诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞的分化

背景:骨髓间充质干细胞可向成骨细胞、脂肪细胞等多个方向分化,建立稳定可靠的诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的方法可为该细胞用于骨质疏松症等骨骼系统相关疾病的防治研究提供保证。目的:探讨骨髓间充质干细胞在体外定向分化为脂肪细胞的适宜诱导条件。方法:无菌条件下分离大鼠股骨,密度梯度离心法与贴壁培养法相结合分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养。第3代骨髓间充质干细胞完全汇合后,利用含有3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛、地塞米松、胰岛素及胎牛血清的DMEM低糖培养液定向诱导骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。结果与结论:①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的骨髓间充质干细胞,经过诱导可定向分化成脂肪细胞。②在3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛、地塞米松诱导的条件下,采取间断诱导方法,骨髓间充质干细胞在体外可定向分化为脂肪细胞。③实验中用5×10-4mol/L IBMX,2×10-4mol/L吲哚美辛,10-4mol/L地塞米松诱导间充质干细胞的成脂分化效果较好。提示骨髓间充质干细胞经含0.1mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10mg/L胰岛素、0.1mmol/L吲哚美辛、1μmol/L地塞米松、体积分数为10%胎牛血清的DMEM分化诱导液定向诱导可获得较好的成脂分化效果。     

脐血间充质干细胞的分离培养及生物学特性

背景：脐血富含干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。目的：建立一种分离纯化、培养扩增脐血间充质干细胞的方法,并观察体外培养脐血间充质干细胞的生物学特性。方法：密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化脐血间充质干细胞。观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期,以免疫组织化学法（SP 法）测定 CD29,CD44,CD34。采用体积分数 20%马血清诱导脐血间充质干细胞分化为脂肪细胞,以油红 O 染色鉴定;0.1 μmol/L 地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸钠和 50 μmol/L 抗坏血酸诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞,以碱性磷酸酶染色鉴定。结果与结论：分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,间充质干细胞呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养 9 代,未发生形态学改变,无衰老征象。第 3 代间充质干细胞体外可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。提示采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,脐血间充质干细胞体外增殖和传代能力强。     

脐血间充质干细胞的分离培养及生物学特性

背景:脐血富含干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。目的:建立一种分离纯化、培养扩增脐血间充质干细胞的方法,并观察体外培养脐血间充质干细胞的生物学特性。方法:密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化脐血间充质干细胞。观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期,以免疫组织化学法(SP 法)测定 CD29,CD44,CD34。采用体积分数 20%马血清诱导脐血间充质干细胞分化为脂肪细胞,以油红 O 染色鉴定;0.1 μmol/L 地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸钠和 50 μmol/L 抗坏血酸诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞,以碱性磷酸酶染色鉴定。结果与结论:分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,间充质干细胞呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养 9 代,未发生形态学改变,无衰老征象。第 3 代间充质干细胞体外可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。提示采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,脐血间充质干细胞体外增殖和传代能力强。     

大鼠骨髓间充质干细胞分化成脂肪细胞的定向诱导

背景:研究表明骨质疏松症可能是间充质干细胞分化失衡后过多地向脂肪细胞分化所致.因此,探讨骨髓间充质干细胞成脂分化的影响因素对骨质疏松症防治具有重要意义.目的:分析骨髓间充质干细胞在体外定向分化为脂肪细胞的适宜诱导条件.设计、时间及地点:以细胞为对象,重复观察测量实验,于2007-10/2008-07在广东医学院药理教研室完成.材料:1月龄SD雄性大鼠由广东医学院实验动物中心提供.方法:无菌条什下分离大鼠股骨,密度梯度离心法与贴肇培养法相结合分离、纯化骨髓间充质干细胞并存体外进行培养.第3代骨髓间充质干细胞完全汇合后,利用内含0.1 mmoL/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.1 mmoL/L吲哚美辛、1μmol/L地塞米松、不同浓度胰岛素及胎牛血清的DMEM定向诱导骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞.主要观察指标:①倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态特征.②油红○染色检测骨髓间充质干细胞成脂肪分化情况.结果:①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的骨髓间充质干细胞.②体积分数为0.05和0.1胎牛血清均能获得较好的成脂分化效果,胎牛血清体积分数增至0.2反而抑制骨髓间充质干细胞成脂分化(P<0.01).③10mg/L胰岛素可获得较好的成脂分化效果,胰岛素质黾浓度提高到20,40 mg/L并不能增加骨髓间充质干细胞的成脂分化效果(P>0.05).④低糖(含葡萄糖1 g/L)和高糖(含葡萄糖4.5 g/L)DMEM对骨髓间充质干细胞的成脂分化无影响(P>0.05).结论:骨髓间充质干细胞经内含0.1 mmoL/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10mg/L胰岛素、0.1 mmoL/L吲哚美辛,1 μmoL/L地塞米松、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM分化诱导液定向诱导可获得较好的成脂分化效果.     

