三氧化二砷对体外培养的人视网膜色素上皮细胞作用的实验研究

目的 观察三氧化二砷（As2O3）对体外培养的人视网膜色素上皮（RPE）细胞的增生抑制及凋亡诱导作用。方法 不同浓度的As2O3理细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，四唑盐（MTT）比色法检测人RPE细胞对As2O3的药物敏感性，流式细胞仪检测细胞周期变化和凋亡率。结果 药物处理后细胞出现凋亡形态改变。MTT比色法结果显示，As2O3作用血清组人RPE细胞后各实验组与对照组之间吸光度比较有统计学意义，药物剂量分别为：作用24h为6．25μmol／L（P=0．018）、48h为6．25μmol／L（P〈0．01）、72h为1．56μmol／L（P〈0．01）；作用无血清组细胞48h后为12．5μmol／L（P〈0．01）。流式细胞仪分析结果显示As2O3作用人RPE细胞周期改变表现为S期阻滞及G2／M期延长。As2O3处理人RPE细胞后出现凋亡峰。结论 As2O3可抑制体外培养的人RPE细胞的生长并诱导其凋亡，有望为临床防治增生性玻璃体视网膜病变（PVR）提供新的药物干预。     

不同波长的光照射对视网膜色素上皮细胞生长及其分泌生长因子的影响

背景近视的发病机制是眼科研究的一个热点,近年来发现,由神经视网膜细胞及视网膜色素上皮（RPE）细胞分泌的细胞因子可能参与近视的发病,RPE细胞因子的分泌功能受光照射的影响,而RPE细胞对不同波长光的吸光度（A）值是不一样的。目的研究不同波长的光照射对人胚RPE细胞增生及其分泌肝细胞生长因子（HGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bVGF）和转化生长因子-β（TGF—β）的影响,从细胞水平和分子生物学水平探讨近视的发病机制。方法第4～5代人胚RPE细胞置于白光、波长为775nm的红光及波长为480nm的蓝光下照射和培养48h,MTT比色法检测各组人RPE细胞的增生情况,并用透射电子显微镜观察各组传代细胞的超微结构。分别于光照射后12、24、48、72h收集培养液,采用酶联免疫吸附实验（ELISA）测定培养基中HGF、bFGF和TGF—β的质量浓度。用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测不同波长光照射24h后RPE细胞中HGFmRNA的表达水平,分析蓝光、红光、白光照射对体外培养RPE细胞的影响。结果蓝光组、红光组、白光组和对照组RPE细胞的A490值分别为0．0218±0．0014、0．0353±0．0025、0．0371±0．0024和0．0445-0．0046。4个组中RPE细胞的增生速度明显不同,差异有统计学意义（F=12．579,P〈0．05）,蓝光组和红光组A490值均明显低于对照组,差异均有统计学意义（t=2．043、t=2．024,P〈0．05）。ELISA结果显示人胚RPE细胞可以分泌HGF、bFGF和TGF-β,在受到不同波长的光照射后,不同时间点HGF、bFGF和TGF—β的分泌量不同,随着时间的变化,4个组HGF、TGF—β的质量浓度均逐渐升高,二者在72h和48h均高于12h（P〈0．05）,红光组与蓝光组更为明显,与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。各波长组bFGF的质量浓度随着光照时间的延长在RPE细胞中的表达均逐渐降低,72h与12h时相比差异均有统计学意义（P〈0．05）。RT—PCR结果显示,不同波长光照射后RPE细胞中HGFmRNA的表达水平不同,蓝光下培养的RPE细胞HGFmRNA表达量最少,白光组、红光组和蓝光组HGFmRNA的表达量（A490）与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。透射电子显微镜下红光组、白光组人胚RPE细胞与对照组相比超微结构均无明显变化,但蓝光组RPE细胞核染色质稀疏变淡,细胞器减少,细胞界膜不清或消失。结论不同波长的光照射可影响人RPE细胞的增生及其分泌HGF、bFGF和TGF—β的功能,提示近视的形成可能与不同波长的光相互作用有关。     

姜黄素对人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

背景姜黄素是从姜的根茎中提取的物质,可抑制多种内皮细胞和上皮细胞的增生,但其抑制视网膜色素上皮（RPE）细胞增生的作用及机制鲜见报道。目的研究姜黄素对体外培养的人RPE细胞增生的抑制作用及机制。方法第5代人RPE细胞株接种于96孔板,分别加入5、10、15、20mg／L姜黄素分别作用24、48和72h,未加入姜黄素的作为对照,采用水溶性四氮唑-1（WST-1）检测各组人RPE细胞的增生情况和细胞活性（A值）;采用流式细胞术检测姜黄素作用后RPE细胞的凋亡率、坏死率和不同细胞周期的细胞比例;透射电子显微镜（TEM）观察细胞超微结构的变化;采用Westernblot法检测RPE细胞中促凋亡因子p53、p21WAF1/CIPI和增生细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达。结果WST-1检测显示,随着姜黄素质量浓度的增加,人RPE细胞的』4值逐渐降低,差异有统计学意义（Fm质量浓度=96．55,P=0．00）;随着姜黄素作用时间的延长A值逐渐增加,差异有统计学意义（FH目=4634．28,P=0．00）。流式细胞术检测表明,15mg／L姜黄素作用48h早期凋亡细胞率为（13．37±1．26）％,明显高于对照组的（7．03±0．37）％,差异有统计学意义（t=8．33,P=0．00）,姜黄素作用72h,早期凋亡细胞率及中晚期凋亡细胞率分别为（15．97-＋0．16）％和（0．26-＋0．03）％,明显高于对照组的（7．29±0．37）％和（O．14±0．02）％,差异均有统计学意义（t=37．80、7．44,均P=0．00）。15mg／L姜黄素作用48h后人RPE细胞处于G。／G,期细胞比例为（57．17±1．17）％,明显低于对照组的（67．73±1．10）％,差异有统计学意义（t=11．40,JP=0．00）。姜黄素作用后人RPE细胞可见线粒体肿胀和空泡样变性。Westernblot检测显示,15mg／L姜黄素作用24、48、72h后p53和p21WAF1/CIPI蛋白相对表达值均明显高于对照组,差异均有统计学意义（均P〈0．05）,而15mg／L姜黄素作用24、48、72hPCNA蛋白的相对表达水平明显低于对照组,差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论姜黄素可有效抑制体外培养的人RPE细胞增生,其抑制作用呈剂量和时间依赖性,其作用机制可能与p53信号通路有关。     

