再生丝素膜对转基因角膜上皮细胞表达细胞因子的影响

目的 探讨再生丝素膜对转基因人角膜上皮细胞表达细胞因子的影响,以及转基因细胞修饰的再生丝素膜构建生物材料复合体的可能性.方法 实验研究.兔角膜缘注射重组腺病毒载体血管内皮生长因子165(Ad-VEGF_(165))诱导新生血管,测量角膜新生血管生长面积,分析角膜组织血管内皮细胞生长因子免疫组织化学结果.用再生丝素膜培养角膜上皮细胞,观察细胞形态、生长曲线、Ad-VEGF_(165)感染效率.收集再生丝素膜Ad-VEGF_(165)转基因角膜上皮细胞培养上清,酶联免疫吸附试验法检测上清中血管内皮生长因子、血管生成素1、表皮生长因子、转化生长因子等细胞因子浓度.采用双因素方差分析基因感染和再生丝素膜材料两因素对HCECs细胞因子表达水平的比较.结果 (1)角膜缘注射Ad-VEGF_(165)后第1周、第1个月角膜新生血管面积分别为(7.60±1.12)mm~2、(12.28±2.54)mm~2,注射后第3天、第1周、第1个月角膜基质内可见血管内皮生长因子阳性表达.(2)再生丝素膜及无再生丝素膜两种培养条件,角膜上皮细胞细胞形态、生长曲线、Ad-VEGF_(165)感染效率均无明显差异.(3)再生丝素膜培养Ad-VEGF_(165)转基因角膜上皮细胞上清中各细胞因子浓度分别为血管内皮生长因子(721.67±66.97)ng/L、表皮生长因子(1042.67±315.81)ng/L、血管生成素1(2421.00±0.00)ng/L、转化生长因子(313.33±34.06)ng/L.无再生丝素膜Ad-VEGF_(165)转基因角膜上皮细胞培养上清各细胞因子浓度分别为血管内皮生长因子(721.67±66.97)ng/L、表皮生长因子(860.33±315.81).g/L、血管生成素1(1960.33±797.90)ng/L、转化生长因子(278.00±53.11)ns/L.Ad-VEGF_(165)感染角膜上皮细胞培养上清中各细胞因子浓度均显著高于对照组,分别为血管内皮生长因子(F=168.16,P<0.0001)、表皮生长因子(F=52.76,P<0.0001)、血管生成素1(F=12.47,P=0.001)、转化生长因子(F=5.647,P=0.016).再生丝素膜与无再生丝素膜两种培养条件下,血管内皮生长因子(F=0.071,P=0.793)、表皮生长因子(F=0.563,P=0.465)、血管生成素1(F=0.14,P=0.714)、转化生长因子(F=0.008,P=0.932)浓度比较差异无统计学意义.结论 再生丝素膜与细胞培养板一样,Ad-VEGF_(165)转基因角膜上皮细胞目的 基因能获得高效表达,同时还使角膜上皮细胞自分泌的新生血管相关细胞因子表皮生长因子、血管生成素1、转化生长因子等获得高效表达.     

组织工程角膜支架材料再生丝素膜的生物相容性

目的:研究再生丝素膜作为组织工程角膜支架材料的可行性。方法:制备再生丝素膜,测定其接触角与透光率;在材料上接种兔角膜上皮细胞,观察细胞生长情况,MTT法测定6h贴壁率;将膜材料植入兔角膜基质层间,观察材料的透明性、可降解性及生物反应性。结果:再生丝素膜材料接触角为58.2度;492nm波长透光率为93.0%,570nm波长透光率为94.4%;细胞在材料表面贴附良好,6h贴壁率为31.6%,经统计学比较优于普通培养板;4wk时材料开始变得不透明,从角膜缘长入新生血管,8wk时新生血管达到高峰,12wk时材料部分降解,至16wk材料大部分降解,新生血管显著减少。结论:再生丝素膜具有较好的生物相容性。     

