"牵引丝蛋白基因"单体六聚物的克隆与原核表达

目的克隆与原核表达“牵引丝蛋白基因”单体六聚物,为开展具有不同长度系列的“牵引丝蛋白基因”单体多聚物的功能研究奠定基础。方法以“牵引丝蛋白基因”单体为基础,利用同尾酶聚合法构建含“牵引丝蛋白基因”单体六聚物的重组克隆质粒pUC18-6 S和重组原核表达质粒pET-28 a( )-6S。将pET-28 a( )-6 S转化至大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞感受态菌中,利用IPTG进行诱导。结果重组克隆质粒pUC18-6 S和重组原核表达质粒pET-28 a( )-6 S的测序结果与预期设计序列相同;SDS-PAGE结果发现,目的基因以包涵体的形式表达;薄层扫描分析结果表明,6 S蛋白的表达量约占菌体总蛋白的19%。结论克隆获得了“牵引丝蛋白基因”单体六聚物的重组克隆质粒和重组表达质粒,且重组表达质粒在原核系统中以包涵体的形式表达6 S蛋白。     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆与原核表达

目的 克隆肿瘤抗原MAGE-3基因3’端657bp片段，对其编码的蛋白羧基端97-314aa进行原核表达。方法 从含人MAGE-3基因全长cDNA的pUC19／MAGE-3质粒中经聚合酶链式反应(PCR)扩增3’端657bp片段，并克隆入pGEX-4T-1载体，构建重组原核表达质粒pGEX／MAGE-3，对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达。结果 从pUC19／MAGE-3重组质粒中扩增获得一条约660bp的条带，测序结果表明与GenBank公布的MAGE-3序列一致，成功地构建了pGEX／MAGE-3原核表达质粒，含有该质粒的大肠杆菌DH5α经异丙基-β-半乳糖苷(Isopropyl—beta—D—thiogalactopyranoside，IPTG)诱导后表达Mr为54000的谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferse，GST)融合蛋白。表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的28％。结论 成功地构建了pGEX／MAGE-3原核表达质粒，获得了MAGE-3蛋白羧基端97～314aa融合蛋白，为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

人端粒酶催化亚基反义RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定*

背景：人端粒酶催化亚基与c-myc在喉鳞状细胞癌中有密切的相关性。 目的：构建含有c-myc启动子的人端粒酶催化亚基的重组腺病毒载体,观察人端粒酶催化亚基在细胞中表达后对细胞增长的影响。 方法：按照人工合成中反向转录的方法设计基因合成引物,用复式PCR获得目的片段ashTERT(322 bp)。将片段ashTERT克隆到pUC57(2.7 kb)克隆载体,然后热激转化到E.coli感受态细胞中,菌检、PCR、鉴定阳性克隆后,菌液放大培养,提取质粒pUC57-ashTERT,然后对质粒进行测序。将目的基因片段亚克隆到穿梭载体pshuttle-CMVneo上,然后构建重组腺病毒质粒pAd-ashTERT。转入293细胞中进行病毒包装、鉴定和滴度测定。 结果与结论：提取质粒pUC57-ashTERT,测序符合序列要求。质粒pUC57-ashTERT转入293细胞后,成功构建了有较强感染能力的含人端粒酶催化亚基基因的重组腺病毒载体。     

结核杆菌热休克蛋白70基因的克隆与原核表达

目的：克隆结核杆菌热休克蛋白70(TBhsp70)基因，并在大肠杆菌中表达。方法：利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Hsp70基因，并将其克隆到pUC19中，进行测序。将得到的Hsp70基因克隆到表达载体pGEX-4T-1中，构建重组表达质粒pGEX—TBhsp70，在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果：成功地克隆了TBhsp70基因。DNA测序证实，与GenBank公布的序列一致。含pGEX-TBhsp70基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后，能够表达相对分子质量(MR)约为96000的融合蛋白。结论：获得了TBhsp70基因，成功地构建了原核表达质粒pGEX-TBhsp70，并在大肠杆菌得到表达，为其相关研究奠定了一定的基础。     

谷胱甘肽转硫酶-血小板因子4融合蛋白表达载体的构建、鉴定与表达

目的 构建谷胱甘肽转硫酶－血小板因子4（GST－PF4）融合蛋白表达载体，并研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达。方法 通过RT－PCR方法，从HL－60细胞中克隆PF4cDNA，然后克隆至载体pUC19中，序列测定后把PF4基因重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEC-4T-3中，并用IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。结果 获得了PF4 cDNA。序列分析表明，该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明，PF4基因已正确插入到pGEX-4T-3中。重组融合蛋白表达载体GST－PF4经IPTG诱导表达，在SDS－PAGE后得到1条蛋白表达带，相对分子质量（Mr)约为36000。结论 成功地构融合蛋白表达载体GST－PF4，并大肠杆菌中获得有效表达，为进一步研究打下良好的基础。     