特定微环境条件下人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞

背景:目前研究主要是利用大鼠等动物模型来探讨如伺生成脂肪细胞,对于体外分离培养的人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞表型转化的实验报道不多.目的:拟在体外建立人骨髓充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的实验方法.设计、时间及地点:细胞形态学体外观察,于2006-12/2007-11在山东省青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.材料:骨髓来源于青岛大学医学院附属医院行自体干细胞移植治疗糖尿病患者的骨髓血,IBMX,地塞米松,吲哚美辛,胰岛素等诱导剂为Sigma公司产品.方法:无菌条件下抽取骨髓血,联合应用密度梯度离心法及贴肇筛选法,以单克隆形式分离培养入骨髓间充质干细胞,当细胞汇合至90%时胰蛋白酶消化传代.取第3代骨髓间充质干细胞,加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素、1 μmol/L地寒米松、10mg/L胰岛索、O.5mmol/L IBMX、50 μmolL吲哚美辛的低糖DMEM培养基,作为体外特定微环境向脂肪细胞方向诱导分化,以单纯加入低糖DMEM培养基的细胞作为对照组.诱导3周后行油红O染色.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的形态变化及细胞表面标志鉴定,脂滴形成及脂肪细胞分化率.结果:接种后第2～3天骨髓间充质干细胞开始贴壁,两端有较长突起,呈克隆样生长,形成大小不一的集落;传代后骨髓间充质干细胞呈长梭形,漩涡样牛长;第3代细胞CD44呈阳性,不表达CD34:由克隆扩增出的骨髓间充质干细胞具有高度的同源性.诱导第3周油红O染色示胞核呈蓝色,脂滴呈橙红色,脂肪细胞分化率为(86.0 5.6)%,对照组未见脂滴形成.结论:含有地寒米松、IBMX及胰岛素等诱导剂的体外特定微环境对骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞具有诱导促进作用.     

骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化

背景：骨碎补促进骨损伤愈合疗效确切,但具体作用机制尚不清楚。目的：观察骨碎补总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响。方法：冲洗兔股骨和胫骨骨髓腔获取骨髓,采用密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增兔骨髓间充质干细胞;以四甲基偶氮唑蓝法测定不同浓度骨碎总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖的影响;经骨碎补总黄酮体外诱导后,行扫描电镜形态学观察,碱性磷酸酶染色、茜素红染色和VonKossa银染色了解细胞钙化情况。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞可以通过密度梯度离心法联合贴壁培养法扩增和纯化;含骨碎补总黄酮血清培养后,四甲基偶氮唑蓝测定结果显示,骨碎补总黄酮浓度为10-6mmol/L时可明显促进兔骨髓间充质干细胞增殖。经骨碎补总黄酮诱导液诱导,扫描电镜下可见成骨细胞样形态和钙结节形成;细胞碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色和VonKossa银染色均呈阳性,提示骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞增殖和分化。     

骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化

背景:骨碎补促进骨损伤愈合疗效确切,但具体作用机制尚不清楚。目的:观察骨碎补总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响。方法:冲洗兔股骨和胫骨骨髓腔获取骨髓,采用密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增兔骨髓间充质干细胞;以四甲基偶氮唑蓝法测定不同浓度骨碎总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖的影响;经骨碎补总黄酮体外诱导后,行扫描电镜形态学观察,碱性磷酸酶染色、茜素红染色和VonKossa银染色了解细胞钙化情况。结果与结论:兔骨髓间充质干细胞可以通过密度梯度离心法联合贴壁培养法扩增和纯化;含骨碎补总黄酮血清培养后,四甲基偶氮唑蓝测定结果显示,骨碎补总黄酮浓度为10-6mmol/L时可明显促进兔骨髓间充质干细胞增殖。经骨碎补总黄酮诱导液诱导,扫描电镜下可见成骨细胞样形态和钙结节形成;细胞碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色和VonKossa银染色均呈阳性,提示骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞增殖和分化。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养向成骨和成脂方向的诱导分化

