低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞和肺微血管内皮细胞表达及分泌fractalkine的影响

目的 观察低氧对培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞和肺微血管内皮细胞表达及分泌fractalkine（FKN）的影响。 方法 低氧处理体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞和肺微血管内皮细胞12 h、24 h和48 h,采用原位杂交和免疫组化法检测细胞中FKN mRNA和蛋白的表达,酶联免疫法检测细胞上清液中FKN的浓度。 结果 ①与对照组比较,大鼠肺动脉平滑肌细胞在低氧处理12 h后,其FKN mRNA和蛋白表达、细胞上清液中FKN浓度无明显变化（P>0.05）,低氧24 h后FKN mRNA和蛋白表达、细胞上清液中FKN浓度均增加（P<0.05）,48 h后其增加则更加明显（P<0.01）。②大鼠肺微血管内皮细胞在低氧处理12 h、24 h和48 h后,其FKN mRNA和蛋白表达及细胞上清液中FKN浓度与对照组比较均无明显变化（P>0.05）。 结论 低氧刺激增加了大鼠肺动脉平滑肌细胞表达和分泌FKN。     

LPS对培养大鼠肺微血管内皮细胞AQP-1表达的影响

目的通过观察脂多糖(LPS)刺激下对肺微血管内皮细胞水通道蛋白-1(AQP-1)表达的影响,为进一步研究急性肺损伤时肺水异常代谢的机制提供实验依据.方法采用体外培养的大鼠肺微血管内皮细胞,使用浓度为100ng、1、10 μg/ml的LPS与之孵育2、4、6、8 h,应用免疫细胞化学方法以及RT-PCR法检测AQP-1的表达.结果LPS刺激组AQP-1表达显著低于正常对照组(P＜0.01);AQP-1表达下降与LPS刺激浓度有关.结论LPS刺激下AQP-1表达下降,提示AQP-1在急性肺损伤时可能与肺水代谢异常有关.     

百草枯诱导大鼠肺微血管内皮细胞凋亡实验研究

目的探讨百草枯（PQ）对大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）的直接毒性和能否诱导大鼠PMVECs的凋亡。方法雄性SD大鼠PMVECs的原代培养和鉴定。培养的大鼠PMVECs在不同浓度PQ的培养基中培养不同时间,通过MTT法、琼脂糖凝胶电泳、DAPI染色、流式细胞术来检测PQ对人鼠PMVECs的毒性和凋亡的影响。结果成功地培养出大鼠PMVECs。MTT法测试发现PQ对大鼠PMVECs的增殖代谢活性具有剂量和时间依赖性的抑制作用;琼脂糖凝胶电泳显示凋亡的DNA阶梯;通过形态学观察,发现细胞凋亡的特征如核固缩、核碎裂;流式细胞术揭示凋亡峰出现。结论PQ在体外对大鼠PMVECs的增殖具有抑制作用并能诱导其凋亡;PMVECs凋亡可能是PQ所致的急性肺损伤的机制之一。     

TNF-α下调大鼠肺微血管内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5的表达

目的 研究肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）对大鼠肺微血管内皮细胞紧密连接蛋白1（zonula occludens-1,ZO-1）、Claudin-5表达的影响,探讨TNF-α对大鼠肺血管屏障的损伤机制。方法 将体外培养的大鼠肺微血管内皮细胞分为对照组、TNF-α 24 h、48 h和72 h组（TNF-α 10 mg/L）。透射电镜观察大鼠肺微血管内皮细胞超微结构。MTT法及流式细胞仪分别测定各组细胞的增殖抑制率及凋亡率。免疫荧光法测定ZO-1及Claudin-5的分布。RT-qPCR及Western blot测定各组细胞ZO-1及Claudin-5的mRNA及蛋白表达。结果 对照组内皮细胞含有大量的线粒体及内质网等结构,结构正常。TNF-α各组细胞线粒体数量减少,线粒体肿胀,嵴溶解,核固缩,凋亡细胞增多,细胞增殖抑制率及凋亡率较对照组增加（均P<0.05）,呈时间依赖性。ZO-1及Claudin-5呈线状荧光分布于内皮细胞间连接部位。与对照组比较,TNF-α各组细胞ZO-1的转录及表达水平均降低（均P<0.05）。TNF-α各组Claudin-5的转录水平较对照组明显降低（均P<0.05）,TNF-α 48 h、72 h组Claudin-5的蛋白表达水平较对照组降低（均P<0.05）,TNF-α 24 h组与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 TNF-α下调大鼠微血管内皮细胞ZO-1及Claudin-5的表达,诱导细胞损伤及凋亡,破坏肺屏障,导致肺损伤。     

