日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj26GST的构建及其表达

目的 构建日本血吸虫重组质粒pET28a-Sj26GST,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得Sj26GST抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET28a,构建重组质粒pET28a-Sj26GST,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出676 bp的Sj26GST基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST基因成功插入pET28a中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约为36×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的26%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28d-Sj26GST,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.     

人白介素-12植物表达载体的构建

目的:构建人白介素-12(hIL-12)基因的植物表达载体.方法:采用PCR技术从质粒pCA13-hIL-12中扩增hIL-12基因,SmaI, SacI分别酶切hIL-12基因和植物表达载体pBI121,回收,T4DNA连接酶连接得到重组质粒pBI121-hIL-12,双酶切和DNA测序鉴定后,通过三亲杂交法将表达载体pBI121-hIL-12分别导入根癌农杆菌EHA105和GV3101,用PCR法进行鉴定.结果:双酶切及DNA序列测定证实hIL-12已插入到表达载体pBI121中,PCR 扩增表明构建的重组表达载体pBI121-hIL-12成功转入根癌农杆菌EHA105和GV3101中.结论:成功构建了植物表达载体pBI121-hIL-12,为进一步利用转基因植物生产hIL-12奠定了实验基础.     

日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的 构建日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST-Sj32,分析该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达情况.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得Sj26GST和Sj32抗原编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)剪接Sj26GST和Sj32,得到Sj26GST-Sj32融合基因,克隆至原核表达载体pET32α(+),构建重组质粒pET32α-Sj26GST-Sj32,转化人大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定.结果 基因拼接法扩增出约1991 bp的Sj26GST-Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入pET32a(+)中,SDS-PAGE分析显示表达产物为分子质量约82000 Mr的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的22%;Westem-blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.     

日本血吸虫(大陆株)Sj26基因的克隆与序列分析

目的 构建日本血吸虫(大陆株)26kDa谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26)基因的真核表达载体，并测定基因序列和进行序列分析。方法 用PCR的方法特异性地扩增Sj26基因，并将此基因克隆于真核表达载体pcDN3，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，阳性克隆的重组质粒DNA经酶切、PCR扩增鉴定，用双脱氧链末端终止法进行序列测定，应用BIAST方法分析Si26基因序列并进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的Sj26基因，双酶切及PCR鉴定表明获得正确的pcDNA3-Sj26重组质粒，测序结果获得的基因片段大小为651bp，编码217个氨基酸残基。基因序列同源性为99％。结论 成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-Sj26。     

日本血吸虫(大陆株)26ku谷胱甘肽转移酶基因真核表达载体构建及序列分析

目的　构建日本血吸虫大陆株 2 6ku谷胱甘肽转移酶 (GST)基因真核表达质粒 pBK SjGST并进行序列分析 ,为进一步进行重组蛋白的表达及保护性免疫研究提供条件。方法　根据日本血吸虫菲律宾株 2 6kuGST核苷酸序列 ,设计合成一对引物 ,以日本血吸虫中国大陆株成虫总RNA为模板 ,通过RT PCR合成日本血吸虫中国大陆株 2 6kuGSTcDNA片段。将其克隆入 pGEM T载体 ,经双酶切及PCR鉴定后 ,再亚克隆入 pBK CMV真核表达质粒 ,构建重组质粒pBK SjGST ,转化到大肠杆菌BL2 1感受态细胞 ,提取重组质粒双酶切鉴定并进行序列分析。结果　PCR、pGEM T SjGST及 pBK SjGST分别经双酶切获得一特异性基因片段 .经测序分析该片段具有一个 670bp的全基因序列 ,而其开放阅读框 (openreadingframe,ORF)为 65 7bp ,编码 2 18个氨基酸 ,并对其基因序列及编码的蛋白质进行了分析。结论　成功地构建了日本血吸虫中国大陆株 2 6kuGST基因真核表达重组质粒 ,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列蛋白激酶磷酸化位点进行分析     

