大鼠骨髓基质干细胞体外分离、纯化、培养的实验研究

目的：探讨Wistar大鼠骨髓基质干细胞（ BMSCs）体外分离、纯化、培养的方法。方法对5周龄Wistar大鼠予1%戊巴比妥钠（0.006 ml/g）行腹腔麻醉,成功后于大鼠双侧后肢股骨、胫骨提取BMSCs,用贴壁培养法分离、纯化、培养BMSCs,观察细胞形态变化及绘制细胞生长曲线了解其生长、传代、扩增特性,并应用流式细胞仪检测细胞表面标志物行细胞鉴定。结果应用贴壁培养法分离、纯化、培养的大鼠BMSCs增殖迅速、生长曲线良好,经细胞表面标志物检测证实为BMSCs,且细胞具有很好的均一性（96.36%）。结论贴壁培养法能够很好地分离、纯化、培养大鼠BMSCs,并且获得的细胞具有很强的增殖能力,取第3~6代细胞用于实验研究最为合适。     

骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展

骨髓基质干细胞具有取材简单、增殖速度快、培养过程中始终保持多向分化的潜能等特点,已经成为干细胞研究领域的热点,是最好的组织工程种子细胞之一,还可以诱导分化为神经细胞。本文对骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展作一综述。     

骨髓基质干细胞分化为神经细胞的研究进展

骨髓基质干细胞具有广泛的分化能力,近年来发现其可以分化为神经元样细胞,且经不同因素诱导,可以分化为特殊的神经元表型,如多巴胺能神经元、5-HT敏感神经元等。其分化机制尚未明确,可能是通过独立的调节机制控制,且受神经特异性基因的表达数量调控,其中Sox、Pax、Notch等基因在其分化中起重要作用。尤其是RB/PBO基因更为重要,而RB基因则触发胆碱能神经分化。外源性因素如cAMP浓度等也有一定的影响。骨髓基质干细胞对神经退行性疾病的治疗作用已经得到证实,因其具有取材容易,分离、培养、扩增方法成熟,且不存在伦理学和免疫排斥问题,临床应用前景广阔。     

成人骨髓基质干细胞体外诱导成骨细胞

目的建立成人骨髓基质干细胞(BMSCs)分离、扩增以及诱导和分化为成骨细胞的体外培养方法,为骨组织工程选择理想的种子细胞来源。方法抽取健康成人骨髓组织,用Percoll分离液分离出骨髓中的单个核细胞,在含体积分数为10％小牛血清的高糖：DMEM培养液中,置于37℃、含体积分数为5％的CO2湿化空气孵箱中培养,通过传代培养扩增BMSCs,传三代时改用含地塞米松、β-甘油磷酸和维生素C的条件培养基培养,用倒置显微镜、HE染色观察增殖和分化情况,并测定碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力。结果体外培养的成骨细胞生长良好,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性。结论所建立的成人BMSCs分离、扩增以及诱导和分化为成骨细胞的体外培养方法稳定和实用,可作为骨组织工程种子细胞来源的常规方法之一。     

蛇床子素对体外培养骨髓基质干细胞增殖与成骨性分化的影响

目的研究蛇床子素对体外培养大鼠骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)增殖与成骨性分化的影响。方法取大鼠股骨及胫骨全骨髓,利用全骨髓培养法培养单核层细胞,培养于含10%FBS的DMEM-F12培养液中,3d后首次换液,9d后传代培养。培养基中蛇床子素终浓度分别为1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mol·L-1。增殖分析采用MTT法,于成骨性诱导培养d4、8、12、16测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量,d15进行钙化结节组织化学染色及计数。成骨性诱导后不同时间点提取Total RNA,RTReal-Time PCR法检测bFGF、IGF-1、Osterix与Runx-2的基因表达情况。结果蛇床子素剂量依赖性抑制BMSCs增殖,但能明显促进其向成骨性分化,表现为提高BMSCs的ALP活性、促进骨钙素分泌、钙盐沉积量、增加钙化结节数量、提高bFGF、IGF-1、Osterix和Runx-2的mRNA表达水平。结论终浓度为1×10-5mol·L-1蛇床子素能明显促进BMSCs的成骨性分化,证明蛇床子素是中药蛇床子抗骨质疏松的有效成分。     

自体骨髓基质干细胞治疗骨缺损的初步实验研究

目的 探讨自体骨髓基质干细胞修复兔桡骨远端骨缺损的可行性。方法 取兔髂骨骨髓，体外分离培养扩增骨髓基质干细胞，与生物材料混合后植入体内修复兔桡骨远端骨缺损。结果 12周后X片、大体标本、组织切片均显示缺损处有新骨形成。结论 自体骨髓基质干细胞移植是修复兔桡骨远端骨缺损的理想方法。     