目的：骨髓间充质干细胞是存在于骨髓组织中多种干细胞的混和体，因其具有取材方便、扩增迅速、可自体移植并且具有多分化潜能等特点，是近年研究的热点。实验建立了体外分离、培养及鉴定兔骨髓间充质干细胞的方法，并通过此进一步验证其诱导成骨及成脂多向分化的潜能。 方法：实验于2006-08/2007—06在吉林大学药学院生物工程实验室完成，实验室属吉林大学重点实验室。①实验材料：四五月龄新西兰大白兔2只，由吉林大学基础医学院动物培养中心提供，体质量1．0～1．5kg，雌雄不限，实验动物级别为二级，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：实验应用了密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法从兔股骨、胫骨中分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养，以形态学及细胞表面标志的方法鉴定间充质干细胞，在倒置显微镜下观察细胞的形态特征，并利甩成骨诱导剂包括0．1μmol／L的地塞米松、50mg/L的维生素C、10mmol／L β-磷酸甘油钠和成脂诱导剂含10％FBS的L．DMEM、0．25μmol／L地塞米松、50μmol／L吲哚美辛、0．5mmol／LIBMX、10mg／L牛胰岛素诱导其向软骨细胞及脂肪细胞分化。 结果：①经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形，类似于成纤维细胞，骨髓间充质干细胞均一地表达CD29、CD44，而CD34、CD45均阴性表达。②成骨诱导14d后细胞不明显，未形成钙结节，21d后碱性磷酸酶钙钴法染色后大多数细胞的胞质呈棕黑色。③成脂诱导48h后，细胞内有小脂滴出现，2周后脂滴数量增加并相互融合，细胞（有）由长梭形变为圆形或多边形，油红O染色显示有大量脂质沉积。 结论密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法是比较理想的骨髓间充质干细胞培养法，骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分?     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、纯化与培养适宜条件的筛选

目的:为获得大量、高纯度的骨髓间充质干细胞,筛选体外分离、纯化和培养的适宜条件。方法:实验于2006-08/2007-07在解放军兰州军区兰州总医院进行。①实验材料:2月龄SD大鼠,雄性,体质量(100±20)g,由解放军兰州军区兰州总医院实验动物科提供。②实验方法:分别采用全骨髓法(贴壁筛选法)和密度梯度离心法分离和纯化大鼠骨髓间充质干细胞。将采用密度梯度离心法获得的单个核细胞按1×107,1×108,1.5×108,2×108,1×109,2×109L-1的接种密度分别分成1～6组,接种在24孔板内,每组接种6孔。比较细胞出现伸展时间、原代培养时间。于细胞接种后第1,2,3,4,5,6天进行首次换液。将换下的部分细胞置于新的培养皿中进行培养,至少培养3d,观察是否还有新的贴壁细胞出现,以确定首次换液时间。观察体积分数为0.10,0.12,0.15,0.18,0.20血清对原代及传代后细胞生长的影响,比较不同浓度血清中细胞数量、集落形成率。集落形成率=集落数目/接种细胞数目×100%。采用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞细胞周期。选取第5代扩增的骨髓间充质干细胞,接近完全融合后进行成骨和成脂肪诱导培养。诱导剂分别为:10nmol/L地塞米松、0.05nmol/L抗坏血酸及10nmol/Lβ-甘油磷酸钠;1μmol/L地塞米松、0.5mmol/LIBMX、0.01mmol/L人胰岛素、0.01mmol/L吲哚美辛。并设未加诱导剂培养液培养的骨髓间充质干细胞对照。③实验评估:采用碱粒酶测定成骨诱导后细胞,采用油红O染色鉴定成脂肪诱导后细胞。结果:①细胞出现伸展时间、原代培养时间:密度梯度离心法培养细胞出现伸展时间与全骨髓法相比,差异无显著性意义。密度梯度离心法原代培养时间较全骨髓法长[(9.41±1.11),(14.73±2.86)d,P<0.05]。②不同接种密度对密度梯度离心法所获细胞生长影响:1×109L-1组细胞出现伸展时间及原代培养细胞融合时间较早。1×107L-1组培养20d内不能传代。③首次换液时间对细胞生长的影响:第5天开始在换下的液体中,很少有再贴壁的细胞出现。因此首次换液时间应为第5天。④不同体积分数血清对细胞生长的影响:在其他条件相同的前提下,骨髓间充质干细胞在含体积分数为0.12胎牛血清中细胞集落形成率最高。⑤成骨及成脂诱导:成骨诱导的骨髓间充质干细胞经碱粒酶测定,结果钙化结节呈蓝色。成脂诱导的骨髓间充质干细胞经油红O染色,苏木精-伊红复染后胞内脂滴呈桔红色,核呈蓝色。结论:采用密度梯度离心法分离纯化的骨髓间充质干细胞以1×109L-1密度接种,在含体积分数为0.12胎牛血清的MEM培养基中培养,生长状况良好,增殖速度快。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肝细胞样细胞