高糖条件下胰岛13细胞株MIN-β细胞对视网膜色素上皮细胞的保护作用

背景糖尿病视网膜病变（DR）与高糖所致的视网膜色素上皮（RPE）细胞的氧化损伤密切相关,近年来人们广泛地致力于保护RPE细胞的研究。目的研究胰岛B细胞株MIN-6细胞对RPE细胞高糖损伤的保护作用。方法将RPE细胞体外培养4d,待贴壁生长良好后分为正常对照组、高糖对照组和MIN-6细胞共培养组,ABC法鉴定RPE细胞。用含5mmol／L葡萄糖的RPE细胞培养液进行培养作为正常对照组,高糖对照组用含30mmol／L葡萄糖的培养液进行培养,MIN-6细胞共培养组为含5×10^4个MTN-6细胞以及30mmol／L葡萄糖的培养液进行培养。各组继续培养24h后,应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测量高糖对已贴壁生长良好的RPE细胞的损伤作用以及MIN一6细胞对RPE细胞高糖损伤的保护作用。结果ABC法鉴定RPE细胞可见95％以上呈棕色着色,为阳性细胞。各组继续培养24h后,正常对照组、高糖对照组和MIN-6细胞共培养组RPE细胞的吸光度（A_540）值差异有统计学意义（F=19．94,P〈0．01）,正常对照组的A。值为0．44±0．02,高糖对照组为0．30±0．01,差异有统计学意义（t=6．85,P〈0．01）;MIN-6细胞共培养组的A。值为0．41±0．01,与高糖对照组的0．30±0．叭比较,差异有统计学意义（t=5．62,P〈0．01）。正常对照组RPE细胞的生存率为（97．5±3．3）％,高糖对照组为（68．2±4．5）％,差异有统计学意义（t=11．30,P〈0．01）。结论高糖导致贴壁生长良好的RPE细胞损伤,MIN-6细胞可以明显保护高糖所致的RPE细胞损伤。     

缺氧条件下共培养时观察Mtiller细胞对RPE细胞生长的影响

背景视网膜色素上皮（RPE）细胞和Mtiller细胞在维持视网膜的正常代谢中起重要作用,多种生理、病理过程与二者的相互作用有关。目的利用Transwell小室体外共培养兔Mtiller细胞与RPE细胞,观察缺氧条件下Moller细胞对RPE细胞增生和迁移的影响。方法应用组织块培养法和酶消化法分别培养原代兔Mtiller细胞和RPE细胞,免疫组织化学法鉴定2种细胞。取第3代培养良好的细胞进行试验。应用CoCl2培养细胞以建立细胞化学缺氧模型,分为常氧组和缺氧组,每组又分为对照组（RPE细胞单独培养）、共培养组（MOiler细胞与RPE细胞共同培养）。利用Transwell小室建立Mtiller细胞和RPE细胞的共培养模型,各组分别培养3、6、24、48h,利用MTT法和结晶紫染色法对培养存活的RPE细胞进行计数,检测常氧及缺氧条件下Miiller细胞对RPE细胞增生和迁移的影响。结果原代培养的RPE细胞符合RPE细胞的特征,90％以上呈现CK．18阳性反应。培养的Miiller细胞对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S-100染色呈阳性反应。与常氧培养条件比较,缺氧条件下单独培养的RPE细胞增生数量增加,细胞迁移数量增加,差异有统计学意义（P〈0．01）;缺氧条件下与MUller细胞共培养的RPE细胞增生数量和迁移数量明显增加,与常氧组和单细胞培养情况下比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。缺氧条件下,与RPE细胞单细胞培养组比较,共培养组RPE细胞的增生和迁移增加,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论缺氧可以促进RPE细胞的增生和迁移,Mtiller细胞可以加重缺氧引起的RPE细胞的增生和迁移。     

