人抗凝血酶Ⅲ生产工艺中病毒灭活/去除效果的验证

目的验证和评价人抗凝血酶Ⅲ(human antithrombin Ⅲ, AT-Ⅲ)生产工艺中有机溶剂/去污剂(solvent/detergent, S/D)法联合纳米膜过滤法灭活/去除病毒的可行性。方法采用S/D法作为AT-Ⅲ病毒灭活工艺, 纳米膜过滤法(20 nm孔径)作为其病毒去除工艺, 分析病毒灭活/去除工艺对AT-Ⅲ活性的影响;以伪狂犬病毒、辛德毕斯病毒、猪细小病毒、脑心肌炎病毒作为指示病毒, 对上述工艺进行病毒灭活/去除工艺效果的验证。结果 S/D法联合纳米膜过滤法可有效灭活/去除脂包膜病毒和非脂包膜病毒, 指示病毒滴度下降均>4 lg;且AT-Ⅲ的生物活性及其他各项指标未发生明显改变, 活性变化<10%。结论研究建立的S/D法联合纳米膜过滤法可有效灭活/去除AT-Ⅲ中的指示病毒, 该方法为凝血因子类制品的病毒灭活验证工艺提供了参考。     

人凝血因子Ⅷ血液制品中的病毒灭活与验证

目的 研究人凝血因子Ⅷ制备过程中S/D病毒灭活法和80℃、72 h干热灭活法的病毒灭活工艺的灭活效果。方法 经过S/D法及80℃、72 h干热法双重处理灭活病毒,并通过加入指示病毒(PRV、Sindbis、HIV、EMCV、PPV)验证病毒灭活效果。结果 上述工艺可有效灭活脂包膜和非脂包膜病毒。最终制品中TNBP残余量小于1/10万(10 ppm)、吐温-80(Tween-80)残余量小于1/万(100 ppm),符合安全标准,人凝血因子Ⅷ的生物活性及其他各项指标未发现明显变化。结论 可以作为人凝血因子Ⅷ实验过程中的病毒灭活方法。     

气相色谱内标法测定人抗凝血酶Ⅲ磷酸三丁酯残留量

<正>人抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ,AT-Ⅲ)是血液中重要的抗凝血因子,可抑制血液中75%的凝血酶活力,使激活的FⅨ、FⅩ、FⅪ和FⅫ失去活性。AT-Ⅲ水平降低时,血浆抗凝血活性降低,易形成血栓。自1974年AT-Ⅲ试用于临床以来,其疗效及适应证也日益增多[1-3]。冻干AT-Ⅲ为人血液制品,其病毒灭活工艺采用S/D法,此工艺中加入的磷酸三丁醋(tri(n-butyl)phosphate,TBP)对包膜病毒有显著的灭活效     

静脉注射人免疫球蛋白工艺中的病毒灭活方法初探

 目的   研究静脉注射人免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin,IVIG）工艺中辛酸处理联合20 nm膜过滤的病毒灭活/去除方法。方法   分别将脂包膜Sindbis病毒和伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）加入pH(4.6±0.1)和pH(5.3±0.1)IVIG中间品（辛酸沉淀后上清液）,在(7.47±0.39)、(14.47±0.39)和(22.47±0.39) mmol/L辛酸条件下维持(25±1) ℃处理120 min;将非脂包膜猪细小病毒（porcine parovirus,PPV）加入pH(6.0±0.2)IVIG中间品（层析流穿液）,用20 nm膜过滤。检测所有样品处理前后的病毒滴度。 结果   (25±1) ℃处理120 min后,pH(4.6±0.1) IVIG中间品经(7.47±0.39)和(14.47±0.39) mmol/L辛酸钠处理后的残余病毒滴度均≤0.50lg,pH(5.3±0.1) IVIG中间品分别经(14.47±0.39)和(22.47±0.39) mmol/L辛酸处理后的残余病毒滴度均≤0.50lg;20 nm膜过滤可使IVIG中间品的PPV滴度下降≥4.00lg。2种处理方法的结果均符合相关规定的要求。结论   在一定条件下,辛酸处理联合20 nm膜过滤可有效灭活/去除IVIG生产过程的相关病毒。     