背景:目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少.目的:观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响.方法:采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,反复贴壁法纯化扩增骨髓间充质干细胞;采用Ⅰ型胶原酶消化法分离孕3周大鼠胚胎肝脏细胞,差速贴壁法纯化肝脏细胞;阴性对照组骨髓间充质干细胞只加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基.诱导组在阴性对照组基础上加入一定浓度肝细胞生长因子或者与胎肝细胞共培养进行诱导分化.结果与结论:诱导组白蛋白、甲胎蛋白水平均高于非诱导组(P < 0.01),诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18阳性,而非诱导组糖原染色、CK-18均阴性.结果显示肝细胞生长因子和胎肝细胞均可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞.     

骨髓间充质干细胞动员及在缺血性心肌疾病治疗中的应用

学术背景:自体骨髓间充质干细胞动员修复坏死心肌是一种安全有效治疗缺血性心肌的方法.目的:总结骨髓间充质干细胞动员治疗缺血性心肌病的研究进展.检索策略:由作者检索Pubmed数据库1996-12/2006-12的相关文献,检索词"bone marrow stem cells,myocardial infarction".对资料进行初审,纳入标准:①与骨髓间充质干细胞治疗缺血性心肌疾病中的应用.②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章.排除标准:重复性研究.文献评价:文献的来源主要是骨髓间充质干细胞治疗缺血性疾病的随机对照试验.所选用的28篇文献中,2篇为综述,其余均为临床或基础实验研究.资料综合:①骨髓间充质干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,在合适细胞因子调控下可分化为心肌样细胞.②研究表明,骨髓血液循环中的干细胞可以定向到达梗死心肌并参与组织再生.③关于骨髓间充质干细胞在治疗缺血性心脏疾病方面的研究虽已取得较大进展,但仍存在许多问题,如种子细胞的保存:细胞体外培养中分化增殖的调控机制不十分清楚:产生的心肌样细胞的生物力学性能不太满意.结论:骨髓间充质干细胞动员在治疗缺血性心肌病方面,具有操作方法简便、快捷,对患者创伤小,自体移植不存在免疫排斥的优势,但仍存在许多尚未解决的问题.     

骨髓间充质干细胞在纳米晶胶原基骨内生长以及成骨潜能

背景:纳米晶胶原基骨修复材料是根据仿生原理制备的纳米骨框架材料,其微结构和成分两方面都与天然骨有相似性,具有良好的生物相容性。目的:研究兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养的结合程度,以及构建组织工程骨的可行性。方法:分离兔骨髓间充质干细胞,体外培养、纯化,取第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养,第3,7,20天后激光共聚焦和扫描电镜观察二者复合程度。结果与结论:骨髓间充质干细胞和纳米晶胶原基骨修复材料复合良好,共聚焦显微镜和环境扫描电镜观察均可见细胞生长;纳米晶胶原基骨修复材料能够作为良好的支架,它能使骨髓间充质干细胞在其内稳定生长。提示骨髓间充质干细胞在纳米晶胶原基骨修复材料内能很好的生长,并且具有成骨潜能。     

人骨髓间充质干细胞的获取与体外培养的研究 : 作为喉、气管软骨组织工程重建种子细胞的可能性

Objective To observe the feasibility of using bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as seed cells for tissue-engineering in Otolaryngology. Method MSCs were isolated from bone marrow of human rib and purified by centrifuge and cultured in vitro. The proliferation and growth characteristics of MSCs were observed in primary and passage culture. Result Human bone marrow-derived MSCs showed active proliferation capacity in vitro in primary and passage cultures. Conclusion Human bone marrow-derived MSCs have relatively young biologic age and they can be used as the seed cells for tissue engineering.     