BPIm23重组抗菌蛋白在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的：采用巴斯德毕赤酵母表达系统表达分泌型功能性rBPIm23抗菌蛋白。方法：利用构建的pUC18-synBPI414质粒和PBV220-BPIm120质粒，按分子克隆方法构建pPICZa-synBPIm600重组表达载体；用线性化pVICZa-synBPIm600质粒电转化Pichia pastoris GS115，筛选抗性转化子，进行PCR和Mut表型鉴定；用甲醇诱导目的蛋白rBPIm23的表达；用离子交换层析纯化rBPIm23，并进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定和用BCA法定量。结果：①成功构建了pPICZa-synBPIm600重组表达载体；②获得稳定整合目的基因的GS115菌株；③表达产物相对分子量约为23kD，可与抗BPI抗体特异性结合；④培养上清液中目的蛋白表达量约为2.9mg／L。结论：BPIm23重组抗菌蛋白在毕赤酵母GS115中得到分泌表达。     

人杀菌/通透性增强蛋白活性片段基因在CHO细胞中的表达

目的获得人杀菌/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)N端活性片段蛋白,为BPI结构和功能的研究提供有力的工具。方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPIN端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染CHO细胞并筛选阳性克隆,免疫荧光法鉴定重组BPI的表达和免疫学活性。结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,与文献报道的序列相比,有6个核苷酸差异。转染筛选的阳性CHO细胞克隆表达产物能够被抗BPI的单克隆抗体所识别。结论BPI活性片段表达载体的构建及真核表达成功,为BPI功能的研究奠定了基础。     

重组人HMGB1 A box的表达纯化及对单核细胞的抑制作用

目的:克隆人高迁移率族B1Abox(HMGB1 A box)基因,构建高效稳定的大肠杆菌(E.coli)表达菌株,并探讨其对免疫复合物(IC)刺激单核细胞活化的抑制作用。方法:根据本室优化合成的HMGB1基因序列设计引物,PCR扩增目的基因片段并插入克隆载体pMD19-T,菌落PCR、酶谱分析及DNA测序鉴定阳性克隆。重组克隆载体经NdeⅠ和XhoⅠ酶切,琼脂糖凝胶电泳分离目的基因,插入表达载体pQE-T7-2的相应位点,菌落PCR鉴定重组表达载体。重组菌株经IT-PG诱导,SDS-PAGE分析及Western blot鉴定重组蛋白。Ni2+-NTA层析柱纯化重组人HMGB1 A box,RT-PCR检测其对IC刺激单核细胞活化的抑制作用。结果:获得重组人HMGB1 A box的表达菌株,目的蛋白占菌体总蛋白的40%左右。Western blot显示重组蛋白能与抗人HMGB1多克隆抗体和抗His-Tag多克隆抗体特异反应。目的蛋白纯度高达90%以上,并能有效抑制IC诱导单核细胞分泌BAFF、IFN-γ及TNF-α。结论:成功构建了重组人HMGB1 A Box的表达载体,纯化的重组蛋白能有效抑制IC刺激单核细胞活化后细胞因子的分泌。     

脂肪分化相关蛋白对软脂酸诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响

目的:构建编码脂肪分化相关蛋白(ADRP)基因全长序列的真核表达载体,探讨ADRP过表达对软脂酸诱导的H9 c2心肌细胞凋亡有何影响。方法:(1)采用PCR的方法,以成年SD大鼠心肌cDNA为模板扩增编码ADRP全长的DNA序列,重组入pEGFP-C1质粒表达载体中,酶切、测序鉴定后转化大肠埃希菌DH5α,挑取阳性克隆,扩增后提取质粒,进行酶切和测序鉴定;(2)采用脂质体转染法将鉴定后的重组质粒转染H9 c2心肌细胞株,经G418筛选获得抗性细胞克隆后扩大培养;荧光显微镜观察细胞内绿色荧光蛋白报告基因表达情况;RT-qPCR和Western blot检测转染细胞与正常细胞ADRP mRNA和蛋白表达水平;(3)采用流式细胞术检测不同浓度软脂酸对上述细胞细胞凋亡率的影响。结果:(1)酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入表达质粒pEGFP-C1;(2)荧光显微镜观察细胞内有绿色荧光蛋白表达且传20代以上无消失;RT-qPCR和Western blot证明重组质粒转染H9 c2细胞ADRP mRNA和蛋白表达水平明显高于空质粒转染组和正常对照组(P<0.01);(3)经不同软脂酸刺激后,重组质粒转染H9 ...     

