小鼠P2X_7受体基因短发夹RNA慢病毒载体构建与鉴定

目的应用RNA干扰技术构建小鼠P2X_7受体(P2X_7R)基因重组慢病毒载体并鉴定。方法对小鼠P2X_7R mRNA分析,设计合成单链引物,经退火后形成双链寡核苷酸序列,放入经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切线性化的pLVX-shRNA-Puro慢病毒质粒载体中,连接构建慢病毒干扰载体pLVX-shRNA-P2X_7R。筛选出阳性克隆,进行基因测序鉴定。测序验证正确后,与慢病毒包装辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞,收集病毒上清。经浓缩后感染小鼠RAW264.7细胞,采用流式细胞术评价病毒滴度及感染效率;利用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法鉴定P2X_7R shRNA慢病毒的干扰效率。结果测序证实,成功地构建了重组质粒pLVX-shRNA-P2X_7R及小鼠P2X_7R基因shRNA慢病毒载体。重组慢病毒的滴度为2×1010TU·L~(-1),感染效率约为95%。干扰效率约为70%。结论应用RNA干扰技术可成功构建小鼠P2X_7R基因shRNA慢病毒载体。     

人β-COP-shRNA慢病毒载体构建及干扰效应检测

目的采用常规转染试剂难以将人β-COP-shRNA转染至THP-1细胞。构建人β-COP特异性的shRNA慢病毒载体,并测定其对靶基因β-COP的抑制效应。方法设计合成针对人β-COP基因靶点特异的4对shRNA寡聚单链DNA,插入p GMLV-SC1载体中,构建慢病毒重组载体。将重组载体和包装质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒并测定滴度。用慢病毒感染THP-1细胞,定量PCR和Western blot检测干扰载体对β-COP基因的干扰效果。结果测序证实,β-COP基因的shRNA寡聚核苷酸序列已插入慢病毒载体,转染HEK 293T细胞,经包装得到4种慢病毒,病毒滴度为1×109TU/m L。定量PCR分析显示,4种β-COP-shRNA慢病毒感染的THP-1细胞中β-COP基因mRNA表达量分别为0.831±0.065、0.675±0.079、0.260±0.050、0.497±0.067,较对照(1.000±0.000)明显升高(P<0.01);其抑制率分别为16.9%、32.5%、74.0%和50.3%。Western blot结果表明,4种干扰载体均可抑制β-COP蛋白表达,其中β-COP-shRNA 3的沉默效率为76.4%。结论成功构建了人β-COP-shRNA干扰载体,证实了干扰载体对靶基因有较好的沉默效果。     

针对糖尿病易感基因Vβ13的慢病毒系统的建立及其对T细胞的转导

目的 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,有效沉默连接红色荧光蛋白mCherry与靶基因1型糖尿病易感基因Vβ13的表达,建立一种简便有效基因沉默的系统,并初步研究慢病毒感染T细胞的可能性.方法 以Vβ13 mRNA编码序列作为干扰靶点,以慢病毒质粒UTG作为载体,构建靶向Vβ13的shRNA表达质粒,构建携带Vβ13的mCherry红色荧光蛋白的质粒作为验证shRNA有效性的靶点,并转染293FT细胞.通过红色荧光的表达及RT-PCR和Western blot确定最佳沉默Vβ13序列后,将有效的UTG-Vβ13质粒与辅助质粒共转染293FT细胞,低温超高速离心,获取高滴度慢病毒.应用慢病毒感染大鼠T细胞,光镜观察T细胞被慢病毒感染的情况,流式细胞术检测T细胞的绿色荧光表达情况.结果 成功构建Vβ13-shRNA慢病毒载体UTG-shRNA-Vβ13,RT-PCR及Western blot结果显示慢病毒感染的293FT细胞Vβ13 mRNA及蛋白表达相对于对照组显著降低.构建的慢病毒可以成功感染T细胞.结论 红色靶基因-绿色慢病毒系统具有简便的筛选性能;UTG慢病毒对神经干细胞具有较高感染效率.可作为一种良好的基因导入载体,实现慢病毒介导的RNA干扰在T细胞内的有效表达,并为T细胞过继性转移的相关研究提供技术支持.     