大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养

目的探讨一种分离和培养大鼠肺微血管内皮细胞(LMVEC)的简单方法。方法组织贴块法培养大鼠LMVEC,倒置显微镜下观察细胞的形态和生长特性,并采用免疫组化方法进行鉴定。结果获得的LMVEC具有规律的铺路石镶嵌状排列,内皮细胞特异性抗体CD31免疫组化染色阳性。结论组织贴块法培养LMVEC是简单可行的。     

肝细胞生长因子对缺氧损伤的肺微血管内皮细胞的保护作用

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)对缺氧损伤的人肺微血管内皮细胞(HPMECs)的保护作用,提高肺血管内皮细胞对缺氧的耐受性,增加损伤后的存活率,改善其功能,为防止缺氧导致的肺动脉高压提供实验依据。方法体外培养HPMECs,用物理方法建立缺氧损伤模型。实验分为空白对照组、缺氧损伤组、HGF组、PHA665752组(HGF抑制剂组)。采用免疫荧光法鉴定第7代HPMECs,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率,倒置显微镜下计数在不同干扰条件下HPMECs的贴壁细胞数量,Western blot法检测细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达情况。结果缺氧损伤组细胞贴壁率下降,ICAM-1的表达量明显高于空白对照组(P<0.01);HGF组细胞存活率较缺氧损伤组明显提高(P<0.01),细胞贴壁率较缺氧损伤组明显增加(P<0.01),ICAM-1的表达量明显下降(P<0.01);PHA组细胞存活率较缺氧损伤组和HGF组均有明显差异(P<0.01),细胞贴壁率较缺氧损伤组明显下降(P<0.01),ICAM-1的表达明显上升(P<0.01)。结论 HGF可能是通过增加HPMECs的存活率、提高体外培养时细胞的贴壁率、减少ICAM-1表达,减轻缺氧损伤所造成的HPMECs损伤。     

模拟失重对肺微血管内皮细胞凋亡的影响

目的：观察回转模拟失重对肺微血管内皮细胞凋亡的影响。方法：组织块贴壁法原代培养肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVEC）,采用回转器模拟失重效应。PMVEC回转培养48h,同时设1g对照静置培养。采用Hoechst33258染色,荧光显微镜观细胞凋亡的形态学改变;采用Annexin V—FITC试剂盒对细胞染色,以流式细胞仪进行细胞凋亡检测。结果：回转模拟失重48h后,Hoeehst33258染色结果发现细胞凋亡明显增加;流式细胞仪定量结果表明回转48hPMVEC的凋亡率为19．85％,显著高于同步对照组PMVEC的凋亡率13．72％（19．85％±1．29％vs13．72％±1．15％,P〈0．01）。结论：48h回转模拟失重可明显诱导PMVEC发生凋亡。     

心房钠尿肽对脂多糖引起肺微血管内皮细胞损伤的治疗作用

目的:探索心房钠尿肽(ANP)对脂多糖(LPS)引起 肺微血管内皮细胞(PMVEC)损伤的治疗作用.方法:培养大 鼠PMVECs,分为对照组、LPS(1mg/L)组和ANP治疗组(LPS+ANP),流式细胞技术检测各组细胞的周期,MTT比色 试验检测细胞活力,并测试上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活力 和丙二醛(MDA)浓度.结果:ANP可以抑制LPS引起的S期 和G2 M期细胞比例的降低.另外,LPS作用6h后,0.01,0.1 和1μmol/L3种浓度的ANP治疗和LPS作用0、6、12和24h 后0.1μmol/L的ANP治疗,可以抑制LPS引起的A490nm值降 低和LDH活力增强(P<0.05),治疗浓度越大,治疗越早,抑制 作用越明显(P<0.05);MDA含量与LDH活力变化相似,仅 24h组无差异.结论:ANP可以减轻LPS引起的PMVECs损伤.     