人骨髓基质干细胞向神经元分化的实验方法改进

目的 改进人骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化的方法,使诱导分化后的神经元样细胞存活时间延长,为其将来可能的临床应用提供理论基础。方法 采用Percoll液分离成人骨髓基质干细胞(hBMSCs),体外扩增,流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达．应用丁羟茴醚(BHA)和二甲基亚砜(DMSO),NT-3和PDGF定向诱导hBMSCs分化为神经元样细胞。结果 hBMSCs在体外扩增后,流式细胞检测结果显示CD29、CD44表达阳性,CD11b、CD45表达阴性;加入诱导剂一定时间后,细胞形态发生改变,同时神经丝蛋白表达阳性,胶质纤维酸性蛋白表达阳性。结论 成人骨髓基质干细胞在体外可分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞,而且较单独使用BHA DMSO诱导的方法延长了诱导后的细胞存活时间。     

大鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化的体外诱导动态观察

目的 动态观察体外定向诱导大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)分化为神经细胞的时程变化。方法 采用Percoll-Paque液(1．073g／ml)分离BMSCs体外扩增培养后，加入丁羟茴醚 二甲基亚砜诱导其分化为神经细胞，分别于1、2、3、4h后光镜下观察形态变化及通过免疫组化和免疫荧光染色测定特异性神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞数。结果 BMSCs在加入诱导剂后1h出现胞体收缩，突起伸出，有不同程度NSE、NF、GFAP表达，3h后汰高峰。结论 丁羟茼醚 二甲基亚砜在一定时间内是一种较好的体外诱导剂。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养、扩增与鉴定

目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离及培养的方法,探讨体外培养MSCs的生物学特性.方法:采用密度梯度离心法和贴壁筛选法纯化MSCs,镜下连续观察细胞的形态变化.流式细胞仪鉴定其表面抗原CD29、CD34、CD44和CD45的表达情况.结果:原代MSCs呈集落状生长,细胞呈梭形、纺锤形,呈放射状排列.传代后大都均匀分布生长,细胞生长迅速,倍增时间约45.5 h.流式细胞术鉴定表明,培养的第3代和第5代MSCs CD44、CD29阳性,CD45和CD34阴性.结论:采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法可成功分离和培养大鼠的骨髓MSCs,MSCs可以作为组织工程中种子细胞的来源.     

SD大鼠骨髓基质细胞体外培养及分化研究

目的 研究SD大鼠骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)的生物学特性及其成骨和成脂分化能力.方法 处死16只6月龄SD大鼠动物,非连续密度梯度离心分离大鼠MSCs,传代后分别在成骨及成脂培养基中诱导培养14天,观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,通过组织特染对MSCs的成骨,成脂表型进行鉴定,计数阳性染色细胞百分比.结果 SD大鼠MSCs在体外具有成骨细胞分化潜力,油红0染色显示成脂诱导培养基可定向诱导其分化.结论 本实验成功分离SD大鼠MSCs且保持分化能力.     

应用密度梯度离心法分离扩增兔骨髓基质细胞的体会

目的探讨密度梯度离心法分离培养兔骨髓基质干细胞(BMSc)的条件,为组织工程学选择合适的种子细胞奠定基础。方法采用密度梯度离心法将兔BMSc自小量骨髓中分离并培养,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线,测定分裂指数和贴壁率。结果兔．BMSc在第7代前性状稳定,生长曲线相似;第4天分裂指数最高为15％;传代后10h贴壁率高达90％。结论密度梯度离心法是分离兔BMSc的理想方法,BMSc能为未来组织工程提供足量种子细胞。     

骨髓基质细胞在不同载体表面生长碱性磷酸酶活性的表达

目的研究骨髓基质细胞在牙骨质和骨片表面生长ALP活性的表达情况。方法将骨髓基质细胞与牙骨质片和股骨片在体外共同培养,分别在第7天、第28天进行光镜观察及碱性磷酸酶的测定。结果骨髓基质细胞在牙骨质片和骨片表面生长,两组均有ALP的表达,牙骨质组较弱。结论结果表达在体外矿化液培养条件下,骨髓基质细胞在牙骨质和骨片表面生长附着良好,可向成骨样细胞转化。     

阿伦磷酸钠对小鼠骨髓基质细胞成骨和成脂分化的影响

目的在离体条件下研究阿伦磷酸钠对小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)成骨和成脂分化的影响。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测阿伦磷酸钠对骨髓基质细胞增殖的影响,碱性磷酸酶(ALP)活性测定法检测阿伦磷酸钠对骨髓基质细胞(MSCs)成骨分化的影响,油红O染色形态学及定量测定法检测阿伦磷酸钠对骨髓基质细胞成脂分化的影响。结果1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6和1×10-5mol.L-1的阿伦磷酸钠可以促进小鼠原代骨髓基质细胞增殖,抑制骨髓基质细胞的成骨分化及成脂分化。结论阿伦磷酸钠对骨质疏松症的预防和治疗作用可能通过抑制骨髓基质细胞的成脂分化,进而减少脂肪细胞细胞因子的分泌而抑制破骨细胞的形成、激活以及骨吸收功能。     