心脏转录因子GATA结合蛋白4真核表达质粒的构建

背景:有研究表明心脏转录因子GATA结合蛋白4(GATA4)与先天性心脏病的发生有密切的关系,但其机制不明,而目前尚未查及GATA4真核表达质粒构建类的报道。目的:构建人类心脏特殊转录因子GATA4的真核表达质粒。方法:对重组质粒pUC57-GATA4进行酶切获得GATA4基因编码区序列,将真核表达载体pCMV-Myc和GATA4基因在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pCMV-Myc-GATA4,转化至大肠杆菌,提取质粒后经聚合酶链反应、双酶切及测序鉴定。结果与结论:实验成功酶切重组质粒获得GATA4基因编码区约1.3kb的目的片段,聚合酶链反应和酶切鉴定以及基因测序结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的GATA4基因序列,证实成功构建了含有GATA4基因的真核表达重组质粒。     

The secreted expression of PSP94 in E. coli.

The secreted expression of PSP94 in E .coli.     

金黄色葡萄球菌基因敲除质粒的构建及应用

背景：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌已经成为全球院内感染的首要致病菌,建立快速简单的基因敲除方法是研究耐甲氧西林金黄色葡萄球菌毒力、耐药性的重要技术。 目的：构建适用于金黄色葡萄球菌基因敲除的质粒,用于金葡菌耐药性及毒力的研究。 方法：以pUC19为构建的基本骨架,通过overlap PCR的技术手段,把pCL52.1中pLE194Ts温敏复制子及质粒pHY300PLK中四环素抗性基因片段,通过高保证扩增后,连接入pUC19的EcoRⅠ位点,保留pUC19中所有的多克隆位点,构建大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭质粒,并对金黄色葡萄球菌N315 dapB基因进行敲除,通过多重PCR对基因敲除菌株进行鉴定。 结果与结论：成功构建了大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭质粒pYZ1和pYZ8,并用于金葡菌基因的敲除,通过酶切及overlap技术构建了同源重组质粒pYZ-ΔdapB,电转入RN4220进行修饰后,再电转入N315,通过温度筛选,获得了dapB基因突变菌株,成功的敲除了dapB基因。提示pYZ1和pYZ8能够成功用于金黄色葡萄球菌耐药菌株基因的敲除,为进一步研究临床金黄色葡萄球菌分离株耐药性及毒力提供了工具。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程全文链接：     

HL-60细胞中IL6基因的克隆及鉴定

目的：为探索性构建重组人白细胞介素６－绿脓杆菌外毒素融合蛋白（ＩＬ６－ＰＥ４０）以选择性杀伤高表达ＩＬ６受体（ＩＬ６Ｒ）的白血病细胞,本研究试图从人急性早幼粒细胞白血病细胞株（ＨＬ－６０）中克隆Ｎ－末端缺失２４个氨基酸的人ＩＬ６基因（ＩＬ６ｃＤＮＡ）并构建含此基因的重组质粒。方法：根据ＩＬ６基因序列设计合成可扩增ＩＬ６ｃＤＮＡ的特异性引物;利用基因重组技术,构建含ＩＬ６基因的重组质粒ｐＵＣ－ＩＬ６。结果与结论：本文首次从ＨＬ－６０中扩增出预期４８０ｂｐ的ＩＬ６ｃＤＮＡ,将其克隆至ｐＵＣ１８质粒中,命名为ｐＵＣ－ＩＬ６,并经ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ双酶切电泳及序列分析鉴定加以确证,为进一步构建重组人ＩＬ６－ＰＥ４０奠定了坚实基础。     

嗜肺军团菌lvgA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

本实验采用聚合酶链反应(PCR)从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增得到军团菌毒力基因(L eg ionellav iru lence gene,lvg A gene),并将其定向连接入克隆载体pUC 18,构建重组质粒pU lvgA,重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后,再将lvgA基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pG lvgA,转化宿主菌JM 109,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印记分析鉴定。实验结果表明,成功扩增出627 bp的lvgA基因,构建了重组质粒pU lvgA及原核表达重组质粒pG lvgA,并使53.7 KD a的G ST-lvgA融合蛋白质在原核系统中得到了有效的表达。     

