桃红四物汤促进自噬抑制氧糖剥夺诱导的心肌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨桃红四物汤(TST)对氧糖剥夺(OGD)诱导的H9C2心肌细胞损伤的保护作用。 方法 将H9C2心肌细胞分为5组(n=3)：对照组、OGD模型组、OGD +TST含药血清处理组、OGD +TST含药血清+雷帕霉素处理组、OGD +TST含药血清+氯奎处理组。四唑盐(MTT)比色法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;免疫印迹法(western blot)检测自噬相关蛋白(LC3、p62)和凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)的表达。结果 与对照组相比,OGD模型组细胞活力显著下降(P<0.05),细胞凋亡显著增多(P<0.05),LC3II/LC3I比值和促凋亡蛋白Bax显著增多,p62和抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少。与OGD模型组相比,OGD +TST含药血清处理组的细胞活力显著升高(P<0.05),细胞凋亡明显减少(P<0.05),LC3II/LC3I比值、Bcl-2表达增多,p62和Bax蛋白表达减少。与OGD +TST含药血清处理组相比,OGD +TST含药血清+雷帕霉素处理组的细胞活力进一步升高(P<0.05),细胞凋亡比例进一步减少(P<0.05),LC3II/LC3I比值、Bcl-2表达进一步增多,p62和Bax蛋白表达进一步减少;而氯奎处理桃红四物汤治疗组的细胞活力下降(P<0.05),凋亡细胞比例升高(P<0.05),LC3II/LC3I比值、Bcl-2表达减少,p62和Bax蛋白表达增多。结论 桃红四物汤促进氧糖剥夺H9C2心肌细胞自噬,抑制心肌细胞凋亡,对心肌缺血起保护作用。     

甘氨酸对氧糖剥夺诱导大鼠神经元损伤的抗凋亡作用

目的 探讨甘氨酸对氧糖剥夺诱导神经元损伤的作用及机制。方法 采用体外培养的大鼠原代神经元建立氧糖剥夺模型,随机分为正常对照组、氧糖剥夺组和甘氨酸处理组,应用MTT、流式细胞术等方法检测甘氨酸对神经元活性、生存率、细胞凋亡的影响; 应用蛋白质印迹测定甘氨酸对凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Bad、Bax的影响。结果 甘氨酸能够提高大鼠原代神经元活力和存活率,减少细胞凋亡,并且能够增加抗凋亡因子Bcl-2,降低促凋亡因子Bax的表达(P<0.05或P<0.01)。结论 甘氨酸对氧糖剥夺神经元有明显的保护作用,该作用可能与促进抗凋亡因子、抑制促凋亡因子释放有关。     

内质网应激在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用

目的探讨内质网应激在高糖诱导大鼠心肌细胞凋亡中的作用。方法采用混合酶一步消化法分离SD大鼠乳鼠心肌细胞,以高糖诱导的心肌细胞为模型,将培养的心肌细胞分为3组,甘露醇对照组(对照组)、高糖(25 mmol/L)组和高糖加抗氧化剂组(NAC组),分别检测各组心肌细胞中活性氧(ROS)的含量,利用RT-PCR法检测心肌细胞中内质网应激标志分子GRP78、CHOP和Caspase-12的表达情况。结果与对照组比较,高糖组心肌细胞中ROS含量明显增多,细胞凋亡率升高(P<0.01),与高糖组比较,NAC组ROS含量减少(P<0.01),细胞凋亡率降低(P<0.01);与NAC组比较,高糖组内质网应激标志分子的mRNA表达显著上调(P<0.01),抗氧化剂能阻断高糖心肌细胞中内质网应激标志分子mRNA的表达,使其表达明显下调(P<0.01)。结论内质网应激凋亡通路可能参与高糖诱导的心肌细胞凋亡。     

体外培养皮层神经元氧糖剥夺致细胞凋亡模型的建立

目的采用简便、有效的方法建立体外培养神经元氧糖剥夺致凋亡的模型。方法新生大鼠皮层神经元培养7d后,全量换液为不含葡萄糖的Earle’s液,并以灭菌液体石蜡封闭。MAP-2荧光染色观察神经元损伤情况,采用LDH和Tunel法检测大鼠皮层神经元大致死亡和凋亡情况。结果随着氧糖剥夺时间的延长,神经元损伤加重并发生凋亡,与对照组比较有显著差异。结论无糖Earle’s液培养并配合灭菌液体石蜡封闭,可以模拟神经元缺血缺氧,导致神经元凋亡。     