纳米膜过滤和低pH孵放法去除/灭活静注人免疫球蛋白中病毒效果的验证

目的:验证纳米膜过滤法和低pH孵放法去除/灭活静注人免疫球蛋白中病毒的效果。方法:纳米膜过滤法选用猪细小病毒为指示病毒,低pH孵放法选用水疱性口炎病毒、辛德比斯病毒、HIV和伪狂犬病毒为指示病毒,高浓度静注人免疫球蛋白在pH4.6～5.0、30～32 ℃条件下作用不同时间后,取样检测样品中残余病毒滴度以评价病毒灭活效果...     

透明质酸钠原料病毒灭活/去除工艺的研究

目的对鸡冠来源的透明质酸钠病毒灭活/去除工艺进行验证。方法根据生产所用鸡冠确定其可能携带的病毒种类,选择呼肠孤病毒Ⅲ型、伪狂犬病毒、水泡性口炎病毒和猴空泡病毒40作为相关的指示病毒。对透明质酸钠原料的制备工艺进行分析,确定透明质酸钠原料制备工艺中加热灭活工艺作为可能灭活/去除病毒的工艺,并进行病毒灭活/去除效果的验证。结果呼肠孤病毒Ⅲ型、伪狂犬病毒、水泡性口炎病毒和猴空泡病毒40经加热灭活处理的平均灭活对数值分别为≥5.688,≥5.375,≥6.542,≥7.125。透明质酸钠加热灭活工艺可有效灭活病毒。结论透明质酸钠加热灭活工艺可作为透明质酸钠制备过程中灭活病毒工艺,能有效保证产品的安全性。     

血液制品中的痘苗病毒对S/D法灭活的抵抗力

考虑到血液制品及细胞制备的生物制品具有传播病毒〔如乙型肝炎病毒 ( HBV)、丙型肝炎病毒 ( HCV)和人类免疫缺陷病毒( HIV)〕的危险性 ,因此在制备过程运用了去除病毒和灭活病毒的工艺。常用的灭活病毒方法为溶剂 /去污剂 ( S/D)法 ,此法是应用磷酸丁酯 ( TNBP)及非离子型去污剂 (如Tween80或 Triton X- 1 0 0 )处理中间产物 ,然后在后续步骤中将这些化学试剂去除。S/D法能有效灭活各种血液制品中的许多有包膜病毒 ,但对无包膜的病毒则无效。　　作者将 S/D与两种高纯度凝血因子因子 ( Replenate)和因子 ( Replenine)一起培育…     

血液制品生产中人细小病毒B19安全性风险及控制策略

血液制品因其原料特殊性，具有血源性病毒传播的风险。近20年来，随着病毒安全性控制技术的进步，血液制品传播HIV、HBV、HCV等主要病毒的风险已得到有效控制。人细小病毒B19（human parvovirus B19，B19V）等非脂包膜病毒已成为目前血液制品病毒安全性风险控制的焦点问题。与其他动物的细小病毒相比，B19V对酸、热更敏感，且因合并血浆中存在的B19V中和抗体，纳米过滤去除B19V的效果远优于对动物细小病毒的去除，通过合理优化病毒灭活条件，可有效灭活/去除B19V。此文就血液制品中B19V的现状和灭活/去除工艺研究进展做一综述。     

保证血液制品安全性的有效措施(下)