外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的影响

背景:透明质酸是关节腔滑液最主要的成分,对细胞的形态发生起着非常重要的作用,但其用于软骨缺损修复时对骨髓间充质干细胞的影响如何呢?目的:通过分析外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对骨髓间充质干细胞的作用。方法:全骨髓法+贴壁培养法分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入透明质酸诱导液,以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7,14,21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果与结论:经透明质酸诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结果提示,外源性透明质酸具有诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,但比转化生长因子β3的诱导能力弱,关节腔内环境对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,支持透明质酸作为软骨组织工程基质使用。     

The posibility study of human mesenchymal stem cells harvested and cultivated in vitro as seeds cells for reconstruction of throat and trachea cartilage tissue engineering

Recentlysomedatashowedthathumanmarrowtissuenotonlycontainshematopoieticstemcells,butalsocontainsabundantmes－enchymalstemcells（MSCs）．MSCshavetheabilitytodifferintoothercells．Theycanbecultured,proliferated,inducedandtransformedintoboneorcartilagetissue,sothiscanbeusedtorepairdamageofboneorcartilagetissue犤１－３犦．Butcomparedwithhematopaieticstemcellstherearen＇tabundantMSCsinbonemarrow．InthisexperimentMSCswereseparatedfrombonemarrowandpurified,andtheirproliferationandgrowthchar…     

成人和胎儿骨髓间充质干细胞的比较研究

目的 比较成人和胎儿骨髓间充质干细胞（MSC）的表型和生物学性状差异，为临床选择使用MSC提供实验依据。方法 取正常人和胎儿骨髓单个核细胞，在SF培养基中进行MSC培养，测定生长曲线。电镜观察MSC形态，利用流式细胞仪进行SMC表型测定和细胞周期分析；SA方法测定Ⅰ，Ⅲ型胶原和vWF因子表达。通过碱性磷酸酶染色，苏丹黑染色及骨钙蛋白和脂蛋白酯酶mRNA的表达等来检测细胞向成骨，成脂肪细胞分化情况。结果 从成人和胎儿骨髓中可培养出MSC，并保持多向分化潜能。两者在细胞形态，生长特性，表面抗原表达等方面是相似的。胎儿骨髓MSC的扩增潜力及多向分化能力明显强于成人MSC。成人骨髓MSC的粘附功能则强于胎儿。结论 从成人及胎儿骨髓中可分离培养出MSC，在体外有效扩增且保持其低分化状态和多向分化能力。胎儿MSC较成人MSC更原始，具有更大的多向分化和体外扩增潜能，可作为组织工程的种子细胞；而成人MSC支持造血，促进造血功能恢复和重建造血的功能则强于胎儿，具有更广泛的临床移植应用前景。     

骨折预处理对兔骨髓来源间充质干细胞的影响

目的探讨骨折预处理对兔骨髓来源间充质干细胞（MSC）的影响。方法将10只兔按随机数字表法分为2组,每组5只。骨折预处理组截断兔股骨骨干后采用克氏针内固定,7 d后从另一侧股骨无菌抽取骨髓1～2 mL;对照组未进行任何处理。采用全骨髓贴壁法对2组兔进行骨髓来源的间充质干细胞的原代培养、酶消化法进行人工纯化,通过形态学观察、细胞周期测定及MTT实验,研究骨折预处理对MSC的影响。结果骨折预处理后可较快地获得纯化的MSC,且MSC的增殖能力在P2、P3代时均高于对照组（均P〈0.05）;随着时间的延长,P4代时2组MSC增殖能力比较差异无统计学意义（P〉0.05）。对P4代进行细胞周期测定,骨折预处理组MSC中G0/G1期细胞为70.65%,对照组MSC中G0/G1期细胞为72.40%,2组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论骨折预处理全骨髓贴壁法可在更短的时间内成功地培养出稳定的MSC,并且该细胞具有更强的增殖能力。     