氧化应激在高糖诱导乳鼠心肌细胞凋亡中的作用

目的:探讨氧化应激在高糖诱导乳鼠心肌细胞凋亡中的作用。方法:分离培养SD乳鼠心肌细胞,分别用10～50mmol/L终浓度的葡萄糖进行干预,MTT测定各组心肌细胞的生长活力;激光共聚焦显微镜、脱氧核糖核酸转移酶原位缺口末端标记法(TUNEL)和流式细胞术用于观察和检测心肌细胞凋亡;将心肌细胞分为3组:对照组、高糖组和抗氧化剂组,分别检测各组上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量以反映心肌细胞的氧化应激水平。结果:MTT结果显示高糖能浓度依赖性地抑制心肌细胞的生长活力;激光共聚焦显微镜、TUNEL染色和流式细胞术均表明高糖能诱导心肌细胞凋亡;与对照组相比,高糖组LDH、MDA含量明显增高,SOD含量显著下降,与高糖组相比,抗氧化剂组LDH,MDA含量明显下降,SOD含量显著升高;流式细胞检测显示高糖组细胞凋亡率较对照组明显增加,而抗氧化剂组细胞凋亡率较高糖组则显著下降。结论:氧化应激是高糖诱导心肌细胞凋亡的一个重要机制。     

丹参酮ⅡA减轻氧糖剥夺诱导心肌细胞损伤的机制

目的：丹参酮ⅡA具有广泛的心肌保护作用。AK003290是1种在心肌组织中高表达的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA),在心肌发生损伤时表达下调。本研究旨在探讨丹参酮ⅡA减轻氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)诱导心肌细胞损伤的机制。方法：以H9C2大鼠心肌细胞为研究对象,构建OGD损伤模型。采用转染siRNA的方法敲低AK003290的表达。将H9C2细胞分为6组：对照(control)组、丹参酮ⅡA(TAN)组、OGD组、丹参酮ⅡA+OGD(TAN+OGD)组、scrambled siRNA转染+丹参酮ⅡA+OGD(scrambled siRNA+TAN+OGD)组、AK003290 siRNA转染+丹参酮ⅡA+OGD(AK003290 siRNA+TAN+OGD)组。TAN组只用40μmol/L的丹参酮ⅡA预处理细胞12 h。OGD组只进行OGD处理12 h。TAN+OGD组先用40μmol/L的丹参酮ⅡA预处理12 h,再行OGD处理12 h。Scrambled siRNA+TAN+OGD组和AK003290...     

Max作用蛋白1⁃0在氧糖剥夺诱导SH⁃SY5Y细胞凋亡中的作用

目的：探讨Max作用蛋白1?0（max action protein 1?0,Mxi1?0）在氧糖剥夺（oxygen?glucose deprivation,OGD）诱导SH?SY5Y细胞凋亡中的作用。方法：利用Western blot检测SH?SY5Y细胞在OGD条件下Mxi1?0和线粒体自噬相关蛋白LC3?Ⅱ、p62、Tom20的表达水平。Mxi1?0 siRNA转染SH?SY5Y细胞,以CCK?8法和Annexin V/PI染色法检测Mxi1?0在OGD诱导细胞凋亡中的作用。结果：OGD条件下,SH?SY5Y细胞中Mxi1?0的表达先上升后下降。OGD处理使线粒体自噬相关蛋白LC3?Ⅱ表达升高,p62和Tom20蛋白表达下降。OGD条件下,Mxi1?0沉默可抑制OGD诱导的线粒体自噬,增强OGD诱导的SH?SY5Y细胞凋亡。结论：Mxi1?0通过增强线粒体自噬拮抗OGD诱导的SH?SY5Y细胞凋亡。     

