趋化因子受体CCR5在病毒性肝炎患者PBMC中的表达

Ｌｏｃａｔｉ等[1] 报道外周血单个核细胞中的细胞因子趋化因子受体 5 (ＣＣＲ5 )的表达与ＨＩＶ的感染有一定的关系 ,且与激活的Ｔｈ1和Ｔｃ1细胞密切相关。本文用流式细胞仪对病毒性肝炎患者外周血单个核细胞 (ＰＢＭＣ )ＣＣＲ5的表达水平进行了检测 ,部分作了细胞培养前后的检测。籍以了解病毒性肝炎患者体内的ＣＣＲ5的表达状况 ,同时探讨ＣＣＲ5在病毒性肝炎发病机制中的作用。1　材料与方法1 1　研究对象　依据 1995北京传染病学与寄生虫学会制定的诊断标准确诊的乙型肝炎 (ＨＢ )患者 2 0例 ,另选健康者 2 0例以资对照 (ＮＣ )。1 2…     

趋化因子受体CCR5及CXCR4在HIV-1感染中的作用

趋化因子(chemokines)是一类具有趋化作用的小分子肤,其受体CCR5和CXCR4在HIV-1病毒进人免疫细胞过程中起重要作用.趋化因子结合到含有7个疏水跨膜螺旋的G蛋白偶联的受体超家族,通过一定的信号传导途径引起生理效应,包括趋化作用、免疫调节、抗病毒免疫、调节造血与血管生成以及参与细胞生长和代谢.     

趋化因子及其受体的研究新进展

近年来，随着生物信息学和基础信息的发展，人们发现了许多新的趋化细胞因子及其受体，特别是趋化因子受体被发现充当HIV感染的协同受体后，趋化因子领域已经引起了人们的广泛关注。本文探讨了趋化因子及其受体在抗肿瘤治疗，抗HIV感染及抗炎方面的临床应用价值，就趋化因子及其受体领域的研究新进展进行综述。     

趋化因子受体HIV-1

β－趋化因子受体５（ＣＣＲ５）是近年来新克隆的趋化因子受体超基因家族的一个重要成员之一,由于它的被发现才使人们认识到ＨＩＶ－１ 的感染除了Ｔ 细胞上的ＣＤ４＋ 外还有另一条通过巨噬细胞表面辅助受体ＣＣＲ５ 介导的传播途径。本文就近年来有关趋化因子受体基因家族的组成成员、结构与功能、不同人种的基因型、ＨＩＶ－１ 与细胞表面辅助受体ＣＣＲ５ 的结合,进入机理及阻断ＨＩＶ－１ 感染的可能途径作一详要的综述     

趋化因子及其受体与人免疫缺陷病毒感染

根据蛋白质一级结构的性质和特点,将趋化因子分为CXC、CC、C和CX3C四类。MIP－1α、MIP－1β和RANTES等CC趋化因子具有抗HIV作用。HIV分别以CXCR4、CCR5作为第二受体感染T细胞与单核-巨细胞。CCR5基因突变有8种,以CCR5Δ32为主。CCR5基因突变导致对HIV感染的敏感性下降,由HIV感染向AIDS演进速度放慢以及AIDS患者生存期延长等。不同人群中CCR5基因突变率不同,对HIV感染流行强度与疾病状态有显著影响。     

HIV-1协同受体CXCR4、CCR5及相关趋化因子SDF-1在胎盘的表达

目的：研究HIV-1协同受体CXCR4、CCR5及CXCR4的特异性配体SDF-1在人胎盘组织的表达，探索HIV-1子宫内垂直传播的分子机制。方法：半定量RT-PCR检测早、中、晚孕期胎盘及早孕滋养细胞CXCR4、CCR5 mRNA水平；免疫组化和免疫细胞化学检测早孕胎盘及原代培养滋养细胞CXCR4、CCR5蛋白表达；原位杂交及免疫组化分析SDF-1在早孕胎盘的表达；ELISA测定滋养细胞SDF-1的动态分泌水平。结果：各孕期胎盘表达CXCR4及CCR5 mRNA；CXCR4蛋白定位于滋养细胞，而CCR5蛋白定位于绒毛基质中。滋养细胞可转录并翻译SDF-1，且能分泌可溶性SDF-1。结论：滋养细胞同时表达CXCR4及SDF-1，SDF-1可能通过降调CXCR4而拮抗X4-HIV-1感染胎儿细胞；R5-HIV-1或许能通过滋养层裂隙感染CCR5^#基质细胞和/或Hotbauer细胞，从而发生子宫内垂直传播。     