组织工程角膜上皮治疗兔角膜缘干细胞缺乏症的研究

目的 评价以纤维凝胶膜为载体,体外培养自体角膜缘干细胞移植术治疗角膜缘干细胞缺乏症的临床效果。方法 制作兔眼角膜缘干细胞完全缺乏模型,取对侧眼角膜缘组织进行干细胞培养,并以纤维凝胶膜为载体制成组织工程角膜上皮。将实验动物随机分为4组,其中Ⅰ-Ⅲ组为实验组,行组织工程角膜上皮移植术,Ⅰ组移植术后观察3个月,Ⅱ组移植术后观察1个月,Ⅲ组移植术后观察2周。Ⅳ组为对照组,移植不含干细胞的凝胶膜,术后观察3个月。以角膜上皮染色、角膜混浊及新生血管3项指标进行临床疗效评定,通过病理检查评估术后不同时期角膜上皮修复情况,印迹细胞学检查移植前后角膜上皮的细胞表型,免疫组织化学染色观察角膜上皮特异性角蛋白K3、MUCSAC及转录因子p63在移植角膜上皮的表达。结果 实验组角膜上皮逐渐愈合,透明度提高,新生血管减退或消失;对照组角膜呈持续混浊,上皮缺损迁延不愈,最终大量新生血管长入,上皮结膜化。临床指标评分比较,差异有统计学意义（P=0．021）。角膜上皮印迹细胞学检查显示对照组为PAS（＋）的结膜细胞表型,而实验组上皮细胞PAS（-）。组织病理学显示实验组为正常角膜上皮结构,对照组为结膜化生的上皮,可见血管和杯状细胞。免疫组织化学显示实验组角膜上皮表达角膜上皮特异性角蛋白l（3（AE5）,不表达结膜特异性MUCSAC,在上皮基底部表达转录因子p63。对照组上皮持续表达MUCSAC。结论 组织工程角膜上皮移植术是一种有效的治疗角膜缘干细胞缺乏症的方法,可重建眼表,修复角膜上皮的损伤,抑制角膜上皮结膜化和新生血管。纤维凝胶膜为一种新型的组织工程材料,吸收快,透明度高,具有良好的组织相容性,是一种较理想的移植载体材料。（中华眼科杂志．2006．42：679-685）     

多孔纳米羟基磷灰石-聚乙烯醇水凝胶人工角膜的实验研究

目的 评价多孔纳米羟基磷灰石-聚乙烯醇水凝胶(NHA-PAH)人工角膜在兔角膜内的生物学反应。方法 将NAH-PAHKPro加工成直径10．0mm，周边支架为2．5mm．中央光学部与裙袢连接部呈阶梯状，植入10只新西兰白兔角膜板层囊袋内。术后眼前段裂隙灯照相并分别于1月、2月、3月、4月、6月行术眼角膜组织病理学检查。结果 术后1个月大部分新生血管长入角膜中央，3月时新生血管生长达到高峰，术后6个月角膜中央存留大量变细的新生血管，未见人工角膜排出、基质融解、房水渗漏和感染。HE染色见术后1个月时成纤维细胞、新生血管及少量炎细胞长入裙袢孔隙内，伴有少量胶原形成。术后3个月所有孔隙均被胶原细胞和新生血管组织充填，成纤维细胞在孔隙内沿纵行方向一致性生长，胞头丰富，胞核小。中央光学部透明。结论 NHA-PAHKPro组织相容性好，具有临床应用的前景。     

激光角膜原位磨镶术后外伤致角膜瓣皱褶的处理

目的探讨外伤致准分子激光原位角膜磨镶术（LASIK）后角膜瓣皱褶的处理方法。方法表麻下掀开已发生皱褶的角膜瓣,冲洗角膜床和角膜瓣床面,清除增生的上皮组织,展平角膜瓣的皱褶,使之覆贴于角膜床,边缘对齐。10例（10眼）手术处理后观察6个月。结果（1）视力术后1d10眼中9眼裸眼视力≥0．6;术后6个月,裸眼视力0．6～1．2（0．8±0．16）;另1例合并黄斑出血,视力0．2。（2）裂隙灯检查：术后1d,2例角膜瓣破损挫伤处,角膜瓣基质水肿,对位良好。3例边缘部有上皮植入,上皮轻度水肿,再次手术处理上皮植入后,角膜瓣对位良好。术后6个月,所有患眼角膜瓣皱褶均展平。结论LASIK术后外伤致角膜瓣的损伤和皱褶,通过及时妥善的处理,可以展平角膜瓣皱褶,不会对视力造成严重影响。     