胰岛素对氧糖剥夺诱导大鼠脑神经元损伤的改善作用

目的:探讨胰岛素对氧糖剥夺诱导新生大鼠脑皮质神经元损伤的改善作用.方法:将培养7 d的大鼠皮质神经元随机分为3组,A组为正常对照组,B组采用氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)处理,C组采用胰岛素预处理加OGD/R处理,B、C组在OGD/R后0、1、6、12、24 h各时间点,以MTT法检测细胞活性.采用脱氧尿嘧啶缺口末端标记法检测神经元凋亡情况,采用免疫细胞化学方法检测生长相关蛋白(GAP-43)、脑源性神经营养子(BDNF)的表达.结果:①B组的神经元细胞活性较A组明显下降,C组细胞活性明显高于B组,3组比较差异有统计学意义(P<0.05).②B组凋亡神经元细胞明显多于正常对照组,OGD/R后6、12、24 h,C组凋亡细胞数日明显少于B组,3组比较差异有统计学意义(P<0.05).③B组GAP-43、BDNF的表达较正常对照组明显增加,OGD/R后6、12、24 h,C组GAP-43、BDNF表达较B组明显增加.结论:胰岛素预处理可明显提高OGD/R后神经元的存活率,抑制神经元凋亡,使GAP-43、BDNF表达增加,实现神经元损伤的改善作用.     

七氟醚后处理对氧糖剥夺/复氧复糖诱导HT22细胞DNA损伤及SIRT1表达的影响

目的 探讨七氟醚后处理对HT22细胞氧糖剥夺/复氧复糖后DNA损伤及沉默信息调节因子1(SIRT1)表达的影响.方法 随机将对数生长期的HT22细胞分为7组:空白对照组(CON),氧糖剥夺/复氧复糖4 h组(OGD/R 4 h),氧糖剥夺/复氧复糖4 h+1％七氟醚后处理组(OGD/R 4 h+1％SEVO),氧糖剥夺...     

P53在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用

目的 探讨P53在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用.方法 将培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞随机分为4组:对照组、P53抑制剂组(葡萄糖浓度为5.5mmol/L,P53抑制剂浓度为50μmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度为25mmol/L)和高糖+P53抑制剂组(P53抑制剂浓度为50μmol/L).噻唑盐比色法(MTT法)检测心肌细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot对各组细胞P53、BAX和Caspase-3进行半定量分析.结果 与对照组相比,高糖组心肌细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,Caspase-3、BAX和线粒体蛋白P53表达增多.与P53抑制剂组相比,高糖组心肌细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,Caspase-3、BAX和线粒体蛋白P53表达增多;高糖+P53抑制剂组心肌细胞活力也有所降低,凋亡率升高,Caspase-3、BAX和线粒体蛋白P53表达增多.与高糖组相比,高糖+P53抑制剂组的心肌细胞活力增高,凋亡率明显降低,Caspase-3、BAX和线粒体蛋白P53表达减少.结论 高糖可能通过介导P53转位到线粒体激活凋亡通路,引起心肌细胞凋亡.     

缺糖缺氧对经内质网应激途径诱导Hela细胞凋亡的影响

目的：体外构建肿瘤细胞缺糖缺氧( OGD)模型,观察缺糖缺氧应激条件对肿瘤细胞凋亡的影响及其机制。方法：利用平衡盐溶液EBSS取代细胞正常培养液构建缺糖模型,利用连二亚硫酸钠消耗培养基中氧构建缺氧模型;实验分为对照组、缺糖缺氧4、8和12 h组。MTT法检测各组细胞增殖率;Western blotting检测各组Hel...     

水通道蛋白4在缺氧缺糖后水肿星形胶质细胞中的作用

目的 探讨水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)在缺氧缺糖培养后水肿星形胶质细胞中的表达变化与作用.方法 星形胶质细胞分为正常组和缺氧缺糖组,缺氧缺糖组细胞经过5 h缺氧缺糖后恢复正常条件培养至0.5、2、8、24 h和48 h 5个时间点时,用光镜观察细胞形态变化,RT-PCR及免疫荧光法测定AQP4的mRNA及蛋白的表达变化.结果 ①在缺氧缺糖后0.5 h,细胞肿胀逐渐形成并继续加重,2 h肿胀达到高峰,至8 h和24 h时肿胀逐渐消退,48 h细胞基本恢复正常形态.②RT-PCR和免疫荧光检测:在缺氧缺糖后0.5 h,AQP4 mRNA和蛋白的表达均较正常组明显下降(P<0.05),2 h回升,8 h明显超过正常水平,达最高值(P<0.05),24 h有所下降,但仍明显高于正常水平(P<0.05),至48 h时mRNA和蛋白的表达均基本恢复正常水平.结论 缺氧缺糖后星形胶质细胞水肿形成及消退期AQP4的不同表达变化可能都是细胞的一种自身保护机制,从而尽量维持细胞的正常形态和功能.     

