靶向整合素αvβ3受体磁共振/荧光双模态成像纳米探针的体外成像性能及光动力治疗效应评价

目的探讨RGD-Gd@BSA-Ce6纳米探针对A549肺癌细胞的磁共振/荧光显像效果和光动力治疗作用。方法构建靶向和非靶向纳米探针RGD-Gd@BSA-Ce6和Gd@BSA-Ce6。采用体外磁场发生仪和3.0T临床医用磁共振仪采集RGD-Gd@BSA-Ce6和商品化Gd-DTPA的T1弛豫时间和T1加权图像。通过激光共聚焦显微镜观察光敏剂二氢卟啉e6(chlorin e6,Ce6)、Gd@BSA-Ce6及RGD-Gd@BSA-Ce6纳米探针与A549肺癌细胞的结合能力效果。通过细胞增殖-毒性检测（CCK8试剂盒法)评估3种药物对肿瘤的光动力治疗效果。通过细胞增殖-毒性检测（MTT试剂盒法）评估3种药物对293T细胞（人胚胎肾细胞）的生物安全性。结果RGD-Gd@BSA-Ce6较Gd-DTPA具有更高的T1弛豫率,其T1弛豫系数为18.615。同时,RGD-Gd@BSA-Ce6的T1加权图信号显著高于Gd-DTPA。激光共聚焦成像结果表明,RGD-Gd@BSA-Ce6和Gd@BSA-Ce6对A549细胞的结合能力均高于光敏剂Ce6;同时,RGD-Gd@BSA-Ce6对A549细胞的结合能力明显高于Gd@BSA-Ce6。细胞光动力治疗结果证实,两种纳米探针处理组的细胞存活率都低于光敏剂Ce6处理组（P<0.05),同时RGD-Gd@BSA-Ce6组的细胞存活率明显低于Gd@BSA-Ce6组（P<0.05）。细胞水平的生物安全性实验表明,不同药物浓度下,293T细胞的存活率并未发生明显改变,且各组存活率均高于60%。结论RGD-Gd@BSA-Ce6比商品化Gd-DTPA具有更高T1弛豫性能;体外实验证实RGD-Gd@BSA-Ce6纳米探针对A549肺癌细胞具有显著的结合能力;光动力治疗实验具有明显的杀伤A549肿瘤细胞的作用;MTT实验表明RGD-Gd@BSA-Ce6纳米探针具有良好的生物安全性。     

超声靶向微泡破坏联合溶瘤腺病毒治疗胰腺癌的实验研究

目的探讨超声靶向微泡破坏（UTMD）联合溶瘤腺病毒（oAd）治疗胰腺癌的疗效及相关机制。方法在C57BL/6小鼠右前肢皮下注射Panc-02细胞（2×10６个/只）,选取肿瘤体积在100~150mm3的小鼠55只,随机分为NC组（注射PBS100μL）、UTMD组（注射微泡溶液100μL,并行超声微泡破坏处理5min）、oAd组（注射108PFU/mLoAd溶液100μL）、oAd+微泡组（注射108PFU/mL微泡oAd混合液100μL）、oAd+UTMD组（注射108PFU/mL微泡oAd混合液100μL,并行超声微泡破坏处理5min）,每组11只。2d给药1次,共给药5次,2d记录1次肿瘤体积。第3次给药24h后每组随机取6只小鼠颈椎脱臼法处死,剥离肿瘤制成肿瘤切片及肿瘤细胞悬液。肿瘤切片行HE染色比较各组肿瘤组织坏死情况并计算坏死面积,E1A抗体染色观察oAd在各组肿瘤组织内分布情况,CD3抗体染色比较各组肿瘤内CD3+T细胞数,Tunel染色及流式细胞术分析各组小鼠肿瘤细胞凋亡情况。当小鼠肿瘤体积超过2000mm3时终止实验处死所有小鼠。结果在14d时终止实验,oAd+UTMD组和oAd组相比肿瘤体积增长显著减缓（P＜0.05）。oAd+UTMD组细胞质内oAd的E1A蛋白染色最深,oAd组染色最浅。oAd+UT-MD组和oAd组坏死面积与NC组比值分别是9.50±0.60和3.51±0.24,差异有统计学意义（P＜0.05）。含oAd的3组小鼠肿瘤内CD3+T细胞数均增加,oAd+UTMD组肿瘤内的CD3+T细胞数（196.33±12.58）明显高于oAd组（120.67±12.90,P＜0.05）。oAd+UTMD组的细胞总凋亡率及Tunel染色荧光分布比oAd组多。结论UTMD增强oAd对胰腺肿瘤细胞的杀伤作用,促进oAd在肿瘤内转染,协助CD3+T细胞在肿瘤内富集,同时诱导肿瘤细胞凋亡和坏死增加。     