壳聚糖胶原复合膜在兔角膜基质层间的组织相容性

目的探讨壳聚糖胶原复合膜植入兔角膜基质层的组织相容性,以评价其作为人组织工程角膜修复支架材料的可行性。方法选用8只新西兰白兔,根据角膜基质层间植入膜片材料的不同平均分为A、B两组,A组植入壳聚糖胶原复合膜（实验组）、B组植入壳聚糖膜（对照组）。术后观察并记录术眼球结膜充血、角膜水肿、前房闪辉、角膜新生血管、材料的变化等情况,术后第8周取术眼角膜组织制作病理学切片进行HE染色观察,比较两组材料对角膜组织的不同影响。结果术后8周内,实验组炎症反应轻于对照组,且无角膜新生血管发生,对照组有2例发生角膜新生血管,两组膜片均于术后第2周开始降解,但在相同观察时间点,实验组膜片降解程度小于对照组。HE染色显示实验组膜片周围炎性细胞浸润轻于对照组,膜片降解程度小于对照组,降解物与角膜基质纤维融合。结论壳聚糖胶原复合膜与活体兔角膜基质组织的相容性比壳聚糖膜更优,其作为角膜损伤修复材料具有广阔前景。     

兔自体骨髓间充质干细胞移植治疗角膜内皮损伤的研究

目的研究自体骨髓间充质干细胞（MSCs）移植到兔角膜内皮细胞（CECs）部位后的形态和功能分化。方法体外培养新西兰兔自体MSCs并用5-溴尿嘧啶脱氧核苷（Brdu）标记后接种在明胶载体膜上;利用α-氰基丙烯酸脘基酯作为组织黏合剂,将接种有兔自体MSCs的载体与机械去除了内皮细胞的自体兔角膜植片相黏合,原位缝合进行MSCs移植;对照分别移植体外培养的同种异体CECs和空白载体膜。59只新西兰白兔接受了移植实验,其中21只新西兰兔的右眼接受了自体MSCs移植,21只兔的右眼接受了CECs移植,另外17只兔的右眼移植了空白载体。术后不同时间观察兔眼角膜移植片的透明情况、角膜厚度及眼压,并利用共焦显微镜进行移植细胞的形态观察和精确计数。术后观察12周,取角膜标本分别进行组织切片、抗Brdu单克隆抗体免疫组织化学染色和电镜观察。结果MSCs和CECs在明胶载体膜上生长良好,体外培养3～5d后细胞汇合,细胞密度可达约MSCs3000个／mm^2、CECs2700个／mm^2。术后2周,57只植片均发生了水肿,并逐渐混浊。自体MSCs移植组术后8周植片水肿逐渐减轻,角膜透明度恢复;CECs移植组植片术后约4周水肿减退;而对照组角膜植片则持续水肿、混浊。术后12周时,移植细胞的平均密度为：MSCs组（2105±677）个／mm^2、CECs组（2023±330）个／mm^2。扫描电镜显示MSCs移植后逐渐分化成为类似多角形的细胞,但是细胞间的间隙较大,细胞表面有丰富的微绒毛。Brdu单克隆抗体免疫组织化学染色可将移植的细胞核着色。结论自体MSCs细胞替代CECs进行移植后,这些细胞在角膜内表面可以分化成为一种类似CECs形态和功能的细胞。（中华腠科杂志,2007,43：540-545）     

组织工程化角膜基质的构建与移植实验

目的　探讨以可降解高分子材料聚羟基乙醇(PLGA)为支架体外构建组织工程化角膜基质的可行性。 方法　将培养的角膜基质细胞接种于具微孔的可降解高分子材料PLGA内,构建成组织工程化细胞 PLGA复合物,将该复合物移植到兔眼角膜基质层间。分别于移植后 1、2周, 1、2、3、4个月取材,光学显微镜、电镜观察细胞与PLGA材料的结合情况。裂隙灯显微镜和组织切片检查组织工程化角膜基质的透明性、可降解性以及生物反应性。 结果　角膜基质细胞能与PLGA高分子材料较好地结合,移植到兔眼角膜层间的组织工程化角膜基质 7d后呈半透明, 2周见新生血管从角膜缘向植片方向生长, 1个月开始材料降解, 3 ~4个月时大部分材料降解,且新生血管减少,但是移植物呈半透明状。结论　PLGA虽然具有组织相容性好、无毒、无免疫性和可降解的特性,但不适合作为构建要求具有很好透明性的角膜组织的支架材料。     