TRPM8通过cAMP-PKA/UCP4信号调控氧糖剥夺/复糖复氧诱导的神经元凋亡

目的探究TRPM8在氧糖剥夺/复糖复氧诱导神经元PC12细胞凋亡中的分子机制。方法体外建立氧糖剥夺/复糖复氧模 型模拟脊髓缺血再灌注损伤,流式细胞仪检测PC12细胞的凋亡,RT-PCR和western blot检测TRPM8、UCP4和cAMP、p-PKA、 Bax、Bcl-2 的表达变化;向PC12 细胞分别加入AMTB（TRPM8 阻断剂）和转染UCP4 质粒,western blot 检测cAMP、p-PKA、 UCP4、Bax、Bcl-2的表达水平;抑制PKA信号,检测UCP4、Bax、Bcl-2的蛋白表达水平。结果氧糖剥夺/复糖复氧导致脊髓神经 元PC12 细胞发生凋亡,TRPM8 过表达,UCP4 表达下降,抑制cAMP-PKA 信号。抑制TRPM8 表达,则细胞凋亡减少, cAMP-PKA信号被激活,且UCP4的表达有所恢复。抑制TRPM8和cAMP-PKA信号,UCP4的表达减少,细胞凋亡增加。结论 在氧糖剥夺/复糖复氧模型中,PC12细胞TRPM8过表达,且通过cAMP-PKA/UCP4诱导神经元PC12细胞凋亡。     

莱菔硫烷对神经元氧糖剥夺/复氧损伤的保护作用

目的 探讨莱菔硫烷(SFN)对体外培养皮质神经元氧糖剥夺(OGD)/复氧(R)损伤的保护作用。方法出生O～1d的SD乳大鼠皮质神经元原代培养5～6d后,随机分为正常对照组、OGD组及SFN组。建立皮质神经元的OGD模型,1h后复氧,模拟再灌注模型,OGD/R期间给予0.1、0.5、1、2.5μmol/L SFN,复氧2...     

ClC-3氯通道调节氧糖剥夺所诱导的小胶质细胞的表型转化

目的:研究ClC-3氯通道在氧糖剥夺所致小胶质细胞表型转化中的作用?方法:应用小胶质细胞株(BV-2)制备氧糖剥夺模型,分别给予氯通道阻断剂DIDS和NPPB预处理BV-2细胞?通过MTT活性测定确定BV-2细胞损伤及药物的有效浓度;通过实时荧光定量PCR法测定细胞表型相关分子,如M1型相关分子[肿瘤坏死因子-?琢(tumor necrosis factor-?琢,TNF-?琢)?白介素-1β(interleukin 1?茁,IL-1?茁)?CD86]和M2型相关分子[转化生长因子?茁(transforming growth factor β,TGF-β)?CD206]mRNA水平的表达;通过RNA干扰的方法下调ClC-3的表达,再给予氯通道阻断剂DIDS和NPPB干预,进一步检测细胞的MTT活性,观察药物作用效果?结果:预先给予DIDS(1和10 μmol/L)和NPPB(1 μmol/L)能够改善氧糖剥夺所诱导的BV-2细胞MTT活性下降,抑制M1型相关分子如TNF-?琢?IL-1?茁和CD86的表达并促进M2型相关分子(TGF-?茁和CD206)的表达;通过RNA干扰下调ClC-3的表达,能够消除DIDS和NPPB的作用?结论:ClC-3氯通道参与调控氧糖剥夺所致小胶质细胞的表型转化,阻断ClC-3氯通道抑制氧糖剥夺诱导小胶质细胞向M1型转化?     

氧糖剥夺损伤后细胞上清中IL-1促进正常血管平滑肌细胞增殖及迁移

血管平滑肌细胞(VSMC)的过度增殖和迁移是多种心血管疾病共同的病理基础。VSMC不仅具有调节血管收缩的作用,同时还参与细胞外基质的合成与分泌,进而影响血管功能[1-2]。     

沉默ANGPTL2对氧—葡萄糖剥夺/复氧诱导的HT22细胞氧化应激及凋亡的影响

目的 探究沉默血管生成素样蛋白2(angiopoietin-like protein 2,ANGPTL2)对氧-葡萄糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)诱导的神经元细胞(hippocampal neuronal cell line, HT22)细胞氧化应激及凋亡的影响。方法 通过OGD/R处理建立小鼠海马HT22细胞模型。通过实时荧光定量聚合酶链反应、细胞计数试剂盒、末端标记法及试剂盒检测ANGPTL2 mRNA的含量、细胞活力、细胞凋亡、细胞乳酸盐脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)水平及细胞氧化应激。通过蛋白质印迹检测各种蛋白质含量。结果 与对照组比较,模型组ANGPTL2 mRNA表达水平、LDH、凋亡率、ROS、MDA、核苷酸寡聚化结构域样受体家族3(nucleotide oligomeric domain-like receptor family 3,NLRP3)及凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein contain...     