大鼠神经干细胞的分离培养和分化鉴定

目的建立神经干细胞分离、培养和分化鉴定技术。观察神经干细胞生长、增殖特点。方法利用无血清培养,从胚胎大鼠海马、纹状体等区分离神经干细胞,进行体外扩增培养、传代观察。采用荧光免疫细胞化学检测技术,观察鉴定神经干细胞及其分化结果。结果从胚胎大鼠海马、纹状体等区分离的细胞具有增殖能力,可进行传代培养,获得的细胞克隆中有巢蛋白(nestin)表达阳性细胞,显微镜下观察见典型的干细胞特征。分化为3种神经细胞类型:神经元、胶质细胞、少突胶质细胞。结论用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,通过鉴定确为神经干细胞,并经过分化鉴定确认。     

hBMSCs向神经细胞分化前后表达神经生长因子变化的实验研究

目的:检测人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向神经细胞诱导分化前后培养液上清中神经生长因子(NGF)含量的变化,探讨BMSCs移植作用机制。方法:从健康志原者髂骨处抽取骨髓5 mL,体外分离、培养、扩增后用400 ng/L音猬分子(SHH)、0.5μmol维甲酸(RA)和5μmol Forskolin(Fn)组成的诱导体系进行诱导。使用ELISA法检测1 d,3 d,5 d,7 d的hBMSCs培养液上清中NGF的浓度,并且对比诱导前(12 h,1 d,3 d)后(12 h,1 d,3 d)的上清液中该物质浓度的变化。结果:hBMSCs培养液中含有NGF,随培养时间的延长,培养液中NGF的浓度增加;hBMSCs后期诱导液中也含有NGF,且诱导后各时间点浓度均明显高于诱导前(P<0.01)。结论:hBMSCs在贴壁培养以及向神经细胞诱导分化过程中,均可向外分泌NGF等神经营养因子,且诱导后分泌量明显增加。     

脂多糖对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的观察不同浓度脂多糖(LPS)对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的影响,并探讨其可能的机制。方法应用全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠BMSCs,采用免疫细胞化学法鉴定其表面标志。将BMSCs分为对照组及不同浓度LPS干预组,采用噻唑蓝(MTT)比色法观察其增殖情况。结果采用全骨髓贴壁法获取的BMSCs形态呈长梭形,呈集落样生长,免疫细胞化学鉴定,CD44阳性,CD34、CD45阴性。MTT检测结果显示,与对照组(0.190±0.037)相比,0.01、0.1及1μg/mlLPS干预组吸光度(A)值均增高,其中0.01μg/mlLPS干预组(0.253±0.030)增高明显,差异有统计学意义(P<0.05)。而10、100μg/mlLPS干预组A值则较对照组下降,其中10μg/mlLPS干预组(0.159±0.042)明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论低浓度LPS可以提高BMSCs的增殖能力,但随着LPS浓度的增大,BMSCs增殖能力反而下降。     

Caffeine inhibits adipogenic differentiation of primary adipose-derived stem cells and bone marrow stromal cells

Caffeine consumption has been related to loss of body weight and modulates lipid metabolism. However, impacts of caffeine on adipogenic differentiation have not been well determined yet. The present study evaluated the effects of caffeine on adipogenesis using primary rat adipose-derived stem cells (ADSCs) and a mouse bone marrow stromal cell line (M2-10B4) in vitro. ADSCs and M2-10B4 were continuously exposed to caffeine (0.1–1 mM) during adipogenic differentiation for 7 and 12 days, respectively. Oil red O and Nile red staining showed that caffeine reduced lipid droplet and adipocyte levels in both cell types. In addition, Nile red staining and FACScan flow cytometry showed that caffeine dose-dependently decreased adipocyte differentiation from 20% to 50% of the control ADSCs and M2-10B4 cells. Caffeine decreased the expression of adipogenesis-related genes including peroxisome proliferator-activated receptor-γ, CCAAT/enhancer-binding protein-α, adipocyte lipid binding protein, lipoprotein lipase, leptin, and TNFα in a dose-dependent manner. Rather, low concentration of caffeine (0.1 mM) significantly increased IL-6 expression, but unexpectedly inhibited that at a concentration more than 0.3 mM. Taken together, caffeine was able to effectively inhibit adipogenic differentiation of ADSCs and M2-10B4 cells partly through its inhibition of adipogenesis-related factors.