二甲双胍抑制酸性环境下的调节性T细胞增殖及功能

目的 探讨二甲双胍对酸性环境下的调节性T细胞（Treg）的调控及二甲双胍的抗肿瘤作用。 方法 经磁珠分选得到CD4+CD25+ Treg细胞。在pH 7.4或pH 6.7环境加入二甲双胍干预的条件下,培养Treg或T细胞（Tcon）24~72 h后,采用流式细胞术检测细胞增殖、凋亡及Foxp3表达情况,采用Real-time PCR检测糖代谢相关基因水平。动物实验中,将32只C57BL/6雄性小鼠单次皮下注射RM-1细胞建立小鼠前列腺癌模型,随机分为PBS对照组、二甲双胍治疗组、疫苗治疗组及联合治疗组（各组n=8）。于接种后第4天开始,按100 mg· kg-1· d-1给予二甲双胍治疗组及联合治疗组小鼠腹腔注射二甲双胍,给予疫苗治疗组及联合治疗组小鼠每4 d一次肌注疫苗。PBS注射作为对照。连续监测肿瘤大小,在植瘤后第25天处死小鼠获取肿瘤及血液样本。采用流式细胞术检测瘤内及外周血内CD4+、CD8+、CD4+Foxp3+细胞亚群的变化。 结果 较中性缓冲条件,酸性环境下Treg细胞活性增强（P<0.05）,而Tcon细胞增殖受到抑制（P<0.001）。QPCR结果显示,酸性环境较正常酸碱环境下,Treg细胞OXPHOS相关基因pgc1a（P<0.001）及cox5b（P<0.01）水平增高,而Tcon细胞内相关基因水平变化不显著。酸性环境下Treg细胞凋亡显著减少（P<0.01）、Foxp3+细胞比例增加（P<0.001）、胞内pH值偏碱性（P<0.001）,加入二甲双胍,逆转了Treg细胞的酸性耐受。但是,二甲双胍对Tcon细胞影响不显著。动物实验中,二甲双胍（P<0.05）或疫苗（P<0.01）单独治疗均可减小肿瘤体积,而联合治疗组肿瘤体积减小最多（P<0.001）。二甲双胍单独治疗对肿瘤内CD4+细胞、CD8+细胞影响不明显,但可显著降低CD4+Foxp3+细胞比例（P<0.05）,而疫苗单独治疗显著提高肿瘤内CD4+细胞、CD8+细胞（P<0.001）,但CD4+Foxp3+细胞也升高（P<0.05）。联合治疗组肿瘤内CD4+细胞、CD8+细胞增高最多（P<0.01）,CD4+Foxp3+细胞比例较疫苗单独治疗组下降（P<0.01）。结论 二甲双胍抑制酸性环境下的调节性T细胞增殖及功能,并且在体内通过减少Treg细胞比例提高肿瘤疫苗效果,发挥抗肿瘤功能。     

DC-CIK 生物治疗后肺癌患者Pro-GRP 和T 淋巴 细胞亚群对免疫功能评价的临床意义

目的 探讨生物治疗前后肺癌患者胃泌素释放肽前体（Pro-GRP）和T 淋巴细胞亚群对免疫功 能评价的临床意义,方法 选取2014 年9 月-2015 年8 月天津市第五中心医院收治经病理确诊的肺癌患者45 例,根据病理组织学分为小细胞肺癌组（SCLC）和非小细胞肺癌组（NSCLC）,选取同期健康体检者40 例为 对照组。采用贝克曼- 库尔特FC500 流式细胞仪检测受检者外周血CD3+、CD4+、CD8+、调节性T 细胞（Treg）, 采用德国罗氏COBAS 6000 检测受检者外周血的Pro-GRP、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、癌胚抗原（CEA）、 细胞角蛋白19 的可溶性片段（CYFAR21-1）,化疗结束后,联合生物治疗DC-CIK 自体细胞回输3 个周期后, 用相同方法采集患者静脉血,检测Pro-GRP、T 淋巴细胞亚群、Treg。结果 DC-CIK 细胞生物治疗后NSCLC 组CD8+T 淋巴细胞和Treg 细胞较治疗前下降,CD3+、CD4+T 淋巴细胞、CD4+/CD8+ 比值较治疗前上升; SCLC 组CD3+、CD4+、CD8+ T 淋巴细胞数量较治疗前增加,Treg 细胞较治疗前下降;Pro-GRP 各组均较治疗 前下降;Pro-GRP 与T 淋巴细胞亚群在SCLC 组呈负相关,在NSCLC 组无相关;Pro-GRP 与Treg 细胞在各 组呈正相关（P <0.05）。结论 Pro-GRP 在SCLC 患者与T 淋巴细胞亚群存在相关性,可用于辅助早期临床 诊断,并与T 淋巴细胞亚群共同评价患者的免疫调节功能,DC-CIK 细胞回输生物治疗可增强患者特异性杀伤 肿瘤的能力,提高机体的免疫监视功能,抑制肿瘤免疫逃逸,改善患者的免疫功能。     