低浓度凝血酶预处理对星形胶质细胞氧糖剥夺损伤的影响

目的:研究低浓度凝血酶(TB)预处理对培养的鼠脑星形胶质细胞(As)在氧糖剥夺(OGD)诱导损伤后的影响.方法:原代培养的大鼠大脑皮层AS,预先用不同低浓度(0.005～5.000 kU/L)的TB处理(TB预处理,TPC),观察在缺糖和缺氧(氧糖剥夺)培养状态下细胞的功能状态和损伤情况.以四甲基偶氮唑盐(MTT)还原试验检测细胞活力,乳酸脱氢酶(LDH)漏出率作为细胞损伤指标,流式细胞术检测细胞凋亡发生率,[3H]-谷氨酸摄取法测定As对谷氨酸(Glu)摄取能力的变化.结果:OGD引起细胞活力下降,LDH漏出率增高,OGD诱发细胞凋亡,降低As对Glu的摄取,上述指标与正常对照组相比均具有统计学意义(P＜0.01);而经低浓度TB预处理后,OGD损伤造成的LDH漏出率较低,细胞凋亡发生率降低,同时MTT值提高,As对Glu的摄取也增高,与OGD组比较有统计学意义(P＜0.05),其中最佳TB效应剂量为0.10 kU/L.结论:低浓度TB预处理的As,可增强在OGD环境下的损伤耐受能力,具有细胞保护作用.     

黄芪甲苷通过激活自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞凋亡

目的研究黄芪甲苷通过激活细胞自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导PC12细胞凋亡的作用。方法取对数生长期的PC12细胞,随机分为7组:正常对照组、模型组、溶媒组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组、自噬激活剂组。除正常对照组外,其余各组剥夺氧、糖3h后再复氧、复糖12 h,并于复氧、复糖的同时给予相应药物处理。用透射电镜观察自噬小体的变化,Western blot检测LC3-II、Beclin1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)的表达,流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡。结果与正常对照组相比,模型组出现典型的自噬小体,LC3-II、Beclin1表达均增多(P0.05),同时Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数也升高(P0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷组、自噬激活剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达均增多(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数均下降(P0.05);而自噬抑制剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达减少(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数升高(P0.05);溶媒组与模型组之间无显著差异(P0.05)。与黄芪甲苷组相比,黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达均减少(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数均升高(P0.05)。结论黄芪甲苷可通过激活细胞自噬而抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。     

二苯乙烯苷对大鼠原代皮层神经元氧糖剥夺损伤的保护作用

目的：探讨二苯乙烯苷对大鼠皮层神经元氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)损伤的作用。方法：取孕18 d的Sprague-Dawley胎鼠皮层神经元培养7～8 d,进行OGD损伤,同时分别加入二苯乙烯苷(10、20、40μg/mL)和尼莫地平(2.5μg/mL)进行处理。设置空白对照组、OGD组、OGD并加药组(二苯乙烯苷10、20、40μg/mL)以及OGD并尼莫地平阳性对照组。损伤6 h后,用噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法检测细胞活力,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)法检测LDH释放量,末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling,TUNEL)法检测细胞的凋亡,免疫蛋白印迹(Western Blot)法检测Toll 样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、核转录因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)及其抑制因子IκB和磷酸化的IκB(p-IκB)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、p38及磷酸化的p38(p-p38)的蛋白表达。结果：OGD损伤后大鼠皮层神经元细胞活力显著降低,LDH释放量明显增多,细胞凋亡显著增多;二苯乙烯苷和尼莫地平均可显著抑制这一趋势。 OGD损伤引起TLR4、NF-κB、p-IκB/IκB、p-p38/p38和IL-6的异常高表达,二苯乙烯苷明显抑制这些蛋白表达。结论：二苯乙烯苷对OGD诱导的原代皮层神经元损伤的保护作用可能是通过抑制TLR4-NF-κB炎症信号通路和p38通路发挥抗炎抗凋亡效应的。