雷帕霉素抑制猴视网膜微血管内皮细胞增生的实验研究

背景 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在细胞周期调控机制中扮演着重要角色,其抑制剂雷帕霉素（RAPA）可通过调控细胞周期抑制细胞增生. 目的 观察RAPA对体外培养的猴视网膜微血管内皮细胞RF/6A细胞系增生的影响. 方法 体外培养RF/6A细胞系,分别在培养液中加入PBS、10 μg/L RAPA和5μg/L RAPA.采用Western blot法检测cyclin D1蛋白在各组RF/6A细胞中的表达;采用流式细胞仪检测不同质量浓度RAPA作用后G0/G1期RF/6A细胞的比例;行血管内皮细胞体外成管实验观察不同质量浓度RAPA对RF/6A细胞成管的抑制作用. 结果 Western blot检测表明,PBS组、10μg/LRAPA组和5μg/L RAPA组RF/6A细胞中cyclin D1蛋白的相对表达量分别为0.92±0.04、0.58±0.02和0.73±0.02,3个组间的差异有统计学意义（F=246.320,P=0.000）,其中10 μg/L RAPA组和5μg/L RAPA组cyclin D1蛋白在RF/6A细胞中的相对表达量均明显低于PBS组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.细胞周期检测发现,PBS组、10 μg/L RAPA组和5μg/L RAPA组G0/G1期细胞比例分别为（42.13±0.57）％、（65.15±0.64）％和（54.09±0.78）％,3个组间差异有统计学意义（F=887.815,P=0.000）,其中10 μg/L RAPA组和5 μg/L RAPA组RF/6A细胞G0/G1期比例明显高于PBS组,差异有统计学意义（P＜0.05）.体外成管实验显示,PBS组、10 μg/L RAPA组及5μg/L RAPA组每个视野下血管内皮细胞成管数分别为（9.67±1.53）、（4.33±0.58）和（6.33±0.58）个/视野,3个组间比较差异有统计学意义（F=21.778,P=0.002）,10 μg/LRAPA组内皮细胞管数最少,其次为5μg/L RAPA组,均明显少于PBS组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 RAPA可通过下调cyclin D1蛋白的表达抑制RF/6A细胞的增生,较高质量浓度的RAPA作用更强.     

PDGF对人RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响

背景研究表明血小板源性生长因子（PDGF）能调节多种细胞中基质金属蛋白酶／基质金属蛋白酶组织抑制剂（MMP／TIMP）的表达和平衡,但视网膜色素上皮（RPE）细胞中MMP／TIMP的表达与PDGF作用剂量和作用时间的关系尚不明确。目的观察PDGF对RPE细胞中MIP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响。方法体外培养人RPE细胞系ARPE-19,将达到70％～80％融合的细胞分为5个组。分别将0、0．1、1、10、50mg／LPDGF加入RPE细胞培养基作用36h,分别采用逆转录PCR（RT—RCR）法和Western blot法检测各组RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA及其蛋白的表达。PDGF组采用10mg／LPDGF组PDGF分别刺激RPE细胞24、36和48h,对照组用不含PDGF的培养液培养,采用逆转录PCR（RT—RCR法和Western blot法分别检测RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA及蛋白的表达。结果随着PDGF质量浓度的增加和刺激时间的延长,RPE细胞生长速度加快,细胞增生明显。PDGF刺激RPE细胞36h,随着PDGF质量浓度的增加,MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA在RPE细胞中表达相对值逐渐增加,各组间差异均有统计学意义（MMP-2 mRNA：F=79．304,P=0．000;MMP-9 mRNA：F=8．465,P=0．003）,其中1、10、50mg／LPDGF组RPE细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达相对值明显高于0mg／L PDGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值随着PDGF质量浓度的增加而逐渐增加,各组间差异均有统计学意义（MMP-2：F=26．550,P=0．000;MMP-9：F=80．993,P=0．000）,其中1、10、50mg／LPDGF组RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值明显高于0mg／L PDGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。各质量浓度PDGF组RPE细胞中TIMP-1 mRNA和蛋白表达相对值差异均无统计学意义（F=0．143,P=0．962;F=1．955,P=0．178）。随着10mg／L PDGF刺激RPE细胞时间的延长,RPE细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达逐渐增加,差异均有统计学意义（MMP-2 mRNA：F时间=83．250,P=0．002;MMP-9 mRNA：F时间=6．785,P=0．019）;各时间点RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值明显增加,差异均有统计学意义（MMP-2：F时间=11．185,P=0．041;MMP-9：F时间=968．413,P=0．000）。PDGF作用不同时间点对照组与PDGF组间MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白在RPE细胞中的表达差异均有统计学意义（分组：均P=0．000,时间点：P〈0．05）,而各时间点2个组间RPE细胞中TIMP-1表达相对值的差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论PDGF上调PRE细胞中MMP-2和MMP-9的表达,其作用呈剂量和时间依赖性,但对PRE细胞中TIMP-1的表达无明显影响。PDGF导致RPE细胞中MMP／TIMP的平衡失调,从而导致细胞外基质的破坏,促进RPE细胞的迁移。     