慢病毒载体介导的shRNA对小鼠T细胞CD28基因表达的影响

目的探讨编码针对小鼠CD28的短发卡状RNA（short hairpin RNA,shRNA）的慢病毒载体对小鼠T细胞CD28基因表达的影响。方法设计并合成3对靶向小鼠CD28的特异性干扰序列和1对非特异性干扰序列,亚克隆入慢病毒载体pLB中,构建出重组慢病毒干扰质粒,行PCR鉴定并进一步测序证实。分别将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,生产慢病毒颗粒,并依据绿色荧光蛋白（GFP）表达水平检测病毒滴度。慢病毒感染小鼠脾淋巴细胞,实时荧光定量RT-PCR和Western blot技术分别从mRNA水平和蛋白水平检测CD28的表达。结果PCR鉴定及测序结果证实4种重组慢病毒质粒均构建成功,重组慢病毒滴度均达1×1011U/L。感染T细胞后,CD28基因mRNA和蛋白表达量均有明显下降。结论成功构建了CD28 shRNA慢病毒载体,可有效下调小鼠T细胞CD28基因的表达,其为进一步研究体内沉默CD28基因控制移植物抗宿主病奠定了基础。     

大鼠PEDF基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠PEDF 基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定,探讨PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响.方法 构建PEDF基因过表达质粒,测序鉴定.针对PEDF基因不同干扰靶点构建4种RNAi 病毒载体质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA,测序鉴定.过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot方法进行外源筛靶确定PEDF基因RNAi 有效靶序列.有效RNAi 病毒质粒和其他3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后, 收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度.结果 过表达质粒及4种RNAi质粒构建成功.Western blot外源筛靶显示2个靶点能有效敲减目的基因的表达.PEDF shRNA慢病毒表达载体Serpinf1-RNAi-LV经293T细胞包装成功,收集293T细胞分泌的病毒上清测定浓缩病毒悬液的滴度为2×1012Tu/L.结论 成功构建了PEDF基因的RNAi慢病毒载体,为研究PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响打下基础.     

大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒,为进一步探究RNA干扰技术对CaSR在肾脏对钙重吸收调控中的作用提供基础准备。方法(1)CaSR基因慢病毒高表达细胞系构建:PCR克隆CaSR目的基因,双酶切CaSR基因和pcDNA3.1载体,连接酶连接,阳性克隆筛选后测序,将pcDNA3.1-CaSR高表达载体和空载体(对照组)经慢病毒包装后转染NRK-52E细胞,Western blot测定CaSR蛋白表达;(2)CaSR基因的RNA干扰质粒构建:设计3对靶向干扰CaSR基因的RNA引物序列,双酶切干扰引物和pLV[shRNA]-EGFP载体,然后经T4连接酶连接,获得重组干扰质粒pLV[shRNA]-EGFP-CaSR,转化至感受态E.coli DH5,阳性克隆筛选后测序,测定干扰效率。结果(1)测序结果与CaSR基因序列一致;(2)测序结果与设计shRNA引物序列一致;(3)Western blot检测获得慢病毒高表达稳定细胞系的CaSR蛋白;(4)干扰质粒干扰高表达细胞系有效。结论成功构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒。     

DPC4RNAi慢病毒载体的构建及其基因沉默效应

目的 :构建DPC4基因RNA干扰慢病毒载体及其基因沉默效应。方法 :针对DPC4基因序列,利用网站设计程序按照RNA干扰序列设计原则,设计多个RNA干扰靶点序列,根据设计经验和设计软件进行评估测定,选择最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程;生工生物合成含干扰序列的双链DNA oligo,其两端含酶切位点粘端,直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞,对长出的克隆进行酶切鉴定,挑选出阳性克隆测序,进行测序比对后,鉴定阳性克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体。结果:经过Western blot方法检测和测序证实,成功构建了DPC4 shRNA慢病毒载体LVshSmad4,并成功制备了DPC4shRNA慢病毒,3株病毒感染细胞后均具有有效的基因沉默,其中SH1序列最为显著。结论 :DPC4基因RNA干扰靶点的成功设计和RNA干扰靶点慢病毒载体制备,而且具有显著的基因沉默效果。     

DPC4 RNAi慢病毒载体的构建及其基因沉默效应

目的：构建DPC4基因tLNA干扰慢病毒载体及其基因沉默效应。方法：针对DPC4基因序列,利用网站设计程序按照RNA干扰序列设计原则,设计多个RNA干扰靶点序列,根据设计经验和设计软件进行评估测定,选择最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程;生工生物合成含干扰序列的双链DNA oligo,其两端含酶切位点粘端．直接连入酶切后的IKNA干扰载体上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞,对长出的克隆进行酶切鉴定,挑选出阳性克隆测序,进行测序比对后,鉴定阳性克隆即为构建成功的目的基因1KNA干扰慢病毒载体。结果：经过Western blot方法检测和测序证实,成功构建了DPC4shRNA慢病毒栽体LVshSmad4,并成功制备了DPC4 shRNA慢病毒,3株病毒感染细胞后均具有有效的基因沉默,其中SHI序列最为显著。结论：DPC4基因RNA干扰靶点的成功设计和RNA干扰靶点慢病毒载体制备,而且具有显著的基因沉默效果。     