趋化因子受体与信号转导

趋化因子受体是一类表达于不同类型细胞上的含有 7个跨膜区的 G蛋白偶联受体超家族 ,通过与趋化因子作用参与细胞的生长、发育、分化、凋亡、组织分布等 ,同时亦是 HIV的协同受体。它可激活磷脂酶、脂类激酶、蛋白激酶 ,调节胞内 Ca2 +浓度 ,激活 JAK/ STAT途径 ,引发一系列的信号转导通路     

人趋化因子受体CCR4的克隆与表达

目的：建立pcDI-CCR4稳定转染并具有CCR4功能性表达的细胞株,为深入研究CCR4配体提供基础。方法：利用RT－PCR技术进行人CCR4的cDNA克隆化。通过基因转染技术获得稳定转染细胞株,利用趋骅实验、钙流实验证实稳定转染细胞能有效表达CCR4并具有生物功能。结果：成功地将CCR4 cDNA克隆于真核表达质粒pcDI,转染HEK293细胞获得稳定表达CCR4的HEK293细胞,可被RANTES诱导产生趋化反应和钙内流反应。结论：建立的pcDI－CCR4稳定转染细胞株能有效表达CCR4并具有生物功能。     

趋化因子受体CCR5在急性移植物抗宿主病防治中的研究

趋化因子受体CCR5(CC chemokine receptor 5)属于β趋化因子受体,表达于人体多种免疫细胞表面,与配体特异性结合发挥募集趋化免疫细胞定向迁移的作用,在急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)的发生过程中发挥关键作用,逐渐成为移植免疫研究的热点...     

靶向趋化因子受体CCR7的反义肽核酸对树突状细胞凋亡的影响

目的研究靶向趋化因子受体CCR7的反义肽核酸（PNA）对树突状细胞（DC）CCR7蛋白表达及凋亡的影响，并探讨其凋亡机制。方法体外培养大鼠骨髓来源的Dc，脂多糖（LPS）诱导成熟。设计靶向CCR7mRNA翻译起始区的反义PNA，以随机PNA和空白组为对照处理体外培养7d的未成熟Dc，脂多糖诱导48h后收集成熟Dc，免疫细胞化学染色法检测CCR7蛋白表达，流式细胞术检测细胞凋亡率，Westernblot检测磷酸化Akt和Akt蛋白表达。应用渥曼青霉素（wortmannin）抑制磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，P13K）／Akt信号通路进一步观察磷酸化Akt蛋白表达和细胞凋亡率的变化。结果反义PNA组DCCCR7蛋白表达明显低于随机PNA组和空白组，而细胞凋亡率却明显增高，差异有统计学意义（P〈0．05），Westernblot检测显示反义PNA组Akt蛋白磷酸化水平明显低于随机PNA组和空白组，差异有统计学意义（P〈0．05）。DC经P13K抑制剂预处理后，CCR7介导的Akt蛋白磷酸化及抗凋亡作用被阻断。结论CCR7反义PNA能够有效抑制体外培养的大鼠DC趋化因子受体CCR7的表达并导致其发生凋亡，其机制可能是阻断了CCR7介导P13K／Akt信号转导通路的活化。     

晚期糖化终产物受体反义 RNA 腺相关病毒载体的构建及在肾脏系膜细胞中表达

目的 构建晚期糖化终产物受体(RAGE)反义RNA腺相关病毒载体,并在大鼠肾脏系膜细胞中表达. 方法 构建腺相关病毒介导的RAGE反义RNA载体,3个质粒共转染293细胞,获得病毒原液,感染大鼠肾脏系膜细胞,流式细胞术、RT-PCR、ELISA检测重组病毒感染的细胞RAGE的表达和分泌细胞外基质的情况.结果 经酶切鉴定、序列分析显示RAGE基因片段正确完整反向插入pAAV-MCS.利用293细胞包装获得病毒原液的滴度为8.7×107VP/mL.感染重组病毒的细胞与正常细胞比较RAGE表达被抑制(48.2±6.1)%,分泌Ⅳ型胶原(ColⅣ)水平明显下降(P＜0.05).结论 成功构建具有抑制功能的RAGE反义RNA腺相关病毒载体,为进一步研究RAGE的作用机制,以及基因治疗RAGE相关疾病提供一个重要工具.     