丝素膜移植兔眼睑原位重建的研究

背景利用自体或异体组织进行活体组织重建存在着供体材料少、易发生排斥反应等问题。研究证实,作为组织工程细胞支架,丝素膜有良好的生物相容性,但其是否可作为组织替代物尚未见报道。目的探讨应用丝素膜行眼睑原位重建术的可行性。方法健康新西兰大白兔18只,双眼上眼睑制作眼睑板缺损4minx3mE模型,右眼采用再生丝素膜材料进行上睑板重建术为丝素膜组,左眼采用同种异体巩膜材料行睑板重建为异体巩膜组,活体观察4周。采用随机数字表法将实验兔分为3组,每组6只,分别于术后第1、2、4周用空气栓塞法处死实验兔,收集带有移植片的兔眼睑制作石蜡切片,苏木精一伊红染色观察术区炎性细胞的浸润情况;用Masson染色法观察植片区胶原组织的形成和分布情况;应用免疫组织化学法检测植入区碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达;采用ImageProPlus分析软件对免疫组织化学结果进行半定量分析。结果所有兔眼眼睑缺损均Ⅰ期愈合,睑结膜面光滑,眼表炎症反应不明显,但异体巩膜组睑缘切迹较丝素膜组明显。组织学检查结果显示,术后随着时间的延长,移植区炎性细胞浸润逐渐减轻,术后4周丝素膜组术区胶原纤维排列整齐,结缔组织增生不明显;异体巩膜组术区胶原纤维排列相对紊乱,瘢痕组织增生较明显。术后第1、2、4周,丝素膜组术区组织中bFGF的表达量（A值）分别为0．02767±0．00469、0．05173±0．00872、0．05872±0．00688,巩膜组分别为0．05648±0．00914、0．07283±0．00917和0．07873±0．01084,两组各时间点bFGF表达量的差异均有统计学意义（t=-6．38、t=-4．99、t=-2．87,P〈0．05）。结论丝素膜作为眼睑原位重建术睑板的替代物组织相容性好,能有效恢复睑板形态,可替代异体巩膜重建眼睑。     

不同时期准分子激光原位角膜磨镶术后角膜上皮内生的处理

目的探讨准分子激光原位角膜磨镶术（laser in situ keratomileusis,LASIK）后角膜上皮内生的理想处理方法。方法1999年1月至2008年12月处理20例（22眼）LASIK术后角膜上皮内生患者．经历3个认识和处理时期。第一时期从1999年1月至2000年12月,处理3例（3眼）,均按术后炎症反应处理．无明确角膜上皮内生概念及相关处理方法。第二时期为2001年1月至2004年12月,处理8例（9眼）．角膜上皮内生与角膜上皮植入未严格区分,按角膜上皮植入原则处理。第三时期为2005年1月至2008年12月,处理9例（10眼）,均为不同情况下引起的角膜上皮内生,其中2例（2眼）为单纯角膜上皮内生,5例（6眼）为皱褶瓣处理后产生的上皮内生,2例（2眼）为角膜划伤后上皮内生。处理要点：①内生上皮处理净后用拖拽法将角膜瓣边晾干边原位复位。②角膜瓣复好位后晾干约5～8min。③处理后不戴角膜接触镜。结果第一时期处理3眼中,2眼角膜瓣被剪除,处理后1个月裸眼视力均为5．0：1眼角膜瓣颞上缘部分溶解,未波及光学区。裸眼视力为4．9。第二时期处理9眼中,6眼1次处理成功：3眼角膜上皮内生复发,处理2d后行再次冲洗处理。处理后1个月裸眼视力：2眼为4．9．6眼为5．0,1眼为5．1。第三时期所处理9例（10眼）均1次处理成功,角膜瓣均平整。2例（2眼）单纯角膜上皮内生患者术后第1个月的裸眼视力均为5．0;5例（6眼）皱褶瓣处理后又产生上皮内生患者．再处理后角膜上皮愈合时间分别为3眼2d、2眼3d、1眼4d,1个月后裸眼视力：2眼为4．8,1眼为4．9,3眼为5．0：2例（2眼）角膜划伤后上皮内生者,处理2d后上皮愈合．7d后角膜炎症消退．1个月后裸眼视力均为4．8。所处理的22眼中．3眼矫正视力下降1行,其余矫正视力均无下降。术后随访3个月以上．所有患者未再见有角膜?     