波摩那型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因片段的克隆表达

目的　构建L3 2_pGEX_5x_2重组质粒 ,诱导表达重组钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL3 2。方法　PCR获取编码LipL3 2的基因片段 ,构建重组克隆载体和表达载体 ,转化受体菌 ,诱导表达重组LipL3 2蛋白。将重组LipL3 2蛋白和钩体抗血清进行Western_blot。结果　扩增出约 750bp的LipL3 2成熟蛋白基因 ,LipL3 2基因插入pGEX_5x_2表达载体 ,表达产物谷胱甘肽S_转移酶 (GST ,2 6× 10 3)与LipL3 2蛋白的融合蛋白的相对分子质量约为 53× 10 3 ,与预期大小一致。Western_blot显示重组LipL3 2蛋白能与钩体抗血清特异结合。结论　LipL3 2蛋白能在大肠埃希菌中表达 ,重组LipL3 2蛋白具有免疫反应性     

重组模型人肿瘤坏死因子α的克隆及GST—TNF融合基因的构建

目的：构建膜结合型人肿瘤坏死因子与谷胱甘肽－S－转移酶（GST）的融合基因表达载体。方法：用RT－PCR一步法扩增出人膜结合型TNF基因片段,定向克隆到质粒pUC19中。再通过定向亚克隆插入真核表达质粒pGEX-4T-3中GST下游。结果：从激活的单核细胞中扩增出700bp左右的膜型TNF基因;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结论：从激活的单核细胞中扩增出700bp左右的膜型TNF基因;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结: 重组模型TNF的GST融合表达及纯化优化,为进一步定点突变,设计高效低毒的非分泌性膜结合TNF,用于肿瘤的基因治疗打下了良好的基础。     

白血病分化相关基因dif14的原核表达

目的 :构建 pGEX dif14原核表达载体 ,在大肠杆菌中表达dif14蛋白片段以获得其抗原 .方法 :采用N末端融合谷胱甘肽巯基转移酶 (GST)的 pGEX 4T 1载体 ,根据dif14基因开放读框N端 5 2氨基酸序列设计引物PCR扩增并购建原核表达载体 ,测序证实 .在大肠杆菌DH5α中进行表达 .结果 :测序证实dif14原核表达载体构建正确 ,含 pGEX dif14表达质粒的大肠杆菌经异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导后能够表达约Mr35× 10 3 的融合蛋白 .结论 :成功地构建了原核表达质粒 pGEX dif14 ,并在大肠杆菌得到表达 ,为研究dif14的功能奠定了一定的基础     

幽门螺杆菌尿素酶基因ureB植物双元表达载体的构建

目的:构建含有人幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)ureB基因的植物表达载体.方法:采用高保真PCR技术从质粒pMED-ureB中扩增出ureB基因,构建质粒pUC18-ureB,再将pUC18-ureB酶切,将ureB基因与质粒pBI121连接.结果:构建的PBI121-ureB经PCR、酶切鉴定和测序分析证明,插...     

人谷胱甘肽硫转移酶M1 TV2基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建人谷胱甘肽硫转移酶M1 TV2(GST M1 TV2)基因真核表达载体并进行序列分析。方法：用RT-PCR技术从人肺脏组织总RNA中分离扩增人GST M1 TV2基因的cDNA序列,将其插入到真核表达载体pcDNA3．1多克隆位点中,构建真核重组表达质粒pcDNA3．1-GST M1 TV2,并用PCR扩增、酶切分析及序列测定等方法对重组质粒进行鉴定。结果与结论：对人GST M1 TV2测序结果同GenBank序列完全一致,基因登陆号为AY532927、表明已成功构建了pcDNA3.1-GST M1 TV2真核重组表达质粒,为进一步进行真核细胞转染,研究毒物、药物代谢的机制提供了理论依据。     

重组膜型人肿瘤坏死因子α的克隆及GST-TNF融合基因的构建

目的：构建膜结合型人肿瘤坏死因子与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合基因表达载体。方法：用RT-PCR一步法扩增出人膜结合型TNF基因片段,定向克隆到质粒pUC19中。再通过定向亚克隆插入真核表达质粒pGEX-4T-3中GST下游。结果：从激活的单核细胞中扩增出700 bp左右的膜型TNF基因;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结论：建立了重组膜型TNF的GST融合表达及纯化优势,为进一步定点突变,设计高效低毒的非分泌性膜结合TNF,用于肿瘤的基因治疗打下了良好的基础。     

