1-Ag85B质粒,为膀胱肿瘤的基因免疫治疗提供可靠的实验依据。免疫小鼠后,可提高小鼠免疫水平,但效果不及卡介苗。     

癌胚抗原与B-7.1双表达基因疫苗的构建及表达

基因疫苗是把外源基因连接到真核表达质粒载体上，将重组的质粒DNA注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体免疫系统引发免疫反应。DNA疫苗制备简便、安全长效、可组建多价疫苗并兼有预防和治疗作用。癌胚抗原(CEA)有一定的抗原性，可作为诱导肿瘤免疫的有效靶抗原。B7．1分子可促进多种抗原诱导的免疫反应。我们选择编码人全长CEA和B7．1的cDNA构建共表达质粒载体，并检测其在体内、外的表达，为增强CEA基因疫苗的免疫效果进行研究。     

人干扰素α-2b基因重组卡介苗的构建与鉴定

目的 构建能自动分泌表达人干扰素α-2b(IFNα-2b)的重组卡介苗(rBCG-IFNα-2b)菌株,并对其进行鉴定.方法 分别从人外周血和BCG基因组中提取DNA,聚合酶联反应(PCR)扩增人IFNα-2b基因和BCGAg85B信号肽基因,将该两片段插入质粒pMV261,构建分泌型卡介苗穿梭表达载体pMV261-Ag85B-IFNα-2b.电穿孔将该载体导入BCG中,构建rBCG-IFNα-2b.分别用PCR扩增和Western blot检测rBCG-IFNα-2b中人IFNα-2b基因和蛋白的表达情况,酶联免疫吸附(ELISA)检测rBCG-IFNα-2b培养上清中IFNα-2b蛋白的表达情况.结果 采用酶切、PCR扩增及DNA测序对pMV261-Ag85B-IFNα-2b进行鉴定,结果 显示BCG Ag85B信号肽片段和人IFNα-2b片段与文献结果 一致,连接方向正确.以rBCG-IFNα-2b DNA为模板、IFNα-2b引物进行PCR扩增后得到与理论上大小相同的扩增片段,Western blot显示rBCG-IFNα-2b的培养上清和菌体中均可检测到IFNα-2b蛋白的表达,且培养上清中蛋白的表达量明显多于菌体,ELISA法可检测到培养上清中有高表达的IFNα-2b蛋白(301.45 pg/ml).结论 成功构建了能自动分泌表达人IFNα-2b的新型重组卡介苗菌株rBCG-IFNα-2b,为进一步研究其免疫活性和抗膀胱肿瘤疗效奠定了基础.     

人MUC1重复序列与GM-CSF融合表达的重组卡介苗疫苗对乳腺癌生长的抑制作用

目的 构建一种新的基于人MUC1重复序列与GM-CSF融合表达的重组卡介苗疫苗,并观察其对乳腺癌生长的预防性抑制作用.方法 分步克隆人MUC1重复序列1、4、8串联体基因(MVNTR1/4/8),构建人MUC1重复序列串联体与GM-CSF基因融合的大肠-分枝杆菌表达载体pDE22-MVNTR1/4/8-CSF,酶切鉴定及序列分析后,将构建的穿梭质粒电穿孔转染卡介苗,构建重组卡介苗疫苗rBCG-MVNTR1/4/8-CSF,SDS-PAGE和Western Blot检测MVNTR与GM-CSF融合蛋白的表达.在hu-PBL-SCID鼠模型评价其对乳腺癌生长的抑制作用,并通过免疫组化染色检测其免疫诱导的T细胞反应.结果 SDS-PAGE和Western Blot结果说明:人MUC1重复序列与GM-CSF基因融合的重组卡介苗疫苗分别有MVNTR1/4/8与GM-CSF融合蛋白的表达.rBCG-MVNTR4/8-CSF免疫组在MCF-7乳腺癌细胞接种42 d后,肿瘤成瘤率分别为37.5%和25%,而PBS和BCG-pDE22对照组均为100%(P＜0.05).与对照组相比,rBCG-MVNTR4/8-CSF预防接种显著抑制MCF-7乳腺癌细胞生长(P＜0.01),且生长抑制作用随着VNTR的增加而增强.肿瘤细胞接种70 d后,rBCG-MVNTR4/8-CSF组小鼠生存率分别为75%和87.5%,而BCG-pDE22对照组的生存率为12.5%(P＜0.05).rBCG-MVNTR4/8-CSF免疫组瘤体组织中可见CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润.结论 重组卡介苗疫苗rBCG-MVNTR4/8-CSF预防接种可显著抑制乳腺癌生长.     