慢病毒介导的GSK-3β基因稳定沉默表达的SH-SY5Y细胞系建立

目的构建靶向糖原合成激酶3β(GSK-3β)基因的RNA干扰慢病毒载体,建立其对GSK-3β基因沉默表达的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的细胞系模型。方法根据GSK-3βmRNA序列设计合成靶向目的基因的短发夹状RNA(shRNA)序列并构建慢病毒表达载体,经酶切和测序鉴定,将慢病毒重组载体与包装载体共转染293T细胞,获得纯化浓缩病毒液,侵染SH-SY5Y细胞,采用绿色荧光示踪观察细胞的转染情况,设为慢病毒干扰组(实验组)、阴性对照组(Lenti-NC组)、空白对照组(Blank组),利用qRT-PCR和Western blot法检测GSK-3βmRNA和蛋白表达水平。结果成功构建了靶向GSK-3β的shRNA慢病毒,重组慢病毒转染人SH-SY5Y细胞,72 h后观察转染效率达90%以上,与对照组比较,靶基因变化结果显示,实验组中GSK-3βmRNA和蛋白的表达均显著降低(均P<0.01)。结论有效建立慢病毒介导的GSK-3β基因稳定沉默表达的SH-SY5Y细胞模型,为体外评价研究GSK-3β沉默后药物或行为治疗AD提供试验工具细胞模型。     

连环蛋白p120 shRNA重组慢病毒载体构建及鉴定

目的构建连环蛋白p120特异性shRNA重组慢病毒载体,感染胰腺癌PANC-1细胞,鉴定干扰效果。方法针对p120ctn mRNA设计合成3对shRNA序列,连接入酶切线性化的慢病毒载体pGCSIL-GFP,PCR鉴定及测序正确后与构建成功的含p120ctn基因的载体pGC-FU-p120ctn-3FLAG共转染293T细胞,蛋白质印迹分析筛选有效shRNA序列,包装慢病毒,测定病毒滴度。重组慢病毒感染胰腺癌PANC-1细胞,实时定量PCR及蛋白质印迹分析鉴定干扰效果。结果 PCR及测序证实成功构建出p120ctn-shRNA-LV慢病毒载体,病毒滴度达到3×109TU/ml。重组慢病毒感染PANC-1细胞后,实时定量PCR提示PANC-1细胞p120ctn mRNA表达下降82.6%(P0.05),蛋白质印迹分析提示p120ctn蛋白表达较转染前显著下降。结论成功构建出p120ctn基因shRNA慢病毒载体,为进一步研究p120ctn在胰腺癌浸润及转移中的作用奠定了基础。     

人eIF4E基因shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的设计并构建人真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)基因shRNA慢病毒质粒表达载体。方法设计合成人eIF4E基因RNA干扰双链DNA片段,重组到慢病毒质粒PLVTHM上,然后进行PCR鉴定和测序分析。重组质粒与3种包装质粒混合,以LipoD293TMDNA In Vitro包裹后转染293T细胞,收获病毒上清液感染宫颈癌HeLa细胞。结果经过PCR鉴定出的重组载体测序结果与目的序列一致,成功构建人eIF4E基因shRNA慢病毒质粒表达载体及获得相应慢病毒,并成功感染HeLa细胞,可见绿色荧光蛋白表达。结论成功构建人eIF4E基因shRNA慢病毒载体,为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。     

ASIC3-shRNA干扰慢病毒质粒的构建及其效率的鉴定

目的: 构建酸敏感离子通道3(acid sensing ion channels 3, ASIC3)干扰慢病毒质粒并进行效率鉴定。方法: 利用GenBank获取ASIC3基因序列并合成相应干扰序列,通过T4 DNA连接酶将ASIC3基因片段连接至环状Plko.1 Puro载体,将重组质粒转染293T细胞获取慢病毒,用实时荧光定量PCR(qRT PCR)检测病毒滴度;将包装之后的慢病毒感染PC12、BV2、N2a细胞,分别分为ASIC3 shRNA组和EGFP shRNA组(阴性对照),经慢病毒感染后用qRT PCR和免疫印迹技术分别检测ASIC3 mRNA和蛋白表达。结果： 合成的ASIC3干扰序列成功连接至Plko.1 Puro载体;qRT PCR及DNA测序鉴定结果证实,ASIC3 shRNA质粒构建成功;qRT PCR与免疫印迹结果表明,在PC12、BV2、N2a细胞中,与EGFP shRNA组相比,ASIC3 shRNA组ASIC3 mRNA和蛋白表达量均明显下调(P＜0.05)。病毒滴度约为1×109 IU/mL。 结论： ASIC3 shRNA干扰慢病毒质粒构建成功。     