体外构建组织工程角膜的研究进展

角膜移植是目前治疗角膜盲最有效的方法,但角膜供体材料不足及角膜移植术后的免疫排斥反应限制了角膜移植的临床应用.构建具有良好生物相容性和正常生物学功能的组织工程角膜替代物是解决当前角膜供体不足最为有效的方法.近些年来,随着生物材料、细胞培养及组织工程技术的发展,组织工程角膜在支架材料、种子细胞及组织的三维构建等方面都取得了较大进展,部分组织工程产品及技术也已经应用于临床.人们有望通过组织工程技术构建出具有良好机械强度、透光性及生物相容性的组织工程角膜,真正解决临床上角膜供体缺乏及移植术后免疫排斥等问题.羊膜、脱细胞猪角膜基质、胶原、丝素蛋白及壳聚糖等是目前较常用的支架材料.组织工程角膜较常用的种子细胞主要有永生化和原代培养的角膜细胞、胚胎干细胞及成体多能干细胞.本文就组织工程角膜的支架材料、种子细胞及三维构建进行综述.     

体外培养的兔角膜内皮细胞生物学特性

背景如何选择高质量、生物学特性更接近在体生理状态的角膜内皮种子细胞是组织工程角膜研究的基础。角膜内皮细胞（CECs）的培养、鉴定及生物学特性检测是优选角膜内皮种子细胞的瓶颈问题。目的建立兔CECs原代培养及鉴定的方法,检测传代后细胞的生物学特性。方法从30只新西兰大白兔的角膜组织完整撕除后弹力层及CECs层,采用胰蛋白酶消化法进行原代培养,观察培养细胞的生长状态。分别从形态学、基因水平和蛋白水平鉴定细胞：茜素红染色法观察细胞形态,并与新鲜角膜组织的内皮细胞进行对比;逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测IVα2型胶原（COL4A2）、血管内皮生长因子受体2（FLK1）、Na^-K^＋ATP酶α亚单位（ATPIA1）、水通道蛋白1（AQP1）、电压依丛性阴离子通道（VDACs）等相对特异性基因;免疫细胞化学法观察神经元特异性烯醇化酶（NSE）、Na^-K^＋ATP酶及紧密连接蛋白ZO-1的表达。采用MTT比色法测定传代细胞的增生活性变化,采用超微量ATP酶试剂盒及免疫荧光法分别测定传代细胞Na^-K^＋ATP酶活性及其表达量的变化。结果原代培养的兔CECs多在24h内贴壁,2—3d达融合,形态呈六边形。随着传代代数的增加,细胞形态逐渐发生改变,第2代、第3代细胞可见空泡样变。原代培养的细胞茜素红染色可见清晰的细胞轮廓,与在体的CECs形态相似。RT—PCR法检测可见COL4A2、FLKl、ATP1Al、AQP1、VDACs等基因在培养细胞中表达。免疫荧光染色结果显示NSE、Na^-K^＋ATP酶、ZO-1在培养细胞中呈阳性表达。MTT检测结果显示,传代后细胞的增生活性逐渐下降,尤其第2代、第3代细胞下降明显。定量检测结果显示随着传代代数的增加,兔CECs的Na^-K^＋ATP酶活性逐渐降低,各代细胞的Na^-K^＋ATP酶活性总体比较的差异有统计学意义（F=77．174,P=0．000）。结论成功用酶消化法建立了体外培养兔CECs的方法,并从多个层次建立了纯化细胞的鉴定方法。研究结果证实经传代后的CECs的增生活性和功能均有所下降,因此在进行相关的研究时应选用前2代的细胞。     