非肌层浸润性膀胱癌免疫治疗研究进展及机制探讨

膀胱癌在泌尿系肿瘤中发病率很高,病理诊断为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)患者治疗方案基本相同,以经尿道膀胱肿瘤电切(TURBT)及术后膀胱灌注化疗为主,术后复发进展较为常见。现普遍认为肿瘤是一种免疫性疾病,对癌细胞靶向杀伤且通过调节免疫系统功能有可能降低复发进展率。本文对重组卡介苗、基因疗法、肿瘤细胞疫苗、树突状细胞疫苗、单克隆抗体等免疫治疗手段进行归纳总结,分析其在膀胱癌中的应用前景,以期为基础实验研究提供新思路,为其在临床应用奠定理论基础。     

慢病毒载体在肿瘤免疫治疗中的应用

慢病毒载体感染的宿主广,不仅可以高效感染分裂期细胞,而且可以感染非分裂期细胞,可作为肿瘤免疫治疗的工具.与其他逆转录病毒载体相比,慢病毒载体具有许多优点,携带的外源基因在宿主中表达时间长、毒性低、可携带的外源基因片段大、不易诱发宿主免疫反应.本文对携带肿瘤相关抗原基因的慢病毒载体疫苗以及DC疫苗在肿瘤免疫治疗中的应用及安全性问题进行了综述,讨论慢病毒载体作为肿瘤免疫治疗的临床应用前景.     

卡介苗免疫治疗膀胱癌的研究进展

卡介苗(BCG)作为一种免疫治疗剂灌注治疗表浅膀胱癌在临床上的应用已有30多年,是非肌肉浸润性膀胱癌经尿道肿瘤切除术后辅助治疗的金标准.BCG免疫治疗的机制一直被不断地被研究者所关注,临床上的应用不断被改进,从而不断提高BCG的疗效以及降低其副作用.本文着重介绍了BCG免疫治疗膀胱癌的研究进展.     

卡介苗治疗膀胱肿瘤机理研究进展

目前认为,宿主的免疫系统在防御癌肿的发生和发展上起重要作用,膀胱癌患者的细胞免疫力明显受损且随着癌肿的浸润而加重。自从1976年Morales首次报告应用卡介苗(BCG)膀胱灌注治疗表浅膀胱癌以来,BCG作为一种有效的免疫佐剂已在防治膀胱肿瘤方面取得了良好效果,BCG灌注已被     

重组hIFN-α-2b-BCG对小鼠原位膀胱肿瘤免疫效应的研究

目的 探讨重组hIFN-α-2b-BCG对原位膀胱肿瘤小鼠体内抗肿瘤免疫反应及其作用机制.方法 构建C57BL/6原位膀胱肿瘤小鼠模型,采用流式细胞仪对小鼠膀胱灌注治疗后的淋巴细胞亚群进行分析,并测定小鼠血清中mTNF-α和mIL-12的水平,了解小鼠全身免疫状况.肿瘤组织冰冻切片进行T细胞亚群的免疫组织化学分析,免疫组化检测肿瘤Fas表达,了解膀胱局部免疫反应. 结果 重组BCG灌注治疗后小鼠外周血CD4+ T细胞比例明显增高,CD8+ T细胞比例无明显变化,CD4+ /CD8+比例为2.63,与野生BCG组(2.10)比较差异有统计学意义(P＜0.05).荷瘤小鼠外周血中Th1型细胞因子mTNF-α和mIL-12灌注治疗后比PBS对照组大幅提高,重组BCG组mTNF-α为806 pg/ml,mIL-12为860 pg/ml,与野生BCG组及野生BCG联合IFN组比较差异无统计学意义(P＞0.05).重组BCG组瘤组织内CD3、CD4和CD5检测强阳性,显著高于PBS对照组(P＜0.05),重组BCG组和野生BCG加IFN组瘤组织CD4+、重组BCG组CD8+检测值显著高于野生BCG组(P＜0.05).BCG灌注后荷瘤小鼠膀胱肿瘤表达Fas明显高于PBS对照组(P＜0.05). 结论 重组hIFN-α-2b-BCG具有在小鼠体内调节系统及局部免疫能力的作用,纠正荷瘤小鼠淋巴细胞亚群的比例失调,增强局部淋巴细胞浸润,具有增强Th1型细胞因子产生作用,上调荷瘤小鼠Fas的表达,诱导对膀胱肿瘤细胞的免疫攻击.

