肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合菌苗研究进展

肺炎球菌荚膜多糖－蛋白结合菌苗是由肺炎球菌荚膜多糖抗原与蛋白载体通过化学方法制备的菌苗,它是在肺炎球菌荚膜多糖菌苗的基础上发展起来的新型菌苗,主要用于解决多糖菌苗不能诱导免疫记忆以及对２岁以下的儿童不能引起有效免疫应答的问题。本文对其研究进展进行了简要综述。     

肺炎球菌外膜蛋白A的分离纯化及免疫原性

培养肺炎球菌FY06，采用表面活性剂从菌泥抽提外膜蛋白，依次用硫酸铵盐析法和DEAE-纤维素离子交换法对肺炎球菌外膜蛋白进行分离和纯化。免疫原性实验表明：所制备的外膜蛋白A具有优良的免疫原性，对5种血清型肺炎球菌均有较广泛的交叉免疫效果。可作为新．代的肺炎球菌疫苗成分。     

B群链球菌荚膜多糖抗原的分离纯化工艺研究

目的为提高荚膜多糖抗原得率,降低荚膜多糖中残余蛋白质含量和核酸含量,提高荚膜多糖抗原纯度,优化B群链球菌荚膜多糖的提取纯化工艺条件。方法研究pH值,沉淀核酸和荚膜多糖的乙醇浓度,乙醇沉淀多糖所需的温度和时间;比较蛋白酶K法、Sevag法和冷酚抽提法去除荚膜多糖中杂蛋白质的效果。结果建立起25%乙醇沉淀去核酸,冷酚抽提法去蛋白质分离纯化荚膜多糖,55%乙醇沉淀多糖的方法。3批GBSⅢ发酵液中获得的荚膜多糖的唾液酸含量为12.4%~14.8%;分配系数(Kav)≤0.5的多糖回收率达90%以上;荚膜多糖得率为0.021~0.027 g/L,抗原纯度较高。结论从发酵液中提取纯化荚膜多糖抗原的工艺是可行有效的。     

Triton X-114萃取法纯化b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的应用

采用Triton X-114替代高腐蚀性的苯酚,以探索b型流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzaetype b,Hib）荚膜多糖的纯化新方法。将Hib粗制荚膜多糖溶于不同浓度的Triton X-114溶液中,加入（NH₄）₂SO₄,搅拌后,离心分层后,取下层溶液。重复多次,最后用100 k D膜进行超滤。结果,加入Triton X-114的质量分数为15%,（NH₄）₂SO₄的质量分数为30%,抽提次数为3次时,对蛋白杂质的去除效果较好。采用Triton X-114萃取法连续纯化3批Hib荚膜精制多糖,其各项检测指标均符合《中国药典》2015版（三部）规定。研究表明Triton X-114萃取法可应用于Hib粗制荚膜多糖的纯化,且纯化效果良好。     

7价肺炎球菌荚膜多糖-CRM197结合疫苗中各血清型免疫原性的明显差异

肺炎球菌荚膜多糖(PnPS)能在较大儿童、成人和动物体内诱生抗体，但其属胸腺非依赖性抗原，不能诱导免疫记忆，对两岁以下的婴幼儿不能诱生保护性水平的抗体。将多价PS与蛋白载体结合而形成的结合疫苗不仅可在婴幼儿中诱生保护性水平的抗体，而且能对PS产生免疫记忆。尽管7价Pn结合疫苗中的各型PS都共价结合在同一蛋白载体上，但各型的免疫原性却差异明显。作者通过试验探讨了引起这种免疫原性不同的原因。     

5型肺炎球菌结合物原液中游离多糖分离方法的建立及验证

目的:建立和验证有效分离5型肺炎球菌结合物原液(结合物原液)中游离多糖的方法,以供测定游离多糖含量。方法:通过游离多糖添加回收率试验以及氯化钠浓度对咔唑-硫酸法吸光度值影响试验,选择结合物原液中游离多糖和多糖-蛋白结合物分离时最佳的氯化钠浓度;通过蛋白回收率试验筛选出该条件下所能沉降蛋白质的浓度范围;比较标准曲线经脱氧...     