3．1．5有机溶剂／去污剂处理有机溶剂／去污剂混合物(S/D)破坏包膜病毒的脂膜,一旦破坏脂膜病毒不可能再与感染细胞结合。该法不能灭活非包膜病毒。已应用的典型灭活条件是0．3％磷酸三丁酯(TNBP)和1％非离子去污剂,吐温-80或Triton X-100,在24℃用Triton X-100处理至少4 h,或用吐温-80处理至少6 h。当用TNBP／Triton X-100时,某些制剂在4℃处理获得了成功。高脂含量可能影     

碱处理法在人神经生长因子注射液制备中的应用

目的进一步提高人神经生长因子(hNGF)注射液的安全性,寻找碱处理灭活制品中可能存在脂包膜和非脂包膜病毒的最佳工艺。方法在hNGF注射液中间品中加入脂包膜和非脂包膜病毒,通过调整其pH值、蛋白质浓度等参数后,在25℃下的不同时间,监测其灭活病毒效果。结果在pH(12.0±0.1)、(25±1)℃条件下存放2h,可有效灭活加入的脂包膜和非脂包膜病毒,且其他相关指标也达到要求。结论碱处理法是同时灭活生物制品中脂包膜和非脂包膜病毒的1种经济、有效的方法。     

我国与WHO血液制品去除/灭活病毒技术方法与验证指导原则的比较研究

目的：比较我国现行《血液制品病毒去除/灭活验证指导原则》[国药监注（2002）160号]与世界卫生组织（WHO）《血液制品病毒去除/灭活验证指南》，旨在推动我国血液制品病毒风险控制与管理水平的提高及血液制品的合理应用。方法：从去除/灭活病毒方法的选择、常用去除/灭活病毒方法评价、特定的去除/灭活病毒方法验证、生产工艺去除/灭活病毒能力、去除/灭活病毒方法再验证、临床试验、输血用病毒灭活血浆和正在开发的新型病毒灭活方法等几个方面进行比较，对血浆及其制品生产工艺中病毒灭活/去除的相关方法及其验证进行研究。结果与结论：我国现行《血液制品病毒去除/灭活验证指导原则》与WHO《血液制品病毒去除/灭活验证指南》总体要求基本一致，对我国血液制品去除/灭活病毒技术方法与验证工作仍具有适用性和指导性。     

抗汉城病毒荧光单克隆抗体的制备及初步应用

目的 制备抗汉城病毒（Seoul virus,SEOV）荧光单克隆抗体（单抗）,并初步应用于Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗原液的病毒灭活验证。 方法  以SEOV L-99株灭活病毒原液为免疫原,采用小鼠杂交瘤细胞融合技术,筛选抗SEOV特异性单抗杂交瘤;小鼠体内诱生法制备单抗腹水,蛋白A亲和层析纯化单抗,并以蛋白质印迹法鉴定其特异性;间接ELISA测定单抗效价和相对亲和力;纯化单抗采用搅拌法标记异硫氰酸荧光素,并分别采用直接免疫荧光法与小鼠脑内接种法对Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗原液进行病毒灭活验证。结果 共筛选出4株特异性抗SEOV L-99株杂交瘤1D5、2E3、3A4及5B7。蛋白质印迹法鉴定4株单抗均与SEOV L-99株核衣壳蛋白发生特异性反应;间接ELISA测定腹水效价为3.13×10^-8~ 1.25×10^-7;相对亲和力顺序为1D5>3A4>2E3>5B7;纯化抗体纯度>95%;异硫氰酸荧光素标记1D5株单抗的结合比率为3.4;直接免疫荧光法与小鼠脑内接种法检测盲传3代的Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗原液,病毒灭活验证结果一致。结论 成功筛选到高效价特异性抗SEOV单抗,并制备成荧光单抗,可用于Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗生产工艺中的病毒灭活验证。     

恒温水浴工艺步骤灭活小牛血去蛋白提取物病毒效果的验证研究

目的:验证小牛血去蛋白提取物中间品生产工艺中60℃水浴7小时对产品所携带病毒的灭活效果,确定小牛血去蛋白提取物生产中病毒灭活措施的有效性.方法:选用不同核酸类型的脂包膜病毒,其中RNA病毒为水疱性口炎病毒(VSV),DNA病毒为伪狂犬病毒(PRV),以及不同核酸类型的非脂包膜病毒,其中RNA病毒为呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo...     