重组日本血吸虫26 ku谷胱甘肽-硫-转移酶的表达、纯化及其免疫特性分析用于急性血吸虫病免疫诊断

目的将日本血吸虫(中国大陆株)26 ku谷胱甘肽-硫-转移酶(26 ku SjGST)基因克隆入pET28a(+)并诱导表达26 ku rSjGST蛋白,纯化并用于急性血吸虫病免疫诊断.方法构建重组质粒pET28a-SjGST,转化到E.coli BL21,经IPTG诱导表达并进行SDS变性蛋白质电泳,以小鼠抗GST单克隆抗体为一抗,进行Western-blot分析.用His·BandPurification Kit亲和层析纯化重组蛋白,以此重组蛋白作为抗原,用ELISA法检测急性血吸虫患者血清和非流行区正常人血清. 结果成功地构建了重组质粒pET28a-SjGST,SDS变性蛋白质电泳显示可见一与预期分子量大小相符的特异蛋白条带的表达.Western blot分析表明,该重组蛋白能被小鼠抗GST单克隆抗体识别.ELISA结果表明,rSj GST用于急性血吸虫患者血清中抗体检测的阳性率为92.3%.结论 rSj GST得到表达和纯化,该重组蛋白用于急性血吸虫患者血清中抗体的检测具有良好的免疫反应性,为进一步探讨其在血吸虫病诊断中的应用奠定了基础.     

SARS冠状病毒M基因在大肠杆菌中的表达及其免疫学特性初步研究

【目的】在大肠杆菌中表达SARS冠状病毒包膜(M)蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,并对其进行血清学鉴定。【方法】克隆编码SARS冠状病毒M蛋白的基因,并在原核系统中表达GST-M融合蛋白,用Westernblot和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析GST-M融合蛋白。【结果】10份SARS患者恢复期血清均能识别M-GST融合蛋白,并在Mr=52000附近出现特异性结合带;而10份正常人血清不与M-GST融合蛋白起反应。【结论】本研究获得了SARS冠状病毒GST-M融合蛋白,它可与SARS患者的恢复期血清产生特异性的结合反应,为研究SARS冠状病毒感染宿主细胞的过程和制备重组疫苗提供了条件。     

重组日本血吸虫FKBPl2基因的酶活性及其转录水平鉴定

目的对日本血吸虫（Schistosoma japonicum,sj）FK506结合蛋白12（FKBPl2）进行肽基脯氨酸顺反异构酶（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase,PPIase）活性鉴定,并比较它与26000 Mr的谷胱甘肽转移酶（Sj26GST）基因在成虫、尾蚴和虫卵的转录水平。方法从成虫RNA中RT-PCR扩增sjFKBPl2基因,将其克隆入pGEX-4T-1载体中,诱导表达重组融合蛋白,经纯化后进行PPIase活性测定。利用RT-PCR半定量分析sjFKBPl2基因与Sj26GST基因的转录水平。结果将sjFKBPl2基因成功克隆入pGEX-4T-1载体中后,表达、纯化的重组融合蛋白有PPIase活性。sjFKBPl2在尾蚴与虫卵期的转录水平相仿,都高于Sj26GST基因,是成虫期转录水平的1．5倍左右。结论成功鉴定了重组sjFKBPl2酶活性,sjFKBPl2在尾蚴和虫卵期较高的转录水平,为将其进行疫苗等研究提供了依据。     