PD-1+肿瘤浸润性CD8+T淋巴细胞的表型鉴定及功能研究

目的 从肿瘤局部分离衰竭性CD8+T淋巴细胞(CD8+ PD-1+T细胞),并对其功能进行研究,初步探讨机体免疫系统无法有效杀伤和清除肿瘤的原因.方法 C57BL/6小鼠皮下注射Lewis肺癌细胞株建立小鼠肿瘤模型.将肿瘤制成单细胞悬液后,染细胞表面标志.采用流式细胞术从肿瘤局部分选CD8+ PD-1+T淋巴细胞及CD8+ PD-1-T淋巴细胞,体外经非特异性刺激后行细胞内因子染色,检测IFN-γ分泌能力.CFSE细胞染色检测其增殖活性.结果 肿瘤局部成功分离得浸润性CD8+T淋巴细胞,其中将近80％的细胞高表达衰竭表型PD-1+.CFSE结果显示CD8+ PD-1+T细胞较CD8+ PD-1-T细胞增殖活性明显下降;细胞内因子染色后流式细胞术检测结果显示肿瘤局部CD8+ PD-1+T细胞较CD8+ PD-1-T细胞IFN-γ分泌能力降低约50％.结论 肿瘤局部存在一群免疫衰竭性T细胞,可能参与了肿瘤的免疫逃逸.     

不同方法诱导小鼠产生CD8+记忆性T细胞的研究

目的探讨不同方法诱导小鼠产生CD8+记忆性T细胞的效果。方法将100只雌性BalB/C小鼠作为受体小鼠，并将其中75只小鼠按随机数字表法分为移植组、1×106注射组、5×106注射组、1×107注射组和空白对照组，每组15只。取1只C57小鼠（供体小鼠）的脾脏淋巴细胞，按上述不同个数溶于0.2mlPBS缓冲液后注射于各注射组小鼠腹腔中；颈椎脱臼处死后，取15块0.25cm2背部皮肤移植到移植组小鼠背部。处理后1、2、3个月时采用流式细胞术检测上述5组小鼠脾脏CD8+记忆性T细胞百分比和CD3+T细胞总数。剩余25只小鼠（每组5只）按上述方法分组和处理，然后纯化分选CD8+记忆性T细胞，与经过辐照后的C57小鼠脾脏淋巴细胞进行共培养，1周后用流式细胞仪检测CD8+记忆性T细胞增殖指数。结果前5组小鼠在处理后1个月时产生的CD8+记忆性T细胞百分比差异无统计学意义（P＞0.05），但在2、3个月时3个注射组高于空白对照组和移植组（均P＜0.05），3个月时更明显（均P＜0.05）。其中1×106注射组在2个月时CD8+记忆性T细胞比例最高；在CD3+T细胞总数方面，移植组及3个注射组组内比较均在2个月时最高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），但组间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。各组CD8+记忆性T细胞的增殖指数差异无统计学意义（P＞0.05）。结论通过体内注射脾脏淋巴细胞来诱导CD8+记忆性T细胞是更高效的方法。     

复方保肝宁减轻小鼠肝纤维化的机制:抑制肝脏组织中的IDO1进而促进树突状细胞表型成熟

目的 观察中药复方保肝宁对肝纤维化模型小鼠的保护作用并探讨其作用机制。方法 本研究分为两部分,第1部分：按 0.6 mL/（kg·d）予以腹腔注射25% CCl4（CCl4∶橄榄油=1∶3）的方式诱导野生型小鼠建立肝纤维化病理模型,随机分为对照组、模型组、阳性对照组及保肝宁低、中、高浓度组,10只/组。造模给药8周后处死小鼠,取小鼠血清检测AST、ALT水平。另取肝组织做HE、天狼星红染色及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫组化染色并检测吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）的表达水平。流式细胞仪检测小鼠肝脏树突状细胞（DCs）及T细胞的数量和表型变化。第2部分：按3×1011 v.g/只尾静脉注射IDO1过表达腺相关病毒,取正常野生型小鼠随机分为腺相关病毒阴性对照（AAV9-NC）干预组、IDO1过表达腺相关病毒（AAV9-IDO1）干预组及高浓度保肝宁+IDO1过表达腺相关病毒联合干预组,6只/组。干预4周后,取肝组织做IDO1免疫组化染色并检测小鼠肝脏树突状细胞（DCs）及T细胞的表型变化。结果 与模型组比较,保肝宁高浓度组能有效降低肝纤维化小鼠血清中AST、ALT水平（P< 0.01）;改善肝组织病理损伤,减少肝纤维组织的形成及α-SMA和IDO1的沉淀（P<0.05）。保肝宁高浓度治疗组肝纤维化小鼠肝脏中CD11C+DCs、CD11C+CD80+DCs、CD11C+CD86+DCs、CD11C+CD40+ DCs、CD11C+MHCII+ DCs细胞和CD3+T、CD3+CD4+T细胞比例与模型组相比均呈不同程度的升高（P<0.05）。高浓度保肝宁干预后可显著降低IDO1过表达腺相关病毒干预小鼠肝脏中IDO1的表达水平及上调CD11C+CD40+ DCs、CD11C+MHCII+ DCs和CD3+CD4+T细胞比例（P<0.05）。结论 保肝宁对CCl4所致小鼠肝纤维化具有一定的治疗作用,其机制可能与降低肝组织中IDO1的表达水平继而促进肝脏中DCs表型成熟使DCs刺激T细胞增殖能力增强有关。     