19F型肺炎球菌荚膜多糖与载体蛋白P64K结合物的制备及免疫原性

目的:采用改良胺化还原法,重组B群脑膜炎球菌外膜蛋白(rP64K)作为载体蛋白,制备19F型肺炎球菌荚膜多糖(PN19F)结合物。方法:在胺化还原法的基础上,以1,6-己二酰肼(ADH)为分子臂,在碳二亚胺(EDAC)作用下衍化rP64K,蛋白衍化后再与多糖上的醛基反应,形成共轭结合。采用HPLC、电泳、免疫印迹等方法分析结合物,并将获得的结合物免疫NIH小鼠,用ELISA方法检测多糖IgG水平。结果:电泳和免疫印迹证明了结合物制备成功。动物免疫产生了高滴度的抗PN19F的抗体,并有免疫记忆发生。结论:新的结合方法和新的载体蛋白能有效提高结合效率,以本工艺制备PN19F蛋白结合疫苗是可行的。     

肺炎球菌无动物源性成分培养工艺及纯化新工艺探索

目的:比较无动物源性成分培养基和动物源性培养基培养肺炎球菌的差异;摸索不使用有机溶剂的肺炎球菌多糖纯化新工艺。方法:用无动物源性的原料替代肺炎发酵培养基中动物源性的成分,考察菌体密度和多糖收量的变化;采用柱层析纯化工艺收获肺炎球菌多糖,测定各阶段核酸、蛋白、多糖含量。结果:与疫苗生产所采用动物源性发酵培养基相比,无动物源性发酵培养基收获的1,7F,19A型菌体密度分别提高了1倍左右;发酵液中多糖含量分别提高了48%,50%和200%;多糖收量提高了30%～90%。纯化新工艺收获的17F,18C,19F精糖,核酸和蛋白的含量均远远低于企业的注册标准,HPLC检测多糖纯度分别为99.24%,98.92%和99.02%。结论:无动物源性成分发酵培养基适合于肺炎球菌生长,不仅增加了多糖产量,也提高疫苗的安全性;纯化新工艺能够收获合格的肺炎精制多糖。     

实验性肺炎球菌荚膜多糖-辅助性T淋巴细胞表位结合疫苗的研制

为了讨论小分子合成肽能否替代大分子细菌蛋白用于疫苗制备，美国Epimmune公司Alexander等将含13个氨基酸的全人白细胞抗原（HLA）-同向重复（DR）表位（PADRE）与肺炎球菌荚膜多糖（PS）结合制成糖结合疫苗（PADRE-PS），评估了PADRE作为糖结合疫苗蛋白载体的可能性。     

8型肺炎球菌荚膜多糖分子大小对结合效果及结合物抗原性的影响

目的评价8型肺炎球菌荚膜多糖(capsular polysaccharide ofStreptococcus pneumoniae type 8, CPS8)分子大小对多糖蛋白结合物物理化学(理化)性质的影响, 并对结合效果最优的多糖蛋白结合物进行抗原一致性评价。方法采用高压均质法制备不同分子大小的CPS8;采用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯活化法, 制备以白喉类毒素无毒突变体CRM197为载体的CPS8蛋白结合物CPS8-CRM197, 并检定其理化性质;采用核磁共振氢谱及核磁共振碳谱分析降解前后多糖糖链结构的变化情况, 同时采用抑制ELISA评价CPS8-CRM197结合物的抗原一致性。结果高压均质法制备的CPS8相对分子质量在69 000～268 000;CPS8相对分子质量>200 000时会过度交联, <100 000时结合效果较差;CPS8在相对分子质量100 000～200 000之间的CPS8-CRM197结合物游离多糖含量均<10%, 游离蛋白含量均<5%。核磁共振氢谱及核磁共振碳谱结果表明, 降解前后多糖糖链结构未发生改变, 特异基团得...     

19A型肺炎链球菌多糖结合物中游离多糖含量测定方法的建立

目的 建立19A型肺炎链球菌多糖(Streptococcus pneumoniae type 19A polysaccharide,19APS)结合物中游离PS含量的测定方法.方法 在一定条件下分别用1、3和5 g/L脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,DOC)溶液(pH7.3)沉淀不同浓度的破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT),确定不同浓度DOC沉淀载体蛋白TT的浓度范围.以1 g/L DOC分离结合19 APS(19APS-TT)和游离19APS,测定上清液中的游离PS含量,并验证该DOC沉淀法的准确度和精密度.结果 分别以1和3 g/L DOC沉淀19APS-TT时,TT浓度最好分别控制在＜150和＜200μg/ml.该DOC沉淀法的准确度和精密度均良好,加标PS回收率为94.0％～107.2％,相对标准偏差均＜4％.结论 成功建立了19APS-TT中游离PS含量的测定方法.     

CDAP活化多糖制备1型肺炎链球菌荚膜多糖-蛋白结合物原液的稳定性评价

目的 评价以1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐(1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化多糖制备的1型肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物原液的稳定性.方法 以CDAP作为活化剂,连续制备3批多糖-蛋白结合物原液,分别放置于(37±2)℃和2～8℃,定期取样检测,并评价其稳定性.结果 多糖-蛋白结合物原液在(37±2)℃条件下保存21 d,2～8℃条件下保存12个月,其主要检测指标均符合质量要求,游离多糖和游离蛋白含量分别低于30.0％和5.0％,分配系数≤0.35的多糖回收率均＞65％.结论 确定了不同条件下1型肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物原液的有效保存时间.     