人IL-8正义和反义真核表达载体的构建与表达

目的:构建人IL- 8正义和反义真核表达载体.方法:RT-PCR扩增正义和反义IL- 8基因片段后, 将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+), 通过菌落PCR、双酶切及测序进行鉴定后, 采用脂质体法分别瞬时转染至人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3细胞中, 并用RT-PCR和ELISA法检测细胞转染后IL- 8的表达水平.结果:经验证, 重组人IL- 8正义/反义真核表达载体构建正确.pcDNA3.1(+)-ssIL- 8转染A2780细胞后, 其IL- 8 mRNA及蛋白表达水平均显著增加;而pcDNA3.1(+)-asIL- 8转染SKOV3细胞后, 其IL- 8分泌水平降低.结论:成功构建了人IL- 8正义/反义真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ssIL- 8/pcDNA3.1(+)-asIL- 8, 为后续研究IL- 8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用打下基础.     

表达反义hREV3基因片段的真核细胞表达质粒的构建

目的：构建真核细胞表达重组体,为今后利用反义核酸阻断技术研究ｈＲＥＶ３基因功能４及其与细胞遗传不稳定性的关系提供物质材料。方法：用内切酶ＢａｍＨⅠ及Ｂａｍ ＨＩ＋ＨｉｎｄⅢ分别对ｐＢＳ－ｈＲＥＶ３进行单酶切和双酶切,从而得到含ｈＲＥＶ３ ｃＤＮＡ特异性保守序列的两种长度片段,分别将两者插入真核细胞载体;ｐＢＫ－ＲＳＶ和ｐＭＡＭｎｅｏ ａｍｐ＾－。     

Downregulation of CCR5 expression on cells by recombinant adenovirus containing antisense CCR5, a possible measure to prevent HIV-1 from entering target cells

Chemokine (C-C motif) receptor 5 (CCR5) is one of the major co-receptors for the macrophage (M)-tropic HIV-1. To prevent HIV-1 from entering into target cells, we inhibited CCR5 expression on target cell surface by recombinant adenovirus containing anti-sense CCR5 cDNA. A fragment of 653 bp cDNA located in the 5' region of CCR5 cDNA was reversely inserted into pAdTrack-CMV. Recombinant adenovirus containing antisense CCR5 cDNA (Ad-antiR5) was obtained by homologous recombination of resultant plasmid with the adenoviral backbone plasmid pAdEasy-2 in E. coli BJ5183 and then packed in AD-293 cells. Rate of positive CCR5 on U937 cell surface measured by flow cytometry was decreased from 89.53% to 1.88% after U937 cells infected with Ad-antiR5 for 24 hours, and this reduction lasted at least for 10 days. After challenged with HIV-1, the U937 cells infected with Ad-antiR5 produced much less p24 antigen in cultured medium than those infected with control recombinant adenovirus and the uninfected cells. The recombinant adenovirus had no effect on chemotactic activity and proliferation of the U937 cells. Therefore, the recombinant adenovirus containing anti-sense CCR5 cDNA can down-regulate CCR5 expression on U937 cells and protect the cells from HIV-1 infection without effects on their chemotaxis activity and proliferation function.     