人工角膜载体的体外构建及生物相容性研究

目的　应用壳聚糖（chitosan，CS）和蚕丝蛋白（silk fibroin，SF）构建组织工程角膜基质，探讨不同比例的CS和 SF共混膜的生物特性，为以后的角膜移植奠定基础。方法　将SF和CS按体积比3∶1和4∶1混合，体外构建具有相应器官特征的角膜基质层；体外培养原代兔角膜基质及上皮细胞，检测细胞分布情况和载体膜片的物理特性；免疫组织化学法测定细胞表型和分布情况,CCK-8试剂盒测定载体膜片毒性，电镜下观察细胞结构形态和附着情况，将构建的膜片植入兔板层角膜中检测组织生物相容性。结果　载体膜片的吸水率均在90%左右，明显强于天然角膜，抗拉力SF/CS 3∶1组为 0.90±0.02，SF/CS 4∶1组为 1.30±0.05，透光率均大于60%，且抗拉力和透光率随着CS含量增加而增强，但与天然角膜组织间仍存在差异。与载体膜片共培养的细胞在培养2周后，电镜下可见膜片上形成致密的细胞层，重构的板层角膜结构与天然角膜相似。CCK-8法检测结果显示，合成膜无明显毒性。免疫组织化学染色结果显示，培养出的基质细胞形态与天然角膜相似。动物板层移植术后，裂隙灯观察载体膜片组术后半个月内充血消失，无明显的前房炎症反应，术后1个月拆线时无明显新生血管。免疫组织化学法检测术后病理组织未发现CD4+、CD8+、CD31+T细胞浸润。结论　CS-SF可以用于组织工程角膜基质的构建，这为重建角膜基质提供了方向。     

兔角膜内皮细胞球形培养的活性和细胞表型

背景 组织工程角膜内皮层的构建和细胞注射疗法需要足够数量的角膜内皮细胞（CECs）,因此如何在体外培养大量高活性的角膜内皮种子细胞是当前亟需解决的问题. 目的 建立兔CECs高活性三维（3D）球形培养方法,探索培养细胞的生物学特性. 方法 酶消化法分离和培养兔CECs并进行传代,经低黏附振动培养法产生兔CECs球,倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态;采用扫描电子显微镜观察CECs球的表面超微结构;用吖啶橙染色法鉴定CECs球中细胞的活性;采用CCK-8试剂盒检测细胞的吸光度（A450）值,判断细胞的增生情况.将CECs球接种到6孔细胞培养板贴壁培养1周,球形培养的细胞为球形培养组,常规培养的细胞为常规培养组.采用免疫荧光法检测闭锁小带蛋白1（ZO-1）和Na＋/K＋-ATP酶在细胞中的表达.结果 经球形培养的CECs呈聚集生长,培养1周细胞形态为六角形或多边形,融合成单层,呈铺路石状排列;扫描电子显微镜下可见兔CECs球体周围有细胞爬出,未长散的细胞球中细胞与细胞之间结合紧密,球体表面凹凸不平.吖啶橙染色表明,细胞球中90％细胞呈绿色荧光;球形培养组细胞平均A450值为1.524±0.013,常规培养组细胞平均A450值为1.265±0.021,球形培养组细胞增生值明显增加,2个组间差异有统计学意义（t=-3.436,P=0.010）.免疫荧光检测表明,培养的细胞中ZO-1和Na＋/K＋-ATP酶阳性细胞膜对FITC呈绿色荧光,细胞核DAPI染色呈蓝色荧光.结论 CECs的3D球形培养方法培养的细胞可保持细胞的高活性、高增生能力和细胞表型,为构建组织工程角膜内皮及细胞疗法提供了更好的角膜内皮种子细朐.     