Abstract：

Objective To study local and systemic immune response in an animal model treated with recombinant hIFN-α-2b-BCG instillation. Methods The MB49 orthotopic bladder cancer model in C57BL/6 mice was established and treated separately with rBCG, wild BCG, wild BCG combined with IFN-α-2b and PBS as the control. The changes of lymphocyte subgroups in peripheral blood were analyzed with FCM, and mTNF-α and mIL-12 in peripheral blood of mice were detected with ELISA.Immunohistochemistry was carried out to detect the local immune reaction, T cell subsets and FAS, in bladder cancer after being treated with rBCG or wBCG. Results The content of CD4+ T lymphocyte was up-regulated in the rBCG group. The CD4+/CD8+ ratio of 2. 63 was up-regulated than pretreatment, significantly different than that of wBCG group(P＜0.05). ELISA assay showed that BCG significantly up-regulated the level of mTNF-α and mIL-12 in serum of orthotopie murine bladder cancer mice. The mTNF-α 806 pg/ml, mIL-12 860 pg/ml in rBCG group, was not significantly higher than those in wBCG group and combination group. The immunocompetent cell numbers with CD3, CD4,CD8 phenotype increased significantly in the tumor tissue of BCG treated group than the control(P＜0.05). The results of CD4+ in rBCG group and the combination group, and CD8+ in rBCG group were significantly higher than that of the wBCG(P＜0.05). The expression of Fas in tumor tissues treated with intravesical BCG was increased(P＜0. 05). Conclusions The recombinant IFN-α-2b-BCG can retrieve the disproportion of systemic lymphocyte subgroups, and increases Th1-type factors and local Fas expression in orthotopic murine bladder cancer. The recombinant IFN-α-2b-BCG is effective in regulating local and systemic immune reaction in orthotopic murine bladder cancer model.     

pYL-绿色荧光蛋白质粒在卡介苗中的表达

我们将绿色荧光蛋白（GFP）报告基因利用pYL—GFP质粒转导到卡介苗（BCG）内形成重组BCG-GFP，通过其在BCG内部表达绿色荧光蛋白作为标记蛋白，探讨BCG的作用过程和机制提供一种新的方法。     

纤维连接蛋白和膀胱肿瘤

纤维连接蛋白 (fibronectin ,FN)是一种大分子糖蛋白 ,在细胞与细胞、细胞与基质的相互作用中起着重要作用。膀胱肿瘤细胞表面FN减少或完全丧失 ,细胞间粘附力降低 ;随着分级、分期升高 ,膀胱移行上皮癌基底膜FN表达明显下降 ,释放到尿液中的可溶性FN含量增多 ;尿液FN含量可作为膀胱癌诊断、估计预后和疗效监测重要指标。FN在膀胱肿瘤的卡介苗 (BacillusCalmette Gu啨ｒｉｎ ,BCG)治疗中扮演着相当重要的角色 ,通过药物等途径增加膀胱壁FN的表达不但可提高BCG的治疗效果 ,还可使目前BCG膀胱灌注的毒副作用明显减少。     

一项卡介苗联合干扰素α-2b治疗表浅性膀胱癌的多中心二期临床试验中期结果（O’donnell MA，et al．J Urol）

作者报告应用卡介苗(BCG)联合干扰素(IFN)α-2b治疗表浅性膀胱癌的一项大样本、多中心临床试验的中期研究结果。从1999年5月至2000年5月，共490例受试患者参加试验，其中初次应用BCG组(BCG-N)259例，BCG治疗失败组(BCG-F)231例，平均随访时间为24个月。BCG-N组先给予标准剂量的BCG加50MU的IFN诱导6周，在治疗周期的第3，9，15个月给予患者1／3～1／10剂量的BCG加50mU的IFN，     

纤维连接蛋白和膀胱肿瘤

纤维连接蛋白(fibronectin，FN)是一种大分子糖蛋白，在细胞与细胞、细胞与基质的相互作用中起着重要作用。膀胱肿瘤细胞表面FN减少或完全丧失，细胞间粘附力降低；随着分级、分期升高，膀胱移行上皮癌基底膜FN表达明显下降，释放到尿液中的可溶性FN含量增多；尿液FN含量可作为膀胱癌诊断、估计预后和疗效监测重要指标。FN在膀胱肿瘤的卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)治疗中扮演着相当重要的角色，通过药物等途径增加膀胱壁FN的表达不但可提高BCG的治疗效果，还可使目前BCG膀胱灌注的毒副作用明显减少。     