小鼠乳腺癌动物模型中调节性T细胞的动态检测及其实验意义

【摘要】 目的 分析小鼠乳腺癌实验动物模型中调节性T细胞(Tregs)的变化,并探讨其在肿瘤发生中的意义。 方法 建立小鼠乳腺癌动物模型。在肿瘤接种后1周、3周和6周3个不同时间点,流式细胞术（FACS）检测CD4+CD25+ 和CD4+ FOXP3+调节性T细胞在脾脏、引流淋巴结和肿瘤组织中所占的CD4+T细胞细胞的比例, CD4+T细胞中CD25+ FOXP3+双阳的表达情况,肿瘤组织中CD4+T细胞占肿瘤浸润T淋巴细胞（CD3+T）的比例。结果 与正常对照组比较,在小鼠乳腺癌动物模型中,脾脏和淋巴结中CD4+ T细胞占淋巴细胞的比例在荷瘤1周、3周和6周逐渐下降（P0. 05）。 结论 调节性T细胞在恶性肿瘤模型中表达增加,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。     

不同热剂量等级的微波消融治疗对结肠癌小鼠T细胞的影响

目的: 探讨不同热剂量等级的微波消融治疗对诱发结肠癌小鼠T细胞的影响。方法: 建立荷瘤小鼠的结肠癌MC38模型,分为对照组和微波消融组,根据热剂量等级将微波消融组分为低（5 W、60 s）,中（10 W、60 s）,高（15 W、60 s）剂量组。于荷瘤9 d时,给予微波消融治疗,观察小鼠的肿瘤生长情况。给予微波消融处理后14 d,取小鼠脾脏研磨制成单细胞悬液,用流式细胞术检测脾脏中的CD3+T、CD4+ T、CD8+ T细胞。结果： 与对照组相比,各微波消融组小鼠的肿瘤体积明显缩小（P<0.05）,高、中、低剂量组的CD3+T、CD4+T细胞均明显高于对照组（P<0.05或P＜0.01）,高剂量组明显高于中、低剂量组（P＜0.05）。高剂量组的CD4+/CD8+T细胞比值明显高于中、低剂量组（P<0.05）,且与对照组相比,增高显著（P＜0.01）。四组间的CD8+T细胞不存在统计学差异（P>0.05）。 结论： 微波消融能增强小鼠的免疫功能,高剂量效果更好。     

华支睾吸虫来源的分子伴侣rCsHscB对小鼠慢性溃疡性结肠炎有治疗作用

目的 研究华支睾吸虫来源的分子伴侣rCsHscB对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠慢性溃疡性结肠炎的作用。方法 诱导大肠杆菌表达体外获得高纯度重组rCsHscB蛋白。将C57BL/6雄性小鼠随机分为NC组（n=10）、rCsHscB组（n=10）、DSS组 （n=15）和DSS+rCsHscB组（n=15）,采用2%的DSS常规建立小鼠慢性溃疡性结肠炎模型。rCsHscB组和DSS+rCsHscB组在给予DSS同一周的第4、7天腹腔注射125 μg/mL rCsHscB,NC组和DSS组注射无内毒素PBS。第84天处死小鼠后对结肠组织进行HE和Masson染色,并采用流式细胞术检测外周血和小肠固有层淋巴细胞中CD4+T细胞、CD8+T细胞的表达,ELISA检测结肠匀浆上清中IL-6、IL-10和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）含量,Western blot 检测结肠组织中MAPK信号通路相关蛋白ERK1/2、JNK和P38的磷酸化和非磷酸化水平。结果 与NC组相比,rCsHscB组小鼠未出现不良反应。DSS组小鼠结肠组织病理损伤显著,胶原纤维沉积加重,外周血及小肠固有层淋巴细胞中CD4+T细胞比例升高、CD4+ T/CD8+T细胞比值明显上升。结肠匀浆上清中IL-6和MCP-1水平显著升高,IL-10分泌没有明显变化（P=0.11）,ERK1/2、JNK和P38的磷酸化水平显著升高;与DSS组比较,DSS+rCsHscB组小鼠结肠组织病理损伤缓解、胶原纤维沉积减少,外周血及小肠固有层淋巴细胞中CD4+T/CD8+T细胞比值明显降低,结肠匀浆上清中IL-6及MCP-1水平显著下降,IL-10水平显著上升（P=0.003）,ERK1/2、JNK和P38磷酸化水平显著降低。结论 rCsHscB对小鼠慢性溃疡性结肠炎具有一定的预防改善作用,其可能是通过MAPK抑制促炎因子产生并调控 CD4+T/CD8+T细胞平衡来发挥作用的。     