重组日本血吸虫FKBP12基因的酶活性及其转录水平鉴定

目的 对日本血吸虫(Schistosoma japonicum, Sj)FK506结合蛋白12(FKBP12)进行肽基脯氨酸顺反异构酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, PPIase)活性鉴定,并比较它与26000Mr的谷胱甘肽转移酶(Sj26GST)基因在成虫、尾蚴和虫卵的转录水平.方法 从成虫RNA中RT-PCR扩增SjFKBP12基因,将其克隆人pGEX-4T-1载体中,诱导表达重组融合蛋白,经纯化后进行PPIase活性测定.利用RT-PCR半定量分析SjFKBP12基因与Sj26GST基因的转录水平.结果 将SjFKBP12基因成功克隆人pGEX-4T-1载体中后,表达、纯化的重组融合蛋白有PPIase活性.SjFKBP12在尾蚴与虫卵期的转录水平相仿,都高于Sj26GST基因,是成虫期转录水平的1.5倍左右.结论 成功鉴定了重组SjFKBP12酶活性,SjFKBP12在尾蚴和虫卵期较高的转录水平,为将其进行疫苗等研究提供了依据.     

携HBx基因逆转录病毒载体的构建

【目的】构建携HBx基因的逆转录病毒载体 ,为研究HBx基因与肝癌生物学行为间的关系提供基础。【方法】采用PCR技术从HBV全基因组中扩增HBx基因 ;将HBx基因亚克隆至质粒pLNSX ,构建质粒 pLNSHBx ,磷酸钙 DNA共沉淀法将重组体导入包装细胞系PA317,检测培养上清病毒滴度。【结果】应用PCR技术成功地从HBV基因组中克隆出全长HBx基因 ,并经序列分析证实 ;建立了产病毒细胞株PA317/HBx ,检测其培养上清病毒滴度为 8.9× 10 4 CFU ,PCR证实重组病毒中含有HBx基因。【结论】成功构建了携HBx基因的较高滴度逆转录病毒载体。     

日本血吸虫TGF-β1成熟肽编码序列的克隆、表达及其转录水平

目的 获得日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)转化生长因子β1(TGF-β1)成熟肽基因的DNA,进行原核克隆和表达.并比较它与Sj26kd的谷胱甘肽转移酶(Sj26GST)在成虫和虫卵期的转录水平.方法 根据美国国立生物信息学中心(NCBI)上登录的小鼠TGF-β1基因的全长序列,设计两条位于保守区的寡核苷酸作为引物.利用RT-PCR从日本血吸虫成虫的mRNA中扩增SjTGF-β1基因的部分序列,并利用生物信息学进行分析和鉴定.克隆SjTGF-β1成熟肽基因的cDNA到原核表达载体pGEX-6p-3,将重组载体转化大肠杆菌BL21株并诱导表达.利用RT-PCR半定量分析SjTGF-β1基因与Sj26GST基因在成虫和虫卵期的转录水平.结果 成功获得并构建了SjTGF-β1成熟肽基因的原核表达载体.融合表达后的重组融合蛋白经SDS-PAGE分析,显示其相对分子质量约为3 5000.与目的 基因编码蛋白的预测分子量相符.SjTGF-β1在成虫与虫卵期的转录水平都低于Sj26GST基因,但虫卵期的转录水平比成虫高.结论 SjTGF-β1成熟肽基因的获得为其编码序列全长的获得奠定了基础;重组融合蛋白的成功表达为进一步的功能研究提供保障;虫卵期该基因的转录水平高提示该基因在血吸虫虫卵与宿主的相互作用中可能具有一定的作用.     

SARS冠状病毒M基因在大肠杆菌中的表达及其免疫学特性初步研究

【目的】在大肠杆菌中表达SARS冠状病毒包膜(M)蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白，并对其进行血清学鉴定。【方法】克隆编码SARS冠状病毒M蛋白的基因，并在原核系统中表达GST-M融合蛋白．用Western blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析GST-M融合蛋白。【结果】10份SARS患者恢复期血清均能识别M-GST融合蛋白，并在Mr=52000附近出现特异性结合带；而10份正常人血清不与M-GST融合蛋白起反应。【结论】本研究获得了SARS冠状病毒GST-M融合蛋白，它可与SARS患者的恢复期血清产生特异性的结合反应，为研究SARS冠状病毒感染宿主细胞的过程和制备重组疫苗提供了条件。