大孔吸附树脂纯化黄芪多糖工艺的研究

目的：探讨柱层吸附法纯化黄芪多糖,并进行工艺优化。方法：采用阳离子交换树脂,大孔吸附树脂,聚酰胺等对黄芪多糖进行柱层析纯化,比较纯化结果。结果：阳离子交换树脂对黄芪多糖几乎没有纯化作用,大孔吸附树脂和聚酰胺的纯化作用明显,并对大孔吸附树脂纯化法进行工艺优化。结论：采用大孔吸附树脂进行黄芪多糖的纯化,效果较好。     

14型肺炎球菌多糖双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的  建立并验证测定14型肺炎球菌多糖（pneumococcal capsular polysaccharide serotype 14,PS14）浓度的双抗体夹心ELISA。方法  采用Protein G亲和层析纯化兔血清,得到兔抗PS14多克隆抗体（多抗）。以鼠抗PS14单克隆抗体（单抗）为捕获抗体,兔抗PS14多抗为检测抗体,碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG为二抗,PS14为参考品建立双抗体夹心ELISA法。确定鼠抗PS14单抗和兔抗PS14多抗的工作浓度,建立标准曲线,并验证该方法的准确性、精密度和特异性,考察佐剂对该方法的影响。结果  鼠抗PS14单抗的最适工作浓度为5 μg/ml,兔抗PS14多抗的最适工作浓度为1 μg/ml,标准曲线的范围为9.375 ~ 600.000 ng/ml,线性良好,相关系数为0.999。测定多糖样品的PS14回收率为110% ~ 140%,多糖蛋白结合物样品的PS14回收率为90% ~110%。平均批内和批间精密度分别是5.64%和7.14%。13价结合物混合样品的PS14回收率为85% ~100%;含有佐剂的疫苗样品的PS14回收率为85% ~110%。结论  成功建立了双抗体夹心ELISA法,该方法准确性、精密度、特异性良好,且检测结果不受佐剂的影响,具有一定耐用性。     

苦瓜多糖提取工艺的考察与优化

目的考察不同实验影响因素,选择合理的实验条件,研究苦瓜多糖提取的新工艺。方法以浸提的温度、水料比与加热时间等作为考察因素,以苦瓜多糖提取率为指标,建立适当数学模型,筛选并确定最优的提取条件。结果影响苦瓜多糖提取的因素顺序为:浸提时间、水料比、浸提温度。优化最佳提取条件为:浸提时间1 h、水料比10∶1、浸提温度80℃,该条件下苦瓜多糖的提取率为3.3%,多糖含量为23.2%。结论运用酶解法从苦瓜浆中提取苦瓜多糖具有可行性,也为苦瓜多糖提取工艺优化的探索提供了一些新的依据。     

菌种筛选对1型肺炎链球菌产糖量的影响

 目的  用无动物源性培养基筛选高产糖1型肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae serotype 1,PN1）。方法  配制无动物源性培养基,并用此培养基进行高产糖PN1单菌落筛选。比较筛选前后PN1在发酵培养中的产糖量。 结果   无动物源性培养基筛选前后PN1在发酵培养中的产糖量分别为420和960 mg/L,筛选后PN1的产糖量明显高于筛选前PN1。 结论   以无动物源性培养基筛选PN1可使PN1的产糖量明显提高。     

伤寒Vi精制多糖分子大小测定中层析-比色法优化和层析-积分法比较

目的 优化层析-比色法,并对该方法进行分析方法验证;比较优化层析-比色法和层析-积分法,评价两方法测定伤寒Vi精制多糖分子大小的适用性。方法 优化比色法O-乙酰基标准曲线浓度范围,对该方法进行准确度、重复性、中间精密度、线性和耐用性的验证;应用优化层析-比色法和层析-积分法检测多批次伤寒Vi精制多糖分子大小,对结果进行统计学分析。结果 优化层析-比色法准确度回收率均为100%;样品的重复性相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）分别为2.4%和0.0%,中间精密度RSD均为3.4%,连续5次测定标准曲线,决定系数均大于0.999 0,耐用性RSD为4.6%。优化层析-比色法和层析-积分法在检测伤寒Vi精制多糖分子大小时,差异无统计学意义（t=-1.372,P＞0.05）。结论  优化的比色法具有良好的准确度、重复性、中间精密度、线性和耐用性,两种方法均可用于检测伤寒Vi精制多糖分子大小。