当归红芪超滤膜提取物对12C6+重离子束辐射致H22荷瘤小鼠免疫功能损伤的影响

目的观察当归红芪超滤膜提取物抗~(12)C~(6+)重离子束辐射致H22荷瘤小鼠免疫功能损伤的作用。方法 H22细胞皮下注射法构建H22荷瘤小鼠模型,以检测血液白细胞数目为评价标准确定~(12)C~(6+)重离子束辐射致H22荷瘤小鼠免疫损伤最佳辐射剂量及当归红芪超滤膜提取物药物干预最佳剂量。实验分正常对照组、肿瘤模型组、单纯药物组(给予当归红芪超滤膜提取物6.72 g/kg)、单纯放射组(照射剂量为4Gy)、药物(给予当归红芪超滤膜提取物6.72 g/kg)+放射(照射剂量为4Gy)组。测定各组脾脏指数、胸腺指数;流式细胞仪技术分析各组小鼠血液T淋巴细胞亚群变化;ELISA法检测各组小鼠血清补体C3、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)含量;光镜下观察脾脏病理形态学改变。结果与肿瘤模型组比较,单纯放射组血液白细胞数目、脾脏指数、胸腺指数、血液CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞数量、血清补体C3、IFN-γ、IL-4含量明显下降(P0.05),CD4+/CD8+比值、IFN-γ/IL-4比值明显下降(P0.05)。病理形态学显示:肿瘤模型组小鼠脾脏形态结构如常,多数脾窦扩张淤血,脾小体清晰,可见动脉周围淋巴鞘,巨核细胞多见,与正常对照组小鼠脾脏形态无明显差异;单纯放射组脾脏脾小体及红髓脾索萎缩,淋巴细胞明显减少,巨核细胞数量减少,纤维组织增生。与单纯放射组比较,药物+放射组血液白细胞数目、脾脏指数、胸腺指数、血液CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞数量、血清补体C3、IFN-γ含量明显上升(P0.05),CD4+/CD8+比值、IFN-γ/IL-4比值有明显上升(P0.05),病理形态学损伤改变明显减轻。结论当归红芪超滤膜提取物有减轻~(12)C~(6+)重离子束辐射引起H22的荷瘤小鼠免疫功能损伤的作用。     

HMGB1/GADD45A介导急性移植物抗宿主病患者CD4+ T细胞STAT3启动子的去甲基化

目的：研究急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGVHD)患者CD4+ T细胞中STAT3基因启动 子DNA病理性低甲基化的分子调控机制。方法：收集行同胞全相合异基因造血干细胞移植的42例患者的血液样本。 采用实时定量PCR和Western印迹检测各组患者生长阻滞与DNA损伤诱导蛋白45A(growth arrest and DNA damage-inducible protein 45 alpha,GADD45A)的表达水平,免疫共沉淀检测各组患者高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein, HMGB1)与GADD45A的结合水平,染色质免疫共沉淀检测各组患者HMGB1和GADD45A与STAT3启动子的结合水 平;正常CD4+ T细胞中过表达HMGB1及干扰GADD45A表达后用Western印迹检测STAT3表达水平,亚硫酸盐测序检测 STAT3启动子区DNA甲基化水平。结果：与未发生aGVHD患者比较,aGVHD患者外周血CD4+ T细胞中GADD45A表达 水平明显升高;HMGB1与GADD45A的结合显著增加;HMGB1,GADD45A与STAT3启动子的结合水平均明显升高, 且STAT3启动子区HMGB1,GADD45A结合水平与其DNA甲基化水平呈高度负相关(分别r=0.719,r=0.840;P<0.01)。 与单纯过表达HMGB1相比,正常CD4+ T细胞中过表达HMGB1叠加干扰GADD45A表达后STAT3表达明显降低,STAT3 启动子DNA甲基化水平明显升高。结论：CD4+ T细胞中HMGB1和GADD45A表达升高是异基因造血干细胞移植后患者 STAT3启动子DNA低甲基化,STAT3高表达,进而诱发aGVHD的重要因素。     