灭活前后HIV-1生物学性状改变的研究

S/D法及低 p H法是常用的血制品灭活病毒的有效方法。在评价 S/D法及低 p H法灭活 HIV试验中 ,发现不病变样品经盲目传代可以传出病变 ,说明 HIV在灭活因素作用下发生变异。 HIV具有高度的变异性 ,不同地区不同机体 ,同一机体不同病程 ,甚至同一机体一次取样均可分离到不同基因型不同生物学性状的 HIV株 [1 ]。我们曾在 MT4细胞长期自然传代培养 HIV,分析 HIV包膜基因变异及生物学性状改变 ,获得体外传代 HIV包膜基因变异不显著 ;病毒感染毒力及病毒产量上升 ;亚型不变 ,生物学性状相对稳定的结论。为了进一步了解灭活作用下 H…     

短波紫外线对人凝血因子Ⅷ中猪细小病毒灭活的研究

目的 研究短波紫外线(short-wave ultraviolet-C,UV-C)对人凝血因子Ⅷ(human coagulationfactor Ⅷ,FⅧ)中猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)的灭活的效果.方法 将PPV作为指示病毒与FⅧ中间品混合,用紫外灭活仪UVivatec分别以200、300和400 J/m2 UV-C进行灭活.将UV-C灭活的FⅧ接种ST细胞并进行培养,采用细胞病变(cytopathic effect,CPE)法检测病毒,并以Reed-Muench法计算病毒滴度.对所有UV-C灭活后未出现CPE的样品盲传3代,验证灭活效果;同时对UV-C灭活前后的FⅧ活性进行检测.结果 3个照射剂量的UV-C灭活后,FⅧ中的PPV滴度降低均不低于每0.1 ml4.62lg半数组织培养感染剂量,所有未出现CPE的样品盲传至第3代均未检到病毒.UV-C灭活的FⅧ的活性无明显降低,且各项质量指标均符合药典的要求.结论 UV-C可有效灭活无包膜病毒PPV,且对FⅧ活性无明显影响.     

高滴度呼肠孤病毒3型的制备及滴度检测

 目的   制备高滴度呼肠孤病毒3型（reovirus 3,Reo-3）病毒液,并检测Reo-3滴度。 方法   以幼仓鼠肾细胞（BHK-21）为病毒培养基质和滴度测定细胞。将Reo-3按10⁰至10^-5感染复数（MOI）接种BHK-21,再分别用细胞病变法和蚀斑形成法检测病毒,用Karber法计算病毒滴度。 结果   BHK-21感染Reo-3后能产生明显病变。以10^-4 MOI的Reo-3接种后48 h,收获液中病毒滴度最高,细胞病变法检测为9.625 lgTCID50/ml,蚀斑形成法检测为8.671 lgPFU/ml。 结论   制备了高滴度Reo-3,为开展该病毒去除灭活研究奠定了基础。     