重组hIFN-α-2b-BCG对人外周血免疫细胞因子表达调节的研究

目的研究重组BCG(hIFN-α-2b-BCG,rBCG)对人外周血单核细胞(peripheral blood monocytes,PBMC)产生hIFN-γ、hIL-12和hTNF-α细胞因子的表达及免疫增强效应。方法试验分为3组:重组BCG组、野生型BCG(wild BCG,wBCG)组、外源性IFN-α-2b与野生BCG混和组(wBCG IFN),分别进行平行对照实验,重组BCG和野生BCG均采用0.1OD和0.01OD(1OD600=2.7×107CFU)作为实验浓度。以上3组分别与4×106/ml的外周血单个核细胞(PBMC)共培养,以PBMC做空白对照,在12、24、48、72、120、168h时收集培养液上清,经ELISE法检测上清液中hIFN-γ、hIL-12和hTNF-α的表达水平并进行比较。结果重组BCG诱导PBMC产生细胞因子的能力明显强于同浓度的其他2组(P<0.05)。重组BCG组hIFN-γ测得的峰值达2977pg/ml,显著高于野生BCG组的379pg/ml;外源性IFN-α-2b加入在12和24h表现出较强作用,混和成分组在hIL-12测定中峰值达614pg/ml,优于重组BCG和野生BCG组(P<0.05),48h~7d测定说明重组BCG具有持续的诱导效应,而野生组和混和成分组表现出下降趋势,后二者作用效果差异无统计学意义(P>0.05);hTNF-α检测,重组BCG也表现出强而持久的细胞因子诱导能力,hTNF-α测定持续高于2000pg/ml,与其他2组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论重组BCG对人PBMC诱生hIL-12、hIFN-γ和hTNF-α的表达显著高于野生型BCG,进一步证实了重组hIFN-α-2b-BCG对人PBMC细胞因子表达的免疫增强效应。     

pVAX1-Ag85B质粒的构建及其免疫原性的可视化研究

构建以Ag85B基因为基础的DNA疫苗,并用活体红色荧光成像探讨其在动物体内免疫原性。方法：以pET28a—Ag85B基因组DNA为模板,用PCR扩增获得Ag85B全长基因;将PCR产物构建成pUCm—Ag85B亚克隆;经限制性内切酶消化后克隆人pVAX1载体中构建pVAX1-Ag85B,酶切、DNA测序鉴定。并将构建的DNA疫苗经肌肉免疫可视化膀胱癌移植瘤模型,通过活体红色荧光成像,从整体上直接、可视地观测Ag85B的免疫原性。结果：经NheI和HindⅢ双酶切、DNA测序鉴定后证实,Ag85B基因定向克隆人pVAX1载体,碱基无突变,序列完全正确。免疫小鼠后,pVAX1-Ag85B组和BCG组均可提高淋巴细胞增殖活性,但效果不及卡介苗。结论：成功地构建了pVAX1-Ag85B质粒,为膀胱肿瘤的基因免疫治疗提供可靠的实验方法。免疫小鼠后,可提高膀胱癌小鼠免疫水平,但效果不及卡介苗。     

pCH510转染膀胱癌细胞系BIU-87对卡介苗抑瘤作用的影响

目的研究膀胱癌细胞系BIU-87体外转染pCH510后,CH50多肽的表达及其对卡介苗(bacilluscalmette-guerin,BCG)抑瘤作用的影响。方法在LipofectimineTM2000的介导下,将质粒pCH510体外转染给BIU-87细胞,采用免疫组织化学S-P法和WesternBlot法鉴定CH50多肽的表达;通过四唑盐比色法(MTT法)观察pCH510转染BIU-87对BCG细胞毒作用的影响。结果BIU-87细胞转染pCH510后阳性表达CH50多肽,对照组则不表达;CH50多肽阳性表达增强了BCG对BIU-87的细胞毒性作用(P<0.05)。结论转染pCH510后,BIU-87细胞表达CH50多肽,并因此促进了BCG对膀胱癌细胞的抑制作用。