人AURKA基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的:针对AURKA基因构建RNA干扰重组慢病毒质粒并进行慢病毒包装,初步探讨AURKA基因的功能。方法:应用pGCLV-GFP慢病毒载体构建针对AURKA的shRNA载体,转染包装293T细胞,收集病毒上清液,转染肺腺癌细胞株A549。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况确定转染效率,应用Western blot技术检测AURKA基因在蛋白水平表达的变化,以明确RNAi的抑制率。应用BrdU法分析干扰AURKA前后A549细胞增殖情况的变化,运用克隆形成实验检测干扰AURKA后A549细胞株对长春新碱敏感性的变化。结果:针对AURKA基因的RNAi慢病毒表达载体构建成功,PCR和DNA测序鉴定实验表明插入位点与干扰片断的碱基序列完全正确。在293T细胞中进行慢病毒包装,获得高滴度病毒上清液。通过重组慢病毒载体将AURKA shRNA转导入A549细胞中,转染效率为100%。Western blot检测证实LV-AURKA慢病毒显著抑制AURKA的表达,BrdU检测显示AURKA基因表达下调抑制了A549细胞的增殖。克隆形成实验表明AURKA基因表达增强A549细胞对长春新碱的敏感性。结论:慢病毒载体介导的靶向AURKA的RNA干扰可有效抑制AURKA表达,降低肺腺癌A549细胞的增殖能力,并且增强A549细胞对长春新碱的敏感性。     

构建shRNA慢病毒载体抑制U937细胞株VEGFR-1基因的表达

目的构建针对血管内皮生长因子受体1（vascular endothelial growth factor receptor 1, VEGFR-1）基因的siRNA前体表达载体．鉴定其对U937细胞株VEGFR—j基因干扰效率。方法体外设计并合成针对VEGFR-1基因的慢病毒shRNA干扰载体．通过PCR及测序证实载体构建成功。将慢病毒颗粒以最适滴度转染人单核白血病细胞株U937．应用Real—TimePCR、Western印迹法检测抑制效率。结果构建的慢病毒载体的序列通过PCR、测序等鉴定,与设计序列相同。Real—TimePCR检测显示U937细胞干扰组VEGFR-1mRNA表达率下降75．98％,Western印迹法显示U937细胞干扰组VEGFR-1蛋白表达量较空白载体对照组明显减少。结论构建的shRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制U937细胞株VEGFR—1基因的表达。     

靶向 RECQL4基因的 shRNA 慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：构建介导 RECQL4 RNA 干扰的 shRNA 慢病毒表达载体。方法将人工合成的 RECQL4 siR－NA 经 PCR 扩增后与线化的 pLKO．1慢病毒表达载体连接,经测序鉴定后,将 pLKO．1－RECQL4－shRNA 与慢病毒包装质粒共转染入 HEK －293T 细胞,产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。体外感染人结肠癌细胞 RKO 后,实时定量 PCR 和 Western blot 检测 RECQL4 mRNA 和蛋白的沉默效果。设置未加入任何慢病毒表达载体的 RKO 细胞为未感染组,感染 pLKO．1－scramble －shRNA 慢病毒载体为阴性对照组。结果基因测序结果证实成功构建 pL－KO．1－RECQL4－shRNA 慢病毒表达载体。测定包装后的慢病毒颗粒滴度为6.70×107 IU／mL。感染 RKO 细胞后,RECQL4的 mRNA 和蛋白表达量均低于阴性组和未感染组。结论成功构建靶向 RECQL4基因的 shRNA 慢病毒表达载体,可有效抑制人结肠癌 RKO 细胞 RECQL4 mRNA 和蛋白的表达。     