活性炭逆转利伐沙班对凝血试验干扰的效果评价

目的 评价活性炭逆转利伐沙班对凝血试验干扰的效果。方法 取体检人群临床常规凝血项目检测后的枸橼酸钠抗凝血样本,每次方便抽取20例,重复24次,共纳入480例。将20例血浆样本混合配置成正常混合血浆（NPP）,取1 mL NPP为N1组;NPP经活性炭处理后为N2组;NPP加入不同质量浓度的利伐沙班为N3组：100 μg/L（N3A组）、200 μg/L（N3B组）、300 μg/L（N3C组）、400 μg/L（N3D组）,每个质量浓度重复6次;N3组经活性炭处理后为N4组。收集急诊科首次使用利伐沙班治疗的患者22例,首次服用利伐沙班前6 h和后6 h采集血样分别为S1组和S2组,S2组经活性炭处理后为S3组。液相色谱-联用串联质谱测定N3组和S2组的利伐沙班质量浓度。检测N1、N2、N3、N4组凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）及纤维蛋白原（FIB）水平,蛋白C（PC）、蛋白S（PS）、抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）以及凝血因子FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ活性和N1、N2、N3、N4、S1、S2和S3组抗Xa因子（Anti-Xa）活性。结果 与N1组比较,N2组PT、APTT、INR、FIB、PC、PS、AT-Ⅲ、Anti-Xa、FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ活性差异无统计学意义;N3组PT、APTT延长,INR水平,PS、AT-Ⅲ和Anti-Xa活性升高,FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ活性降低（P<0.01）,PC活性及FIB水平差异无统计学意义;N4组APTT延长,PS、FⅤ、FⅧ、FⅪ、FⅫ活性降低（P<0.01）。与N3组比较,N4组PT、APTT缩短,INR水平,PS、AT-Ⅲ和Anti-Xa活性明显降低,FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ活性升高（P<0.01）,FIB水平和PC活性差异无统计学意义。与S1组比较,S2组Anti-Xa活性升高,APTT延长;S3组APTT延长（P<0.01）;与S2组比较,S3组Anti-Xa活性降低,APTT缩短。N3A、N3B、N3C和N3D组PT、INR、APTT、PS水平及Anti-Xa活性逐次升高,FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅪ活性逐次降低（P<0.01）;N3组、S2组利伐沙班质量浓度与Anti-Xa活性呈正相关（r_s分别为0.989、0.969,P<0.01）。结论 活性炭能有效去除血浆中的利伐沙班,可以逆转由利伐沙班引起的异常凝血指标。     

降纤酶制备中层析工艺对病毒去除能力研究

目的:研究降纤酶制备中层析工艺对脂包膜指示病毒伪狂犬病毒(PRV)和水疱性口腔炎病毒(VSV)的去除能力,为该产品的病毒安全性评价提供依据.方法:用微量滴定法测定层析工艺处理前后各批次样品中PRV和VSV的滴度,按Karber法计算病毒滴度,并计算层析处理前后各批次样品中各指示病毒的滴度下降值.结果:层析填料(使用≥1...     

动物源性透明质酸钠的病毒灭活工艺

为确保动物组织来源透明质酸钠的安全性,本研究选择有效的病毒灭活工艺并进行验证。所用动物组织为鸡冠,选择小鼠脑脊髓炎病毒、水泡性口炎病毒、猴空泡病毒40和伪狂犬病毒作为相关的指示病毒。选择透明质酸钠制备工艺中的酶解工艺作为可能灭活病毒的工艺,酶解工艺对小鼠脑脊髓炎病毒、水泡性口炎病毒、猴空泡病毒40和伪狂犬病毒的平均灭活对数值分别为6.125、5.438、5.792和5.250 lgTCID50/0.1 ml。     

核糖核酸Ⅱ制备及其病毒灭活工艺的验证

目的从牛胰脏制备核糖核酸Ⅱ(RNAⅡ),对巴氏灭活法灭活病毒工艺进行验证。方法以苯酚、氯仿抽提法制备,以猪细小病毒(PPV)为指示病毒,观察用巴氏灭活法(60℃,10h)灭活RNAⅡ原液中病毒的效果,用纯度、A260/A280比值、紫外特征峰、完整性、含量变化考察灭活前后制剂变化。结果制备了纯度和活性均较好的RNAⅡ,PPV滴度为7.7logTCID50/0.1mL时灭活液中未检测出PPV,经盲传3代,亦未发现特异性细胞病变,灭活前后制剂无质的变化。结论可以现行方法从牛胰脏制备较高纯度RNAⅡ,巴氏法能对RNAⅡ溶液作有效的病毒灭活处理。