百草枯诱导大鼠肺微血管内皮细胞凋亡实验研究

【论文特点介绍】百草枯的肺毒性在于通过增加氧化应激导致肺损伤,而氧化应激可能是导致细胞凋亡的最后共同通路。众所周知,百草枯可以在体内外产生氧自由基损伤肺微血管内皮。然而,在百草枯所致的肺损伤中,     

组织块法培养大鼠肺微血管内皮细胞的综合鉴定

目的 为组织块法培养的大鼠肺微血管内皮细胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells,RPMVECs)建立合理可靠的多指标综合鉴定方案.方法 采用外周肺组织贴块法培养RPMVECs,抽取组织块进行切片观察,以大鼠肺动脉平滑肌细胞和人脐静脉内皮细胞为对照,对培养细胞进行CD34、植物凝集素BSI、Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定,通过光镜和透射电镜观察细胞形态和超微结构.结果 组织切片显示组织块源于外周肺组织,CD34免疫细胞化学染色阳性,植物凝集素BSI结合试验阳性,而Ⅷ因子相关抗原染色阴性,透射电镜未见Weibel-Palade小体.结论 Ⅷ因子相关抗原和Weibel-Palade小体并非RPMVECs鉴定的理想指标,联合应用外周肺组织切片、CD34和植物凝集素BSI三指标为组织块法培养的RPMVECs提供了一个简单易行、合理、可靠的综合鉴定方案.     

剪切力对大鼠肺微血管内皮细胞细胞骨架的影响

目的 观察不同的剪切力对体外培养的大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)细胞骨架蛋白(F-actin)的影响,探讨高血流性肺动脉高压的早期发病机制。方法 用自制的多层流动腔对体外培养的大鼠PMVECs施加剪切力作用,以异硫氰酸荧光素-毒蕈肽标记F-actin,采用共聚焦显微镜扫描观察F-actin的变化并记录相应的荧光值。结果 剪切力引起PMVECs骨架内的微丝重排,向着剪切力的方向出现与细胞长轴一致的应力纤维,且剪切力越大、作用时间越长,这种现象越明显,直至细胞内几乎所有的微丝F-actin都沿着细胞长轴形成应力纤维。结论 PMVECs细胞骨架在受到剪切力作用后会形成应力纤维,该现象在剪切力作用早期即可发生,并且对作用时间及剪切力大小具有依赖性,这可能与高血流性肺动脉高压的早期发病机制密切相关。     

阿魏酸钠对培养大鼠大脑微血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用

目的：研究缺氧对脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells,BMEC）的损伤及阿魏酸钠（Sodium ferulate）对它的保护作用.方法：取体外培养的大鼠脑皮质微血管内皮细胞,置于95%N2和5%CO2的缺氧盒中12h造成内皮细胞缺氧.用透射电镜观察BMEC的超微结构变化.用内皮细胞线粒体活性和内皮细胞死亡率来评价内皮细胞活力,并用乳酸脱氢酶（LDH）漏出量作为评价损伤的指标.结果：体外培养大鼠脑皮质BMEC缺氧12h后,细胞超微结构损伤,细胞存活率及线粒体活性明显降低,LDH释放量显著增加.阿魏酸钠可显著对抗缺氧对BMEC的损伤.结论：阿魏酸钠对大鼠脑皮质BMEC缺氧损伤具有保护作用.     

谷氨酰胺增强氧化应激时肺微血管内皮细胞热休克蛋白70的表达

目的研究谷氨酰胺（Gln）对氧化应激状态下体外培养肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVEC）热休克蛋白（HSP）70表达的影响。方法采用体外培养Wistar大鼠PMVEC,分为阳性对照组（G组）、生理盐水组（PS组）、谷氨酰胺组（Gln组）、过氧化氢加生理盐水组（H₂O₂+PS组）和过氧化氢加谷氨酰胺组（H₂O₂+Gln组）。Western blotting检测PMVEC HSP70的表达情况,分别记录平均灰度值。结果与PS组（9.05±1.51）相比,Gln组（40.28±10.19）和H₂O₂+PS组（43.89±10.32）PMVEC HSP70表达分别增高4.5倍和5倍（P＜0.01）;与H₂O₂+PS组相比,H₂O₂+Gln组（65.59±14.53）HSP70表达进一步增高,约为PS组的7倍,接近G组（70.56±12.23）表达水平。结论谷氨酰胺可增强氧化应激状态下体外培养肺微血管内皮细胞HSP70表达。     

复合培养对低氧时肺动脉平滑肌细胞表达细胞因子的调节

目的 研究低氧对肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)白细胞介素-1β、4、10、13(IL-1β、4、10、13)活性的影响,及复合培养下肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)对其调控作用.方法 大鼠PASMCs单独培养或与PMVECs复合培养,分为正常组、低氧作用2 h(H2)、6h(H6)、12 h(H12)、24 h(H24)组,采用ELISA法测定各组培养细胞上清中IL-1β、IL-4、IL-10、IL-13的活性.结果 低氧刺激后PASMCs的IL-1β、IL-4、IL-10、IL-13活性2 h开始升高,6 h达高峰,12 h降低;各时相点复合培养组均低于对应的单独培养组(P＜0.01).结论 低氧可以激活PASMCs的IL-113、IL-4、IL-10、IL-13活性,在复合培养条件下,PMVECs对此效应具有下调性影响.     