纳米晶胶原基骨修复材料与兔骨髓间充质干细胞体外复合培养

背景:纳米晶羟基磷灰石胶原基骨修复材料具有与天然骨成分接近,结构和形貌图谱分析与天然骨相似,生物相容性好等特点,且材料多孔,孔径较大、孔隙率及孔隙交通率高,符合作为骨组织工程支架材料的要求.目的:观察兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养的结合程度.设计、时间及地点:体外观察实验,于2006-03/09在江苏大学医学院细胞实验室完成.材料:健康雄性新西兰大白兔1只,1月龄.纳米晶胶原基骨修复材料由清华大学材料系提供.方法:体外分离培养、纯化兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养.主要观察指标:①兔骨髓间充质干细胞生长形态及生长曲线.②复合培养5,10 d后扫描电镜观察二者复合程度.③复合培养5,10 d时纳米晶胶原基骨修复材料上结合的细胞数量.结果:兔骨髓间充质干细胞贴壁生长,增殖速度快,生长曲线符合Logistic生长曲线,兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养,在第5,10天进行扫描电镜观察,发现10 d时黏附于纳米晶胶原基骨上的骨髓间充质干细胞数明显高于5 d时黏附的细胞数,差异有显著性意义(P<0.01).结论:兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养结合程度较高.     

贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果验证

背景:骨髓中的间充质干细胞含量不高,且随着年龄增加或体质衰弱,骨髓间充质干细胞的数量会逐渐减少.目的:验证贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果.方法:大鼠麻醉后取双侧股骨和胫骨,剪去骨骺端,暴露骨髓腔,用含小牛血清的DMEM培养基冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞,反复吹打制成单细胞悬液,接种后置于37 ℃、体积分数为5%的CO_2培养箱内孵育,24 h后全量换液,以后每周全量换液1次,筛选易贴壁但贴壁不牢的细胞进行传代培养.观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪及免疫细胞化学染色鉴定骨髓间充质干细胞表面标志的表达.结果与结论:培养24 h后细胞能够贴壁生长,呈梭形或三角形;第二三天贴壁细胞迅速增殖;培养15 d左右出现致密的贴壁细胞层,呈漩涡状生长或成簇生长.细胞在接种后2 d进入对数生长期,12 d左右进入平台期,约15 d细胞可铺满瓶底.分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞CD90和CD54均呈阳性表达.结果验证了采用贴壁法可在体外成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,操作简单,造成污染的环节和机会较少,不需离心,可以更好的保持细胞活性.     

应用组织工程化肌腱修复跟腱缺损

背景:间质干细胞或间质祖细胞的非造血细胞可在体内或体外分化为骨、软骨、肌肉、肌腱、脂肪及骨髓基质,这使得它们成为组织工程领域内非常有价值的种子细胞来源.目的:以骨髓间充质干细胞为种子细胞,以Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸为支架构建组织工程化肌腱,观察其修复跟腱缺损的效果.设计,时间及地点:随机对照动物实验,于2003年在中南大学湘雅医学院进行.材料:1.5～2.5 kg健康成年家兔由中南大学湘雅医学院动物学部提供,雌雄不限.聚羟基乙酸由威高集团康利达医用制品有限公司提供.SD大鼠由中南大学实验动物学部提供.方法:提取家兔骨髓,通过离心和贴壁法培养获取骨髓间充质干细胞,将骨髓间充质干细胞进行分离、扩增.抽取SD大鼠尾腱,制备鼠尾Ⅰ型胶原溶液,并与聚羟基乙酸缝线混合培养构建胶原-聚羟基乙酸支架.将未经体外诱导的骨髓间充质干细胞接种于胶原-聚羟基乙酸支架中构建组织工程化兔肌腱模型,以不加入细胞的为对照.切开30只家兔踝部皮肤,分离出兔跟腱,造成3cm长缺损,实验组15只以自体骨髓间充质干细胞预制的组织工程化肌腱移植于缺损处,对照组15只以Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸支架修复跟腱缺损.主要观察指标:组织工程化肌腱修复兔跟腱缺损的效果.结果:含自体骨髓间充质干细胞的Ⅰ型胶原一聚羟基乙酸支架及不含自体骨髓间充质干细胞的Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸支架回植于体内时大体观察呈条形凝胶状.回植于体内4周后实验组和对照组均可见移植处形成条索状组织,聚羟基乙酸缝线已降解.8周时观察可见实验组组织工程化肌腱与受体肌腱组织完好连接,呈条索状.与周围其他组织无粘连,为白色、有光泽的致密腱样组织,对照组所形成的组织较实验组细小、与周围组织有粘连.结论:以骨髓间充质干细胞为种子细胞,以Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸为支架构建的组织工程化肌腱可明显促进肌腱损伤的修复.