抗人肝癌单链抗体HAb25-scFv的构建及其表达

目的构建和原核表达抗人肝癌单链抗体HAb25-scFv,为其进一步的临床应用研究奠定基础。方法采用（Gly4Ser）3为连接肽,在pUC19质粒上构建HAb25-scFv单链抗体基因;序列分析证实后将HAb25-scFv基因亚克隆入pGFX4T-1GST融合表达载体上,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物并建立目的蛋白的纯化方法;免疫荧光竞争实验鉴定HAb25-scFv单链抗体的活性。结果序列分析证实在pUC19质粒上以（Gly4Ser）,连接肽成功构建了HAb25-scFv单链抗体基因;HAb25-scFv单链抗体基因在pGEX-4T-1 GST融合表达载体中获得高效表达,其表达量占菌体总蛋白的60．8％;经GST亲和层析柱,可获得纯度达95.2％的GST-HAb25-scFv融合蛋白;免疫荧光竞争实验证实HAb25-scFv单链抗体具有与其亲本抗体相同的抗原结合特性,并至少保留了亲本抗体39．12％的亲合力。结论获得了HAb25-scFv单链抗体基因,并在原核GST融合表达系统中实现了HAb25-scFv的高效表达,免疫荧光竞争实验证实HAb25-scFv较好地保留了其亲本抗体的特异性和亲和力。     

人ski基因真核表达载体的构建及促细胞增殖作用

背景：c-Ski既可促进组织修复,又能降低瘢痕形成,有望成为一个全新的基因治疗药物。 目的：构建人ski基因的真核表达载体,并对其促成纤维细胞增殖效果进行验证。 方法：RT-PCR法从人包皮培养原代成纤维细胞总RNA中扩增出人ski基因,连同真核表达启动子CMV克隆到pUC118载体上,酶切和测序验证后,应用脂质体将其转染到培养的大鼠皮肤成纤维细胞中。 结果与结论：酶切和测序结果证实表达质粒构建成功,Western blot显示Ski蛋白在转染细胞中成功表达,且可显著提高转染细胞的增殖效应,说明以pUC118为骨架的重组ski表达质粒具有促进大鼠皮肤成纤维细胞增殖的作用。     

军团菌MOMPS基因的克隆并在原核系统中表达

以军团菌DNA为模板，PCR扩增获得军团菌主要外膜蛋白基因（Major outer membrane protein gene，ompS），与原核表达质粒pUC18定向重组，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21，并用限制性酶酶切分析、聚合酶链式反应、核酸序列分析、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹进行鉴定。实验结果表明我们扩增出了军团菌914bp的ompS基因，成功构建了重组质粒pLPompS，并在原核系统中得到了表达。     

siRNA-survivin与GRIM-19共表达质粒的构建及其对前列腺癌DU145细胞生长的抑制作用

目的: 构建siRNA-survivin与GRIM-19共表达质粒pGRIM-19-si-survivin并鉴定,观察pGRIM-19-si-survivin质粒对人前列腺癌DU145细胞survivin和GRIM-19 mRNA表达水平及细胞增殖能力的影响。方法:根据前期工作,利用基因重组技术构建siRNA-survivin与GRIM-19共表达质粒,将成功构建的pGRIM-19-si-survivin质粒转染人前列腺癌DU145细胞株,应用半定量RT-PCR方法检测细胞内survivin和GRIM-19 mRNA表达水平,应用MTT法观察其对细胞增殖能力的影响。结果:(1)应用酶切及质粒测序法鉴定,证明成功构建siRNA-survivin与GRIM-19共表达质粒。(2)与mock组比较,psi-survivin、pGRIM-19及pGRIM-19-si-survivin组survivin mRNA表达水平分别为0.55±0.05、0.62±0.08和0.35±0.05,差异显著(P<0.01);与psi-survivin和pGRIM-19组比较,pGRIM-19-si-survivin的抑制survivin表达作用明显增强(P<0.05);psi-survivin、pGRIM-19和pGRIM-19-si-survivin组GRIM-19表达增强,分别为mock组的1.93±0.14、2.57±0.20 和4.12±0.21(P<0.01),与pGRIM-19组比较,pGRIM-19-si-survivin增强GRIM-19表达作用更明显(P<0.05)。(3)转染48 h后,与mock组比较,psi-survivin、pGRIM-19和pGRIM-19-si-survivin 3组细胞增殖率分别为58.0%±7.2%、62.1%±6.1%和50.2%±4.8%,差异显著(P<0.05);转染72 h后,与mock组比较,3组细胞增殖率分别为43.4%±4.3%、51.3%±6.7%和26.8%±7.1%,差异明显(P<0.05,P<0.01);与psi-survivin和pGRIM-19组比较,pGRIM-19-si-survivin抑制作用明显增强(P<0.05)。结论:成功构建siRNA-survivin和GRIM-19共表达质粒pGRIM-19-si-survivin;该质粒抑制survivin表达并增强GRIM-19表达,对前列腺癌DU145细胞具有协同增殖抑制效应。