辅酶Q10对人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤的保护作用

背景有多种因素参与年龄相关性黄斑变性（AMD）的发病,其中视网膜色素上皮（RPE）细胞的氧化应激损伤与AMD的发病密切相关。实验和临床研究表明,辅酶Q10是一种强抗氧化剂,探讨其对人RPE细胞的氧化应激损伤是否有保护作用对于AMD的防治有重要的临床意义。目的探讨辅酶Q10对体外培养的人RPE细胞氧化应激损伤的保护作用及其作用机制。方法体外培养人RPE细胞,分为正常对照组（单纯培养基培养）、不同浓度（0．01、1、100μmol／L）辅酶Q10预处理组和单纯叔丁基过氧化氢（TBHP）处理组,其中各浓度辅酶Q10预处理组以辅酶Q10预处理后暴露于TBHP,光学显微镜下观察各组RPE细胞的形态;用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测各组RPE细胞活性的变化;AnnexinV—FITC／PI染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;TBARS法检测细胞的脂质过氧化水平;用DCFH—DA荧光法检测细胞内活性氧簇（ROS）水平;实时定量PCR法检测RPE细胞中促凋亡基因FasmRNA的表达;Westernblot法检测细胞中Fas蛋白的表达。结果单纯TBHP处理组RPE细胞贴壁数量较正常对照组明显减少,而0．01、1、100μmol／L辅酶Q10预处理组贴壁细胞数较单纯TBHP处理组增加,高浓度辅酶Q10预处理组细胞形态的改善和细胞存活的数目更接近正常对照组。与单纯TBHP处理组比较,1μmol／L、100μmol／L辅酶Q10预处理组RPE细胞吸光度（A450）值明显增高（0．52±0．10VS．0．25±0．03、0．59±0．06VS．0．25±0．03）,差异均有统计学意义（P=0．041、0．002）;RPE细胞的凋亡率明显下降[（72．1±6．6）％VS．（91．7±2．3）％、（69．0±4．4）％VS．（91．7±2．3）％],差异均有统计学意义（P=0．032、0．004）;0．01、1、100μmol／L辅酶Q10预处理组的细胞脂质过氧化水平依次降低,与单纯TBHP处理组比较差异均有统计学意义（P=0．047、0．030、0．015）,与单纯TBHP组相比,0．01、1、100μmol／L辅酶Q10预处理组细胞内ROS水平逐渐下降,I;xmol／L、100μmol／L辅酶Q10预处理组细胞内ROS水平明显低于单纯TBHP处理组（5．25±0．90 vs11．39±2．30、7．91±0．80VS．11．39±2．30）,差异均有统计学意义（P=0．028、0．007）;与单纯TBHP处理组相比,辅酶Q10预处理组细胞中FasmRNA表达量均有不同程度的下降,1μmol／L、100μmol／L辅酶Q10预处理组细胞中FasmRNA表达量的差异均有统计学意义（P=0．049、0．008）;0．01、1、100μmol／L辅酶Q10预处理组细胞中Fas蛋白表达量均明显下降,差异均有统计学意义（P=0．001、0．000、0．000）。结论辅酶Q10对体外培养的人RPE细胞具有保护作用,其作用在一定范围内呈浓度依赖性,这种保护作用可能与减少细胞的氧化应激损伤和抑制细胞凋亡有关。     

雌二醇及丙酸睾酮对H2O2诱导泪腺上皮细胞凋亡的抑制作用

背景性激素在干眼症的发病过程中起着重要的作用,尤其是对泪腺的功能起到非常重要的调控作用,但其对泪腺上皮细胞凋亡作用的机制尚不完全明确。目的探讨雌二醇及丙酸睾酮对H2O2诱导的兔泪腺上皮细胞的凋亡作用。方法分离2～3月龄雄性普通级新西兰兔的泪腺组织,用组织块培养法体外培养兔泪腺上皮细胞,用细胞角蛋白（CK）抗体对培养的细胞进行免疫细胞化学鉴定。取对数生长期的细胞,以5×10^-5个／ml接种于96孔板培养44h后,培养基中分别加入1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8mol／L的雌二醇或丙酸睾酮培养24h,再加入1×10^-4 mol／L H2O2培养1h诱导细胞凋亡,仅用H2O2作用的细胞作为凋亡对照组,常规培养的细胞作为空白对照组。MTT比色法检测各组细胞570nm处泪腺上皮细胞活性的吸光度（A570）值,流式细胞仪Annexin V／PI双染法检测各组细胞的凋亡情况。结果培养的细胞呈不规则多边形,其中80％以上的细胞对CK呈阳性反应。MTT比色法检测表明,与空白对照组比较,凋亡对照组、不同浓度雌二醇组和丙酸睾酮组的A。值均明显降低,差异均有统计学意义（P〈0．01）,1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7mol／L雌二醇组和1×10^-6mol／L丙酸睾酮组的A570值均明显高于凋亡对照组,差异均有统计学意义（P〈0．01）。与相应浓度丙酸睾酮组相比,雌二醇组A570值均明显增高,差异均有统计学意义（P〈0．01）。与凋亡对照组比较,丙酸睾酮组和雌二醇组早期及晚期细胞凋亡率均明显下降,差异均有统计学意义（P〈0．01,P〈0．05）;与丙酸睾酮组相比,雌二醇组早期及晚期的细胞凋亡率明显下降,差异均有统计学意义（P〈0．01,P〈0．05）。结论雌二醇及丙酸睾酮可抑制H2O2诱导的泪腺上皮细胞的凋亡,雌二醇的抑制作用强于丙酸睾酮。雌二醇对泪腺上皮细胞凋亡的抑制作用呈一定的剂量依赖性。     

EGF诱导人RPE细胞表达整合素α5过程中丝裂原激活的蛋白激酶的作用

目的探讨表皮生长因子（EGF）诱导人视网膜色素上皮（RPE）细胞表达整合素α5过程中丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）的作用。方法将人RPE细胞分为对照组、EGF组和PD98059组,RT—PCR及流式细胞术观察各组整合素α5mRNA和蛋白的表达;Westernblot法检测各组人RPE细胞中MAPK的磷酸化水平。结果对照组的整合素α5mRNA／β-actinmRNA像素值的比值为0．93±0．06,PD98059组为1．06±0．07,EGF组为1．97±0．09,EGF组与其他2组相比,差异有统计学意义（P〈0．01）;流式细胞术检测显示,24h后整合素α5的荧光强度分别为1．94±0．22、4．56±0．25、2．39±0．104,差异有统计学意义（P〈0．05）。Westernblot检测显示,30min后EGF组细胞外信号调节激酶（ERK）1／2的磷酸化激活水平最高,PD98059组抑制ERK1／2的磷酸化激活,对照组ERK1／2的磷酸化激活作用很弱。结论ERK1／2的磷酸化激活参与EGF诱导人RPE表达整合素α5的过程。EGF激活ERK1／2通路刺激人RPE细胞整合素α5mRNA的表达。     