淋巴细胞趋化因子基因修饰增强肿瘤抗原多肽致敏的树突状细胞的 …

目的 通过选择性增强树突状细胞（ＤＣ）与Ｔ细胞的体内相互作用。优化其体内抗原提呈的微环境,为进一步增强ＤＣ介导的肿瘤免疫治疗效果。方法 体外培养的小鼠骨髓树突太细胞体外经Ｌｔｎ重组腺病毒感染后（Ｌｔｎ－ＤＣ）,用３ＬＬＬｅｉｗｓ肺癌细胞株的Ｍｕｔｌ抗原肽冲击致敏,按不同剂量免疫正常同系小鼠体内,观察其体内诱导的细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）活性保护性免疫反应。通过体内阻断试验探讨免疫细胞亚群及免疫分     

含金属硫蛋白蛋奶粉对小鼠肝细胞实体瘤的治疗作用

目的：观察含金属硫蛋白（MT）蛋奶粉对荷瘤小鼠肝癌有无治疗作用。方法：70只BALB/c小鼠随机分为正常对照组10只、荷瘤鼠组20只、低剂量和高剂量含MT蛋奶粉肿瘤治疗组各20只。除正常对照组小鼠外，在其余小鼠体内移植H-22小鼠肝癌细胞株形成移植性肝癌模型，连续用含MT蛋奶粉给荷瘤小鼠灌胃2周后，每组断头处死10只小鼠，取其脾脏，采用MTT法检测各组小鼠淋巴细胞转化功能和IL-2活性，及流式细胞术检测脾脏CD4⁺、CD8⁺和CD25⁺ T细胞百分率以及淋巴细胞周期进程和凋亡的变化，以及³H-TDR 掺入法检测CTL和NK细胞杀伤活性，并采用细胞病变抑制法检测小鼠IFN-γ活性以及L929 体外杀伤法检测 TNF-α 活性。并于开始灌胃MT蛋奶粉后的第21～31天观察小鼠肿瘤大小。结果：在BALB/c小鼠形成肝癌第27、29及31天，含低剂量和高剂量MT蛋奶粉组小鼠肿瘤体积均明显小于肿瘤对照组（P<0.05）；含低剂量和高剂量MT蛋奶粉肿瘤治疗组淋巴细胞刺激指数(SI)较肿瘤对照组均显著增加 （P<0.01），含高剂量MT蛋奶粉肿瘤治疗组小鼠脾脏CD4⁺细胞百分率及CD4⁺/CD8⁺比值较肿瘤对照组均显著增加（P<0.01，P<0.05），其CD25⁺ T细胞百分率较肿瘤对照组显著降低（P<0.01）；与肿瘤对照组比较，含高剂量MT蛋奶粉肿瘤治疗组小鼠淋巴细胞G₀/G₁期细胞百分率显著降低（P<0.05），G₂/M期细胞百分率显著增加（P<0.05）；同时，含高剂量MT蛋奶粉肿瘤治疗组小鼠淋巴细胞凋亡百分率较肿瘤对照组(荷瘤鼠组)显著降低（P<0.05）；荷瘤小鼠脾脏CTL细胞毒活性显著低于正常对照组（P<0.05），含高剂量MT组CTL细胞毒活性显著高于荷瘤小鼠（P<0.05）；荷瘤小鼠脾脏NK细胞毒活性明显低于正常对照组（P<0.05），而含MT肿瘤治疗组NK细胞毒活性明显高于荷瘤组小鼠，尤其以高剂量组为显著（P<0.01）。与肿瘤对照组比较，含高剂量MT蛋奶粉显著增加了荷瘤小鼠的IL-2和TNF-α活性（P<0.01），含低剂量MT蛋奶粉对荷瘤小鼠的TNF-α活性亦有明显提高作用（P<0.01），对IFN-γ活性并无显著影响。结论：含MT蛋奶粉对肿瘤的治疗性效应可能是通过增强荷瘤小鼠的免疫功能实现的。     

卵巢癌患者CD8+ T细胞中调节性T细胞相关分子标志物的表达率及临床意义

目的 :检测卵巢癌患者组织及外周血CD8~+T细胞中调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)相关分子标志物的表达率,探讨其在卵巢癌发生发展中的临床意义。方法:用流式细胞术检测31例卵巢癌患者、31例卵巢良性肿瘤患者和31例健康对照者的外周血,以及14例卵巢癌组织和12例卵巢良性肿瘤组织CD8~+T细胞中Foxp3、CD25、CD28、CTLA-4及GITR的表达率。结果:Foxp3和CTLA-4在卵巢癌组织CD8~+T细胞中的表达率显著高于卵巢良性肿瘤组织(P<0.05);CD28在卵巢癌组织CD8~+T细胞中的表达率显著低于卵巢良性肿瘤组织(P<0.05)。卵巢癌患者外周血CD8+T细胞中Foxp3、CD25、CTLA-4的表达率显著高于卵巢良性肿瘤患者和健康对照者(P<0.05),CD28的表达率显著低于卵巢良性肿瘤患者和健康对照者(P<0.05)。结论:卵巢癌组织及外周血CD8~+Treg所占的比例显著高于卵巢良性肿瘤组及健康对照组,且CD8~+T细胞中Foxp3的表达率可能对了解卵巢癌进展状况有一定帮助。     