Safety profile of bevacizumab on cultured human corneal cells

PURPOSE: To study the corneal biocompatibility of bevacizumab on various cultured human corneal cells. METHODS: Cell cultures of corneal keratinocytes (CKs), corneal fibroblasts (CFs), and corneal endothelial cells (CECs) were harvested from human donor eyes and exposed to various concentrations of bevacizumab (0.25-5.0 mg/mL). Cell viability was assessed by using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay at days 1 and 4 after exposure. For cytotoxicity testing, confluent cells were cultured in serum-depleted medium, and the MTT test was performed after 24 hours of incubation. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGF receptors (VEGFR1 and VEGFR2), keratan sulphate (KS), and cytokeratin-3 (AE5) was studied by immunohistochemistry. Live/dead viability/cytotoxicity assay was performed and analyzed by fluorescence microscopy after 24 hours of incubation. Cell morphology was assessed with a phase-contrast microscope after 7 days of exposure with different concentrations of bevacizumab (0.25-5.0 mg/mL), and signs of cellular damage were assessed. RESULTS: No cytotoxic effect of bevacizumab on CKs, CFs, and CECs could be observed when used at a concentration of 5.0 mg/mL or lower. Bevacizumab-treated cells showed no signs of cellular damage compared with the control. CKs, CFs, and CECs stained positively for VEGF, VEGFR1, and VEGFR2. CKs and CECs stained positively for AE5, whereas CFs were immunopositive for KS. CONCLUSIONS: Bevacizumab is not toxic to corneal cells of human origin in vitro at doses usually used for treatment of corneal neovascularization, which is 20-fold higher than that used for intravitreal application.     

原子力显微镜观察角膜内皮细胞诱导后诱导多能干细胞的形态学变化

背景 诱导多能干细胞(iPSCs)具有类似胚胎干细胞的分化能力,可以分化为全身各种类型的体细胞,同时不会引起伦理学问题和免疫排斥反应,因此iPSCs有可能作为组织工程角膜内皮重建的种子细胞. 目的 利用原子力显微镜(AFM)观察人iPSCs与兔角膜内皮细胞(CECs)混合共培养后分化iPSCs的形态学变化,并找出其细胞膜超微结构变化的规律.方法 分别培养兔CECs和人MMC-iPSCs细胞系,用免疫组织化学法测定iPSCs细胞的标志物以鉴定iPSCs细胞.将传代后7d的iPSCs与60％融合的CECs在内皮细胞培养基中共培养建立混合共培养模型,利用AFM结合倒置显微镜观察CECs及共培养前后iPSCs的形貌和超微结构变化.结果 CECs的长度和宽度分别为(66.93±10.48) μm和(44.85±8.14) μm,共培养前未分化的iPSCs的长度和宽度分别为(12.51±1.40)μm和(10.93±1.69) μm,共培养后分化的iPSCs长度和宽度分别为(36.12±10.29) μm和(31.53±9.65) μm.分化的iPSCs长度和宽度均大于共培养前的iPSCs,差异均有统计学意义(P＜0.05).分化的iPSCs宽度与CECs比较差异无统计学意义(P＞0.05).CECs细胞膜表面突起的最大宽度和高度分别为(2.11±1.03)μm和(115.68±92.08) nm,膜表面凹陷为窗孔样凹陷,最大宽度为(1.49±0.65) μm,膜表面结构几何参数均方根粗糙度(Rq)为(39.20±7.82) nm,平均粗糙度(Ra)为(30.37±5.32)nm;未分化的iPSCs细胞膜表面突起为颗粒状,突起的最大宽度和高度分别为(0.39±0.22) μm和(13.11±9.18)nm,膜表面凹陷为虫蚀样,凹陷的最大宽度为(0.34±0.18) μn,Rq和Ra分别为(26.60±4.93)nm和(9.97±3.78) nm;分化的iPSCs细胞膜表面突起为指状,突起的最大宽度和高度分别为(1.91±0.76) μm和(106.55±77.27)nm,膜表面凹陷为窗孔样,凹陷的最大宽度为(1.61± 1.25) μm,Rq为(57.33±12.80) nm,Ra为(43.63±11.17)nm.分化的iPSCs细胞膜表面突起最大宽度和高度、凹陷最大宽度、Rq、Ra均大于共培养前未分化的iPSCs,差异均有统计学意义(P＜0.05),与CECs比较差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论 AFM能够敏感地观察到iPSCs与CECs接触共培养7d后iPSCs向CECs方向转化的形态学变化,为进一步研究iPSCs向CECs的分化提供了研究基础.