核心蛋白多糖对兔晶状体上皮细胞增生的抑制作用

背景 研究发现,白内障囊外摘出术后组织修复反应可诱导房水中活性转化生长因子β(TGF-β)的增加,残留的晶状体上皮细胞(LECs)移行、分化,细胞外基质沉积,引起上皮-间质转化,导致后囊膜混浊(PCO)的发生.寻求有效的抑制LECs增生的药物对于临床上防治PCO的发生具有重要意义. 目的 探讨核心蛋白多糖( decorin)对兔LECs增生的抑制作用及其剂量-效应与时间-效应的关系. 方法 兔LECs细胞株进行培养和传代,将处于指数生长期的细胞以8×106个/L密度接种于96孔板,将0.1、1.0、10.0 mg/Ldecorin分别加入培养基中培养24、48、72 h,加入体积分数0.1％ DMSO培养的细胞为阳性对照组,常规培养基培养的细胞为空白对照组.MTT比色法分别测定不同质量浓度的decorin作用于LECs不同时间后的细胞生长抑制率;采用流式细胞技术测定各组细胞的细胞周期,用ELISA法检测各组培养液上清中TGF-β的水平,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定TGF-βmRNA在LECs中的表达,免疫细胞化学法观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达.结果 ELISA检测结果表明,各组培养基上清液中TGF-β表达量的差异有统计学意义(F=39.24,P=0.03),不同质量浓度组TGF-β水平均明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.01),1.0 mg/L、10.0 mg/L decorin组TGF-β水平均明显低于0.1 mg/L decorin组(P＜0.05).MTT比色法结果显示,≥1.0 mg/L decorin组LECs增生的抑制率明显高于空白对照组,各质量浓度decorin组药物作用48 h和72 h后LECs增生的抑制率明显高于24 h的值,药物作用72 h后LECs增生的抑制率明显高于48 h的值,差异均有统计学意义(P＜0.05),各质量浓度decorin组G0/G1期LECs所占比例均较空白对照组明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR检测显示,TGF-β mRNA的表达随着decorin质量浓度的升高而降低.免疫组织化学染色表明,10.0 mg/L decorin组α-SMA在LECs中的表达明显弱于空白对照组. 结论 Decorin可以抑制LECs的增生,也可以诱导LECs凋亡,其效应呈明显的剂量和时间依赖性,有望成为最具潜力的防治PCO的药物之一.     

多西他赛对人晶状体上皮细胞的抑制作用

背景一些已知的抑制人晶状体上皮细胞（LECs）增生的药物由于严重的不良反应限制了其临床应用，寻找高效、安全的抑制LECs增生的药物是防治晶状体后囊膜混浊（PCO）的研究热点。目的探讨多西他赛对LECs增生的影响，并与盐酸表柔比星、盐酸吡柔比星和雷替曲塞的作用进行比较。方法对永生系人LECs细胞株SRAOI／04进行培养及传代，将不同浓度的多西他赛、盐酸表柔比星、盐酸吡柔比星和雷替曲塞加入LECs中分别作用24、48、72h，以MTT法评价不同浓度的多两他赛对人LECs增牛的抑制作用并与其他药物进行比较。用流式细胞术分析不同浓度的多西他赛作用48h后对LECs细胞周期的影响，采片jAnnexinV-FITC／PI标记法和蛋白印迹分析法评估不同浓度的多西他赛作用48h后LECs细胞bcl-2蛋白的表达和凋亡情况。结果8～519pmol／L多西他赛组LECs的增生率为100％，LECs形态正常，而66nmol／L多西他赛组干预48h和72h后LECs的增生率分别为34．7％和27．4％，LECs形态出现异常。23．22～523．56μmol／L雷替曲塞对人LECs的增生无明显抑制作用。多西他赛作用48h和72h时，半数抑制量（IC50）明显低于盐酸吡柔比星和盐酸表柔比星。多西他赛作用LECs48h后，随着多西他赛浓度的增高，处于G2／M期的LECs百分数明显增加，各组的总体差异有统计学意义（F=2633．05，P〈0．01）；8．3nmol／L和266nmol／L多西他赛浓度组干预48h后，LECs的凋亡率分别为22．4％和27．9％，较细胞对照组升高，差异均有统计学意义（χ2=20．00，P〈0．01；χ2=42．68，P〈0．01）。Westernblot检测表明不同浓度多西他赛干预后bcl-2蛋白在LECs中的表达条带均较对照组淡，8．3nmol／L多西他赛组bcl-2蛋白表达降低更为明显。结论多西他赛、盐酸表柔比星和盐酸吡柔比星均可抑制人LECs的增生，而雷替曲塞对人LECs的增生无明显的抑制作用。多西他赛对LECs增生的抑制作用强于其他药物，其作用强度呈浓度和时间依赖性。     

蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子蛋白激酶C信号通路的影响

 目的 观察蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子（Ca2+）蛋白激酶C（PKC）信号通路的影响。方法 体外培养并鉴定人视网膜色素上皮（RPE）细胞,取第4代人RPE细胞随机分组进行实验。采用蛋白免疫印迹法测定培养细胞PKC蛋白表达,检测佛波酯（PMA）和钙磷酸结合蛋白（calphostin C）对PKC活性的影响,确定PMA与calphostin C影响PKC活性的最适宜浓度。采用非放射性核素法测定蓝光照射处理对培养细胞PKC活性的影响。采用20 W,波长450～500 nm医用蓝光灯作为光源,光照强度（2000±500） Lux,照射6 h,24 h后终止培养,以此制造体外培养人RPE细胞光损伤。将培养细胞随机分成5个组,即无光照、单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合calphostin C、光照联合PMA组。其中,无光照组不接受光照;单纯光照组仅接受光照;光照联合硝苯地平组接受光照和0.1 mmol/L的硝苯地平;光照联合calphostin C组接受光照和100.0 nmol/L的calphostin C;光照联合PMA组接受光照和100.0 nmol/L的PMA。用乙酰氧基甲基酯Ca²⁺荧光探针标记各组培养细胞,激光扫描共焦显微镜测定各组细胞内Ca2+浓度。比较各组细胞内Ca2+浓度差异。结果 经鉴定,体外培养人RPE细胞成功。100.0、200.0 nmol/L PMA处理的RPE细胞中PKC蛋白相对表达量高于0.1、1.0、10.0、50.0 nmol/L PMA处理的RPE细胞,差异有统计学意义（F=217.537,P＜0.05）,但100.0、200.0 nmol/L PMA处理组间PKC蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P=0.072）。100.0、200.0 nmol/L calphostin C处理的RPE细胞中PKC蛋白相对表达量低于5.0、25.0、50.0、75.0 nmol/L calphostin C处理的RPE细胞,差异有统计学意义（F=164.543,P＜0.05）,但100.0、200.0 nmol/L calphostin C处理组间PKC蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P=0.385）。蓝光照射处理后,RPE细胞的PKC活性显著升高,与未接受蓝光照射处理的RPE细胞的PKC活性比较,差异有统计学意义（t=-9.869,P＜0.05）。单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合Calphostin C、光照联合PMA组的RPE细胞内Ca²⁺浓度均高于无光照组,差异有统计学意义（F=26 764.92,P＜0.05）;光照联合PMA组RPE细胞内Ca²⁺浓度高于单纯光照、光照联合硝苯地平及光照联合calphostin C组（P＜0.05）,单纯光照组高于光照联合硝苯地平和光照联合calphostin C组（P＜0.05）。结论 蓝光照射后人RPE细胞内PKC活性增高,Ca²⁺浓度增高。硝苯地平和calphostin C均能降低蓝光照射后人RPE细胞内Ca²⁺浓度,PMA增加细胞内Ca²⁺浓度。     

氧化衰老、细胞外基质和光感受器外节膜盘对RPE细胞中黏着斑激酶表达的影响

背景脉络膜新生血管（CNV）是引起视力障碍的重要原因之一，发生机制复杂。黏着斑激酶（FAK）在调控细胞增生、存活、移行和分化等细胞进程中发挥重要作用，参与新生血管的应答。然而，FAK在CNV发生中的作用尚未见相关报道。目的观察氧化衰老、细胞外基质（ECM）成分和吞噬光感受器外节膜盘（POS）等CNV生成相关因素作用下人视网膜色素上皮（RPE）细胞中FAK的表达及磷酸化变化，探讨FAK在CNV发生中的作用。方法体外原代培养来自于供体眼的人RPE细胞，并分别暴露于H2O2氧化衰老、吞噬POS和ECM成分等刺激因素。用10、20、50、100μmol／L4种浓度的H2O2处理培养的RPE细胞20d，诱导RPE细胞氧化衰老；用含终密度1×10^6／mlPOS的培养液培养RPE细胞20d，设置正常细胞对照组、单纯POS处理组、200μmol／LCoCl2缺氧组及POS＋缺氧组；将RPE细胞接种于涂布100mg／L的纤维连接蛋白（FN）、层黏连蛋白（LN）和I型胶原酶的培养皿中，分别继续培养30rain和1h。在不同时间点收集细胞提取总蛋白，Western blot法观察不同时间点RPE细胞中FAK的表达及磷酸化FAK（pFAK）变化。结果20μmol／L及50μamol／LH2O2处理组FAK蛋自在RPE细胞的表达量明显高于对照组，而pFAK在各H2O2处理组均较对照组明显下降，差异均有统计学意义（P〈0．01）。长期吞噬POS后，RPE细胞内出现消化不完全的溶酶体颗粒；单纯POS处理组与对照组间RPE细胞中FAK和pFAK的表达量差异无统计学意义（P〉0．05），但单纯缺氧组FAK和pFAK的表达量较对照组均升高，POS＋缺氧组pFAK的表达较单纯缺氧组显著升高，差异均有统计学意义（P〈O．01）。与对照组比较，在FN、LN和I型胶原刺激后1h，RPE细胞中pFAK表达上调，差异均有统计学意义（P〈0．05，P〈O．01）。结论在衰老、吞噬POS和ECM成分等因素作用下，RPE细胞中出现FAK的表达及磷酸化．提示FAK在CNV发生过程中发挥调控作用。     