光动力治疗和冻融对肿瘤细胞抗原释放及树突细胞成熟表型的影响

目的 探讨光动力疗法(PDT)和冻融导致的肿瘤细胞抗原暴露,对体外树突细胞(DC)成熟表型的影响.方法 对体外培养的4T1乳腺癌细胞分别予以PDT和反复冻融,检测4T1细胞的坏死与凋亡,收获上清液并与未成熟DC(imDC)或成熟DC(mDC)共同孵育,采用流式细胞法和激光共聚焦显微镜分析DC免疫表型和形态学特征.结果 经两种机制处理的4T1细胞都以坏死为主,但PDT较冻融诱导更高的凋亡率(34.7%±9.6%比16.8%±5.1%,P＜0.05);与上清液孵育后,PDT组imDC的CD80、CD86与I-A/I-E阳性率分别为22.4%±4.6%、22.5%±5.6%、24.3%±6.3%,冻融组依次为17.3%±3.3%、18.0%±4.7%、20.7%±3.1%,均高于空白对照组(14.2%±3.0%、13.6%±3.3%、15.5%±2.1%,P＜0.05),且PDT组升高更明显,而mDC的免疫表型变化差异无统计学意义(P＞0.05).结论 与冻融相比较,PDT导致更高的细胞凋亡率,更易诱导imDC表达成熟表型.

Abstract：

Objective To investigate the effects of tumor antigen on the maturation phenotypes of dendritic cells through different treatments of antigenic exposure. Methods The necrosis and apoptosis of 4T1 mammary carcinoma cells were detected after an in vitro treatment of photodynamic therapy (PDT) or freezing-thawing. The supernatant of 4T1 cells was harvested and added into the culture of immature or mature dendritic cells (DCs). The immune phenotypes and morphological features of DCs were analyzed by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy respectively. Results Necrosis predominated after these treatments. But the apoptotic ratio was higher in PDT cells than that in freezing-thawing cells (34. 7% ±9. 6% vs 16. 8% ± 5. 1%, P ＜ 0.05 ). After co-culturing with different supernatants, the immature DCs of PDT group showed more significant increases of positive rates of CD80 (22. 4% ±4. 6% ),CD86 (22. 5% ± 5. 6% ) and I-A/I-E (24. 3% ± 6. 3% ) versus the immature DCs of freezing-thawing group (17.3% ±3.3%, 18.0% ±4.7% and 20.7% ±3.1% respectively,P＜0. 05) and control group (14.2% ±3.0%、13.6% ±3.3% 、15.5% ±2.1%,P＜0.05). No difference was found between two groups of mature DCs (P ＞ 0. 05 ). Conclusion As compared with the treatment of freezing-thawing, PDT yields a higher apoptotic ratio of 4T1 cells and an elevated expression of maturation phenotypes in imature DCs.     

前列腺癌冷冻消融对小鼠机体抗肿瘤免疫反应的影响

目的 探讨前列腺癌冷冻消融后对机体抗肿瘤免疫反应的影响.方法 复制前列腺癌皮下移植瘤.将动物模型随机分为:对照组(A组)、手术切除组(B组)、冷冻消融组(C组).分别于治疗前、治疗后7、14、21 d取外周血、引流淋巴结、脾脏.ELISA法检测外周血干扰素(IFN)γ、白细胞介素(IL)4浓度,以IFN-γ/IL-4计算Th1/Th2比值;分离引流淋巴结、脾脏淋巴细胞,ELISPOT试验检测CD4+Th肿瘤特异性IFN-γ的分泌情况,LDH释放试验检测CD8+CTL肿瘤杀伤活性.观察各组动物肿瘤转移情况.结果 治疗后7 d,A、B、C组外周血Th1/Th2比值分别为:4.97±0.31,10.07±0.62,13.71±0.57(P<0.05).引流淋巴结每10～6个CD4+Th肿瘤特异性IFN-γ~+细胞数分别为22.3±1.0、24.0±1.2、243.4±46.2(P<0.05),引流淋巴结CD8+CTL特异杀伤活性分别为:(14.6±1.1)%、(15.2±0.8)%、(62.6±2.3)%(P<0.05).但各观察时间点A、B、C组脾脏Th细胞IFN-γ分泌及CTL细胞杀伤活性均无明显变化.术后28 d A、B、C淋巴结转移率分别为100%、80%、40%,肺转移率均为100%.结论 冷冻消融治疗前列腺癌可诱导机体Th1抗肿瘤免疫优势,并诱导引流淋巴结T细胞肿瘤特异性免疫反应,但存在一定局限性,尚需更深入研究.     