全氟化碳对脂多糖诱导肺微血管内皮细胞表达ICAM-1的影响

目的 观察全氟化碳(PFC)对脂多糖(LPS)诱导肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells, PMVEC)表达细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)的影响,探讨PFC的抗炎作用及其对PMVEC的保护机制.方法 采用组织块法培养大鼠PMVEC,将细胞接种于Transwell小室,按随机数字表法分为空白对照组(C)、PFC干预组(F)、LPS刺激组(L)、LPS刺激 PFC干预组(LF),以处理0 h为空白对照,各处理组分别给予PFC或100 μg/L LPS共孵育3、8、24 h,通过MTT法观测PFC作用后正常大鼠PMVEC细胞活力变化,应用逆转录PCR(RT-PCR)和流式细胞术(FCM)分别检测各组各时相点大鼠PMVEC ICAM-1 mRNA和蛋白表达量.结果 PFC作用后,正常大鼠PMVEC的细胞活力未见明显改变.各组各时相点ICAM-1 mRNA表达的变化规律与蛋白质水平基本一致,F组各时相点ICAM-1的表达量与C组比较均无显著性差异(P＞0.05);L组各时相点细胞的ICAM-1表达均较C组显著增强(P＜0.05,P＜0.01);LF组与L组同时相点比较,3 h组ICAM-1表达量无明显差异(P＞0.05),但8 h和24 h组均有显著降低(P＜0.01,P＜0.05).结论 PFC通过抗炎效应直接下调LPS诱导PMVEC表达ICAM-1,发挥PMVEC保护作用.     

肺微血管内皮细胞的信号通路在肝肺综合征发病机制中的研究进展

肝肺综合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)是慢性肝病的严重并发症,以肺微血管扩张(pulmonary vaso dilata-tion,PVD)引起的低氧血症为典型病理改变,主要发生于各型肝硬化及各种慢性肝病。由于肺微血管主要构成细胞为肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs),因此针对HPS发病机制的研究常以PMVECs的异常改变及其相关信号通路为切入点,文中就此方面近年的研究报道进行综述。     

丹酚酸A 对H2O2 所致大鼠脑微血管内皮细胞氧化损伤保护的实验研究

目的 观察丹酚酸A 对H2O2所致大鼠脑微血管内皮细胞（RCMECs）氧化损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机 制。方法 分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞,用H2 O2 损伤的方法建立氧自由基损伤模型。采用丹酚酸A 进行干预后,分别测定细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性、血栓素B2（TXB2）水平、6- 酮基前列腺素1α（6-keto-PGF1α）的含量,以及细胞内和培养液中脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。结果 H2O2致RCMECs 氧化损伤后,细胞LDH 释放水平、TXB2和MDA 的含量均明显增加,同时6-keto-PGF1α 含量和SOD 活性显著下降;而丹酚酸A 预处理后能呈浓度依赖性的降低RCMECs 氧化损伤后LDH 水平、TXB2含量和细胞内外的MDA 含量,提高受损细胞6-keto-PGF1α 的表达和细胞内外SOD 活性。结论 丹酚酸A 对H2O2所致RCMECs 氧化损伤具有保护作用,其机制可能与其抗氧化作用有关。     

蛋白激酶C参与脂多糖诱导肺微血管内皮细胞VEGF表达

目的:观察蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)在内毒素/脂多糖(lipopolysacchride,LPS)诱导血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达上调中可能发挥的作用。方法:以肺微血管内皮细胞为研究对象,用PKC抑制剂预处理内皮细胞,以RT-PCR检测VEGF mRNA水平的表达变化;Western Blot检测其蛋白质水平的表达变化。结果:(1)VEGF mRNA的表达水平与LPS呈剂量和时间依赖的关系;(2)PKC抑制剂calphostin c预处理内皮细胞能显著抑制LPS诱导VEGF mRNA和蛋白的表达。结论:LPS可能通过PKC信号通路而诱导肺微血管内皮细胞VEGF表达上调。