全光谱光照对体外培养的人视网膜色素上皮细胞分泌多巴胺功能的影响

目的 探索不同光谱组成的光照射对体外培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞分泌多巴胺功能的影响.方法 实验研究.在细胞培养箱内建立光照系统后,将体外培养的RPE细胞分别放置于无光照（对照组）、全光谱低强度光照、红绿蓝（RGB）光谱低强度光照、全光谱高强度光照、RGB光谱高强度光照环境中进行培养,连续光照24、48 h后进行检测.利用WST-1法检测各处理组之间RPE 细胞增殖率的改变,用高效液相色谱法（HPLC）检测多巴胺分泌水平.用one-way ANOVA对实验数据进行统计学分析.结果 WST-1检测结果显示：连续光照24h后,低强度光照下的全光谱光照与RGB 光谱光照对RPE细胞增殖率的影响差异无统计学意义：而在高强度光照下,全光谱光照组的RPE细胞增殖率低于RGB光谱光照组（P＜0.05）.连续光照48 h后,无论在哪种光照强度下,全光谱光照比RGB光谱光照更能抑制RPE细胞的增殖（P均＜0.01）.HPLC检测结果显示：连续光照24 h后,低强度光照下的全光谱光照与RGB光谱光照相比,对RPE细胞分泌多巴胺功能的影响差异无统计学意义;而在高强度光照下,全光谱光照组的RPE细胞分泌多巴胺的水平高于RGB光谱光照组（P＜0.01）.连续光照48 h后,同一光照强度下,全光谱光照组RPE细胞分泌多巴胺的水平高于RGB光谱光照组（P均＜0.05）.结论 光的光谱组成也是调控RPE细胞分泌多巴胺的重要因素之一,这种调控作用与光照强度和光照时间密切相关.在评估光延缓近视发生发展的作用时应该考虑光的光谱组成.     

组织因子靶向肽对蓝光诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

背景 视网膜光损伤可造成视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤,是影响年龄相关性黄斑变性(AMD)发生和发展的重要因素之一.研究表明,组织因子(TF)在氧化损伤的RPE细胞中和AMD患者的脉络膜新生血管(CNV)中呈高表达,推测抑制TF可预防RPE细胞的损伤以及抑制CNV. 目的 观察TF靶向肽(TF-TP)对蓝光诱导的人RPE细胞损伤的保护作用. 方法 体外分离和培养人RPE细胞并分为空白对照组、蓝光照射组和TF-TP组.空白对照组细胞在常规条件下进行处理;蓝光照射组细胞用辐照强度为(4.0±0.5)mW/cm2的蓝光照射12h建立蓝光损伤细胞模型;TF-TP组先分别用不同浓度(10、100、150、200、300 μmol/L)TF-TP培养细胞24 h,再用蓝光照射12h.采用CCK-8法检测各组细胞的存活率;分别在普通倒置显微镜和透射电子显微镜下观察RPE细胞的形态和超微结构变化;采用Hoechst染色法检测各组细胞的凋亡情况;采用Western blot法检测各组细胞中TF蛋白和相关凋亡蛋白bax和bcl-2的表达.结果 不同浓度TF-TP组间RPE细胞存活率比较,差异无统计学意义(F=2.15,P=0.11).空白对照组、蓝光照射组和150 μmol/L TF-TP组细胞存活率分别为(100.0±0.00)％、(43.79±6.55)％和(63.45±3.57)％,150 μmol/LTF-TP组细胞存活率较蓝光照射组明显增加,差异有统计学意义(P=0.00),以150.μmol/L TF-TP为后续实验的最适浓度.光学显微镜下和透射电子显微镜下显示,蓝光照射组有较多皱缩、变形、悬浮细胞,可见细胞微绒毛数量减少,部分线粒体嵴断裂和缺失以及细胞空泡样变性,而150 μmol/L TF-TP组异常形态的细胞较少,细胞绒毛结构较完整,细胞质中空泡样结构改变和线粒体损伤改变明显减轻.空白对照组、蓝光照射组和150 μmol/L TF-TP组细胞凋亡率分别为(0.98±0.19)％、(9.98±0.82)％和(5.73±0.88)％,组间总体比较差异有统计学差异(F=206.18,P=0.00),其中150 μmol/L TF-TP组细胞凋亡率明显低于蓝光照射组,差异有统计学意义(P＜0.05).与空白对照组相比,蓝光照射组细胞中bax蛋白和TF蛋白的相对表达量明显增加,bcl-2蛋白的相对表达量显著下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与蓝光照射组相比,150 μmol/L TF-TP组细胞中bax蛋白和TF蛋白的相对表达量均明显下降,而bcl-2蛋白的相对表达量明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 TF-TP预处理后可减少蓝光损伤的人RPE细胞的凋亡及增加细胞的存活率,从而对蓝光诱导的人RPE细胞损伤发挥保护作用,其作用机制可能与TF-TP抑制TF介导的bax/bcl-2凋亡通路有关.     