β-arrestin 2 shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建β-arrestin 2的shRNA慢病毒载体,获得稳定低表达β-arrestin 2的人非小细胞肺癌A549细胞并验证敲低效果。方法 查询4对可信的β-arrestin 2敲低序列,将载体质粒pSicoR-GFP线性化,构建目的质粒,转化感受态细胞,对长出的克隆应用菌落PCR鉴定,再对阳性结果进行测序和比对分析。重组病毒质粒与另外三种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48h后,收集细胞培养上清液,导入人非小细胞肺癌细胞A549中,用qRT-PCR检测转染效率。结果 成功构建β-arrestin 2的shRNA慢病毒载体质粒,测序比对结果一致。qRT-PCR检测发现一组β-arrestin 2的mRNA表达只有对照组的56%。结论 成功构建β-arrestin 2的shRNA慢病毒载体,并验证其在人非小细胞肺癌细胞A549中敲低效果显著。     

NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定NSPc1-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术以及慢病毒感染系统进一步研究NSPc1的功能.方法 设计针对NSPc1mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成带内切酶粘/平末端的双链后,与酶切后的pLentiLox3.7载体片段进行连接、转化.用双酶切及DNA测序鉴定重组克隆.提取阳性克隆质粒并转染293T细胞,收集细胞全蛋白用Western检测RNAi效果.结果 重组克隆经酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,Western检测证实设计的三条RNA干扰序列有效敲低了293T细胞中的内源性NSPc1.结论 3个NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的成功构建为应用基于慢病毒系统的RNAi技术来研究NSPc1基因的功能打下了基础.     

CD47-shRNA慢病毒载体构建及其介导Hep-2细胞CD47基因沉默效应鉴定

目的构建CD47靶向shRNA慢病毒干扰载体,并观察其对Hep-2细胞CD47基因的抑制效应。方法设计CD47靶点特异性的寡核苷酸序列,利用酶切反应合成含特异性系列线性化的pGCSIL-GFP载体,包装293T细胞产生慢病毒并行滴度测定,再转染人喉癌Hep-2细胞,通过实时荧光定量PCR及Western Blotting检测重组慢病毒对CD47靶基因在mRNA和蛋白水平上的沉默抑制情况。结果阳性克隆PCR及测序证实针对CD47基因shRNA慢病毒干扰载体构建成功,RT-PCR及Western Blotting检测载体在mRNA和蛋白水平上可抑制喉癌Hep-2细胞的CD47表达。结论成功构建针对CD47基因的慢病毒干扰载体,为进一步行喉癌CD47基因功能研究提供了较好的实验工具。     

新型shRNA慢病毒载体抑制TGIF表达及对TGF-β通路的调节

目的构建针对同源域蛋白TGIF（5′-TG-3′interacting factor）可诱导表达shRNA的慢病毒载体,鉴定其在大肠癌细胞系DLD1中对TGIF的基因沉默效率,进一步研究其对TGF-β信号通路下游基因的影响。方法设计并合成针对TGIF的RNA干扰序列,克隆到可被强力霉素诱导的新型Tet-on慢病毒载体,将慢病毒颗粒感染大肠癌细胞系DLD1细胞。培养并分离细胞克隆后,使用强力霉素（doxcycline）进行诱导,用Real-Time PCR和Western印迹法检测TGIF和PAI-1的表达情况。结果构建了针对TGIF可诱导shRNA的真核表达病毒载体并获得相应的病毒,病毒可以高效感染大肠癌细胞系DLD1。在强力霉素诱导下,TGIF在DLD1细胞系的表达得到有效抑制,TGF-β下游基因PAI-1和p15表达明显升高。结论本研究成功构建了可诱导表达shRNA慢病毒载体,其在强力霉素诱导下可以有效抑制TGIF在大肠癌细胞系内的表达;TGIF可以抑制TGF-β信号传导通路。     

NgR特异性siRNA筛选及其慢病毒表达载体构建

目的:筛选出高效的NgR(Nogo受体)特异性siRNA,并构建其慢病毒表达载体。方法:按照E1bashir等设计原则和siRNA的要求,设计、合成4对siRNA,转染体外培养大鼠原代皮层和海马细胞,筛选出基因高沉默效率的NgR特异性siRNA;将获得的高沉默效率siRNA克隆入慢病毒质粒pRNAT—U6.2/Lenti(SD1259),构建NgR特异性siRNA慢病毒表达载体,然后进行酶切鉴定及基因测序。结果:在4对siRNA中筛选出高沉默效率的NgR特异性siRNA199序列,将该序列的发卡式RNA成功克隆入载体pRNAT-U6.1/Neo,构建成NgR特异性siRNA199表达载体,酶切鉴定及基因测序表明设计序列完全相符,目的基因序列准确无误。结论:NgR特异性siRNA199及其慢病毒表达载体构建成功,为进一步观察NgR特异性慢病毒载体RNA干扰抑制大鼠NgR mRNA表达的神经元细胞实验奠定了基础。