趋化因子受体CXCR4及CCR5真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的:构建人CXCR4及CCR5真核表达重组质粒,转染人卵巢癌细胞SKOV3,建立稳定转染细胞系并观察其表达效果。方法:从人外周血单个核细胞中提取RNA,采用反转录PCR技术扩增CXCR4及CCR5的基因编码序列,将序列克隆至真核表达载体pEGFP,经酶切和测序鉴定后,应用脂质体转染技术将质粒cancer.pEGFP-CXCR4和pEGFP-CCR5分别导入不表达CXCR4及CCR5蛋白的SKOV3细胞,经G418抗性筛选得到阳性细胞克隆并扩大培养成系。分别采用免疫荧光染色和流式细胞术方法(FCM)检测稳定转染细胞株CXCR4和CCR5的表达。结果:构建了真核表达载体pEG-FP-CXCR4和pEGFP-CCR5;得到了抗G418阳性细胞克隆;免疫荧光染色和FCM检测结果显示,转染质粒的SKOV3细胞表达CXCR4和CCR5。结论:成功建立稳定表达趋化因子受体CXCR4和CCR5的卵巢癌细胞株,为CXCR4和CCR5在卵巢癌中的研究工作提供依据及平台。     

脂肪储存小滴蛋白5基因真核表达载体的构建及亚细胞定位

目的:构建pCMV5-HA与脂肪储存小滴蛋白5(LS-DP5)的融合基因真核表达载体,观察其在非洲绿猴肾成纤维细胞COS7中的表达,通过免疫荧光技术确定LSDP5的亚细胞定位。方法:采用NdeI和BamHI酶切pCMV5-HA质粒,用BglII和NdeI酶切pMD18-LSDP5质粒,克隆到pCMV5-HA载体,测序鉴定后,通过脂质体法转染COS7细胞,通过免疫荧光技术观察其在COS7细胞中的表达,并利用荧光染料Bodipy493/503定位脂滴,探讨LSDP5与脂滴之间的关系。结果:酶切及DNA测序证实重组质粒pCMV5-HA-LSDP5构建成功。荧光显微镜观察显示,pCMV5-HA-LSDP5融合蛋白定位于细胞质内,并定位于脂滴表面。结论:成功构建了重组质粒pCMV5-HA-LSDP5;融合蛋白分布于细胞质并与脂滴存在共定位关系。     

反义c-myc真核表达载体的构建及其对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的:观察反义c-myc真核表达载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用。方法:构建反义和正义c-myc真核表达载体pcDNA3-myc-antisense和pcDNA3-myc-sense,利用lipofectin将正义及反义c-myc真核表达载体导入大鼠气道平滑肌细胞,MTT法观察正义和反义c-myc真核表达载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的作用,流式细胞技术检测细胞周期变化,免疫组织化学染色检测c-Myc蛋白的表达。结果:反义c-myc真核表达载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖,延长细胞S期,反义c-myc真核表达载体可降低气道平滑肌细胞c-Myc蛋白的表达。结论:反义c-myc真核表达载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖。     

人反义c-myc重组逆转录病毒表达载体pLNC-aM2和pLNC-aM3的构建

ｃ－Ｍｙｃ在血管平滑肌细胞（ｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌ，ＶＳＭＣ）增殖、迁移和表型转换（收缩型→合成型）中起着关键作用。为更好地调研ｃ－ｍｙｃ分子中不同区域的作用效应，了解ｃ－ｍｙｃ的转录调控机制，进而找出最佳的反义封闭靶区域，为ＶＳＭＣ增殖和其他增生性疾病的基因治疗提供依据，我们采用分子克隆技术，分别构建了人ｃ－ｍｙｃ第１、第２和第３外显子的反义逆转录病毒表达载体。本文将介绍第２，３外显子反义载体ｐＬＮＣ－ａＭ２和ｐＬＮＣ－ａＭ３的构建过程。     

抗mdr1 RNA干扰真核表达载体的构建

目的：构建抗mdr1 RNA干扰真核表达栽体。方法：根据Reynolds的设计原则．针对mdr1的序列及二级结构选择了三条靶序列,人工合成三条shRNA序列的编码DNA序列,重组入Pgenesil-1栽体中．转化大肠杆菌DH5α,碱裂解法提质粒,酶切及测序鉴定。结果：用PstⅠ和SalⅠ酶切鉴定质粒Pmdr1sh1、Pmdr1sh2、Pmdr1sh3均符合设计要求,测序证实序列完全正确。结论：通过酶切和测序鉴定重组质粒Pmdr1sh1、Pmdr1sh2、Pmdr1sh3插入位点正确,与设计序列一致．预期可用于逆转mdr1所致耐药。