Bevacizumab对体外培养猪视网膜色素上皮细胞的毒性作用

目的研究bevacizumab（avastin）对猪视网膜色素上皮（RPE）细胞的毒性作用,进一步探讨该药物的安全剂量。方法 30只猪眼RPE细胞培养于含质量分数20%胎牛血清的DMEM培养基中,透射电镜下观察细胞内含大量色素,免疫荧光检测抗角蛋白抗原阳性。实验分为对照组（0g/L bevacizumab）和实验组（0.125、0.25、0.5、1.0、1.25、2.0、2.5g/L bevacizumab）。MTT比色法测定不同终质量浓度（0、0.125、0.25、0.5、1.0、1.25、2.0、2.5g/L）bevacizumab对RPE细胞增生的影响;流式细胞术检测bevacizumab作用72h后细胞凋亡和细胞周期的变化,倒置相差显微镜和透射电子显微镜下观察细胞形态和超微结构的改变。结果 2.0~2.5g/L bevacizumab作用72h后,与对照组比较RPE细胞的生长均有明显抑制（t=1.300,P=0.000;t=1.300,P=0.000）,且呈质量浓度依赖性;实验组S期细胞较对照组减少,细胞凋亡率与对照组比较差异无统计学意义（χ2=1.870,P=0.240）。光学显微镜下,2.0g/L bevacizumab组细胞形态无明显变化。透射电子显微镜下,2.0g/L bevacizumab组细胞微绒毛减少,细胞质内出现空泡和髓鞘样变性。结论大剂量bevacizumab可抑制猪眼RPE细胞的有丝分裂,抑制细胞增生,明显破坏细胞的超微结构。     

缺氧条件下共培养时观察Müller细胞对RPE细胞生长的影响

背景 视网膜色素上皮(RPE) 细胞和Müller细胞在维持视网膜的正常代谢中起重要作用,多种生理、病理过程与二者的相互作用有关.目的 利用Transwell小室体外共培养兔Müller细胞与RPE细胞,观察缺氧条件下Müller细胞对RPE细胞增生和迁移的影响.方法 应用组织块培养法和酶消化法分别培养原代兔Müller细胞和RPE细胞,免疫组织化学法鉴定2种细胞.取第3代培养良好的细胞进行试验.应用CoCl2培养细胞以建立细胞化学缺氧模型,分为常氧组和缺氧组,每组又分为对照组(RPE细胞单独培养)、共培养组(Müller细胞与RPE细胞共同培养).利用Transwell小室建立Müller细胞和RPE细胞的共培养模型,各组分别培养3、6、24、48h,利用MTT法和结晶紫染色法对培养存活的RPE细胞进行计数,检测常氧及缺氧条件下Müller细胞对RPE细胞增生和迁移的影响.结果 原代培养的RPE细胞符合RPE细胞的特征,90%以上呈现CK-18阳性反应.培养的Müller细胞对胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S-100染色呈阳性反应.与常氧培养条件比较,缺氧条件下单独培养的RPE细胞增生数量增加,细胞迁移数量增加,差异有统计学意义(P＜0.01);缺氧条件下与Müller细胞共培养的RPE细胞增生数量和迁移数量明显增加,与常氧组和单细胞培养情况下比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).缺氧条件下,与RPE细胞单细胞培养组比较,共培养组RPE细胞的增生和迁移增加,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 缺氧可以促进RPE细胞的增生和迁移,Müller细胞可以加重缺氧引起的RPE细胞的增生和迁移.

Abstract：

Background More and more evidences suggest that the interaction of retinal progression of retinal diseases.Objective Present study was to investigate the primarily cultured and digested using explant culture method and trypsas acidic protein(GFAP) staining,S-100 staining and cytokine-18 staining co-cultured under the normoxia and hypoxia using transwell chamber,and the proliferation and migration of cultured RPE cells were examined using MTT and compared with only RPE cells cultured group at 3, 6, 24 and 48 hours.Results Over 90% of primarily cultured RPE cells showed the positive response for S-100.The proliferation and migration of RPE cells were significantly increased in hypoxia condition compared with normoxia condition (P＜0.01).In hypoxia group,amount of proliferation and migration of RPE cells in co-culture group were higher than the only RPE cells cultured group(P＜0.01).Conclusion Hypoxia appear to aggravate the proliferation and migration of RPE cells under the hypoxia status.     

原花青素对氧化应激人眼小梁网细胞凋亡及细胞色素C释放的影响

目的 研究原花青素对H2O2诱导人眼小梁网细胞(human trabecular meshwork cells,HTMC)凋亡及细胞色素C释放的影响.方法 将HTMC进行传代后随机分为5组.未处理组:正常培养的HTMC;对照组:正常培养的HTMC+H2O2(500μmol·L-1处理lh);3个浓度的原花青素组:正常培养的HTMC+H2O2(500 μmol· L-1处理lh)+原花青素(浓度分别为0.02 g·L-1、0.05 g·L-1、0.10g·L-1).使用Annexin V-FITC检测细胞凋亡情况,Western blot检测HTMC胞浆细胞色素C含量.结果 与未处理组相比,对照组及各原花青素组细胞凋亡率均升高,差异均有统计学意义(均为P＜0.01).与对照组相比,各原花青素组细胞凋亡率均降低,差异均有统计学意义(均为P＜0.01);不同浓度原花青素组间随原花青素浓度增加细胞凋亡率下降,各原花青素组间差异均有统计学意义(均为P＜0.01).与未处理组相比,对照组以及0.02 g·L-1和0.05 g· L-1原花青素组细胞色素C的释放均增加,差异均有统计学意义(均为P＜0.01);而0.10 g·L-1原花青素组与未处理组相比,差异无统计学意义(P＞0.05).与对照组相比,各原花青素组细胞色素C释放均减少,差异均有统计学意义(均为P＜0.01).不同浓度原花青素组间随原花青素浓度增加细胞色素C的释放减少,各组间差异均有统计学意义(均为P＜0.01).结论 外源性原花青素可以降低氧化应激HTMC的凋亡率,减少细胞色素C的释放,有较强的抗氧化作用,并在一定浓度范围内随着浓度的增加其抗氧化作用逐渐增强.