慢性乙型肝炎患者CD4+ CD25+调节性T细胞免疫抑制功能的研究

目的 探讨慢性乙型肝炎患者CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg)免疫抑制功能.方法 收集北京大学人民医院22例慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血单个核细胞(PBMC)以及18名健康对照的PBMC标本,以流式分析对PBMC中CD4+ CD25+ Treg的频率进行分析;5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入法评价CD4+ CD25+ Treg的免疫抑制功能;并同时通过磁珠分选去除CHB患者PBMC中的CD4+ CD25+ Treg,分别以MHC-肽-五聚体法和酶联斑点免疫法(Elispot)检测HBVcore18-27抗原肽刺激对HBV特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的频率以及IFN-γ的分泌.结果 CHB患者外周血中CD4+ CD25+ Treg细胞群所占CD4+T细胞群的比例明显高于健康对照(t=3.74,P＜0.01);CHB患者CD4+ CD25+ Treg细胞可非特异抑制自身活化的CD4+ CD25- T细胞,并呈剂量依赖的特点,且抑制能力与健康对照相比无明显差异;在经HBVcore18-27抗原肽诱导条件下,去除CD4+ CD25+ Treg CHB患者,HBVcore18-27特异性CTLs的频率以及CTLs分泌IFN-γ的频数与未去除CD4+ CD25+ Treg组比出现显著上调(t=4.75,t=7.828,P＜0.01).结论 CHB患者循环中CD4+ CD25+ Treg细胞频率升高.在体外去除CHB患者PBMC的CD4+ CD25+ Treg后可显著地增强HBV抗原诱导的抗HBV细胞免疫应答.     

冷冻消融联合栓塞治疗对中晚期肾癌细胞免疫功能的影响

目的 分析氩氦冷冻消融联合肾动脉栓塞(TRAE)治疗对中晚期肾癌患者外周血CD4~+CD25~+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的影响及临床意义.方法 回顾我院77例中晚期肾癌患者临床资料,依据接受治疗方式分为两组:冷冻消融联合TRAE治疗组32例;单纯TRAE组45例.分别于治疗前、后3个月取外周血,流式细胞仪检测外周血Treg及T淋巴细胞亚群;术后1个月采用增强MRI或CT评价肿瘤坏死程度.结果 联合组治疗后Treg细胞占CD4~+T细胞比例由6.6%±1.2%下降至3.9%±1.2%,二者差异具有统计学意义(t=42.768,P<0.01);CD4~+T、CD8~+T细胞比例及CD4~+T/CD8~+T较术前明显增高,差异均具有统计学意义(均P<0.01).而TRAE组治疗前后Treg细胞占CD4~+T细胞比例、CD4~+T、CD4~+T/CD8~+T、CD8~+T细胞比例虽略有增高但差异均无统计学意义(均P>0.05).联合组的肿瘤坏死率为57.5%,单纯TRAE组为31.6%,两组比较,差异具有统计学意义(t=6.784,P<0.01).联合组中位生存期为(20个月),明显高于TRAE组(12个月),二者差异具有统计学意义(χ~2=7.368,P<0.01).相关性分析显示:治疗后Treg细胞比例下降程度与肿瘤坏死率(r=0.90 P<0.01)及生存期(r=0.67 P<0.01)呈密切正相关关系.结论 TRAE与冷冻消融联合治疗中晚期肾癌能明显降低Trcg细胞比例,改善患者免疫状态,可提高肿瘤坏死率并延长患者生存期.     

IL-21在慢性乙型肝炎中免疫调节作用的研究

目的探讨白细胞介素21(IL-21)在慢性乙型肝炎中的免疫调节作用。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测32例慢性乙型肝炎病人(病人组)和29例健康人(对照组)血清中IL-21水平。提取外周血单个核细胞后分别设为IL-21刺激组、IL-2刺激组和未刺激组,多色流式分析技术检测CD8+T细胞频率,胞内细胞因子染色技术检测CD8+IFN-γ+T细胞的频率。结果与对照组相比,病人组血清中IL-21浓度明显增高(t=2.75,P<0.01);与IL-2刺激组和未刺激组相比,IL-21刺激组CD8+T细胞频率及分泌IFN-γ水平显著升高(F=59.27、10.27,q=3.82~14.11,P<0.01)。结论 IL-21通过对CD8+T细胞的免疫调节效应参与慢性乙型肝炎病人体内病毒的清除,为临床治疗提供了新的靶标。