氯霉素乙酰基转移酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的 建立氯霉素乙酰基转移酶（chloramphenicol acetyltransferase,CAT)双抗体夹心ELISA的实验室检测方法。方法 从质粒pBLCAT6经PCR扩增CAT基因序列，插入到原核表达质粒pGEX-2T中，在大肠埃希菌DH5α中诱导表达；以纯化的融合蛋白GST-CAT为抗原免疫实验用兔，得到的CAT抗血清进行生物素标记，并在此基础上利用生物素链和亲和素放大系统建立双抗体夹心ELISA法，构建不同YY1结合位点突变的HPV16LCRCAT报道质粒，体外瞬时转染真核细胞，提取胞质蛋白，以建立的方法进行CAT表达检测。结果 SDS-PAGE显示表达的GST-CAT融合蛋白相对分子质量约为54000；制备的CAT抗血清可有效地识别原核及哺乳动物细胞表达的CAT蛋白；在不同启动子及调节序列的控制下，利用建立的CAT检测技术证明在瞬时转染的细胞中可诱导2-8倍的CAT表达增强。结论 建立的双抗体夹心ELISA方法可敏感地反映上游序列的启动子活性，以及启动子调节序列变化对启动子活性的影响，使CAT作为报道基因的研究更为简单化。     

应用双抗体夹心ELISA检测人血清中Clq含量

本文采用抗人Clq单克隆抗体和多克隆抗体建立双抗体夹心ELISA,检测人血清中Clq含量。244份正常人血清标本检查结果,Clq正常值为287±56μg/ml。检测28份SLE患者血清有4份Clq呈明显下降.26份SLE病人血清同时用CH50试验检测总补体含量,发现二者呈正相关。因此,该技术有可能作为有关疾病如SLE等的临床诊断及疗效监测的辅助方法。     

D2蛋白酶双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立

目的:建立一种定量测定D2蛋白酶的双抗体夹心ELISA方法.方法:用棋盘滴定法确定捕获抗体、检测抗体的最佳工作浓度;绘制标准曲线,确定线性范围、检测限和定量限;检测该方法的准确性(回收率)、精密性和特异性,并与Bradford法检测结果进行比较.结果:包被抗体和捕获抗体的最佳包被效价分别为1:4 000和1:5 000;检测的线性范围为(28～1180)μg/L,检测限为4.6μg/L.经方法学考核,批内、批间变异系数分别为5.64%和7.17%,回收率为92.44%～105.26%,与碱性蛋白酶、蛋白酶K等其他蛋白无交叉反应,与Bradford法检测结果具有良好的相关性.结论:该方法灵敏度高,重复性好,为后期D2蛋白酶规模发酵优化、分离纯化研究提供了定量检测的方法,并为后期药代动力学、临床研究提供了思路和备选方法.     

双抗体夹心ELISA法检测相思子毒素

目的：建立相思子毒素（abrin）的酶联免疫检测方法, 为abrin临床诊断、中毒治疗、法医学鉴定等应用领域提供技术基础和参考依据.方法：采用双抗体夹心ELISA法来检测微量abrin.结果：该法检测abrin线性范围为0.25 ～125 μg/L, 线性回归方程为Y=0.51015X＋0.4153（r=0.9880, n=10,P＜0.0001）, 检测下限为0.25 μg/L.不同浓度蓖麻毒素（ricin）、葡萄球菌肠毒素B（SEB）对检测结果基本无干扰.该法能用于abrin毒素污染水样、土样、食品、血液等模拟样品的分析, 相对标准差为3.52% ～4.86%, 具有较好的重现性.结论：成功地建立了双抗体夹心ELISA法检测abrin, 将多克隆抗体的强富集能力和单克隆抗体（mAb）的特异性结合起来, 提高检测的灵敏度和特异性, 可适用于各种微量abrin样品的分析.     

ABC－ELISA检测人天然及重组γ－干扰素

采用生物素－亲和素双抗体夹心酶联免疫吸附分析技术（ＡＢＣ－ＥＬＩＳＡ）检测人天然及重组γ－干扰素。以固相化兔多抗ＩｇＧ捕获待检样品中γ－干扰素，以具有中和γ－干扰素抗病毒活性的生物素化单抗作为检测抗体，再加ＡＢＣ复合物，用邻苯二胺显色。据已知不同浓度标准γ－干扰素显色后的ＯＤ值的标准曲线，判定待检品中γ－干扰素蛋白含量。所检γ－干扰素与抗病毒活性一致，与肿瘤坏死因子、白细胞介素－２（ＩＬ－２），α、β－干扰素等无交叉显色反应；最低检测值为１００ｐｇ／ｍｌ（相当于抗病毒效价１～２Ｕ／ｍｌ）；可用于重组人γ－干扰素生产、纯化过程中的定性、定量分析以及血清γ－干扰素水平、人淋巴细胞γ－干扰素分泌量及ＬＡＫ和ＴＩＬ细胞等产生γ－干扰素水平的测定。     

双抗体夹心ELISA定量检测内毒素的方法学研究

目的 建立检测细菌内毒素（endotoxin,ET)的双抗体夹心ELISA法。方法 用自制的抗LPS－mAb C3A2和H3D3，分别作为包被和酶标记mAb，建立双抗体夹心ELISA法，并进行了实验条件的选择。然后用优化后的双抗夹心法对检测LPS的敏感性、特异性、重复性和回收率进行鉴定试验，并与鲎试验定量仪器比浊法和鲎试验定性法进行比较。结果 双抗体夹心法检测LPS的敏感性为50ng/L，特异性与准确性均高于仪器比浊法和鲎试验定性法，回收率是86.7%-97.4%，CV值为0.62%-4.8%。结论 建立的双抗夹心法，检测LPS的敏感性、准确性和特异性均较良好，为临床诊治内毒素血症提供了一种简便快速准确特异的实验工具。     

马γ-干扰素双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的:建立检测马γ-干扰素的双抗体夹心 ELISA,为马传染病的免疫学研究提供新方法.方法:将识别不同表位的抗马γ-干扰素的2株单克隆抗体(mAb,A5和SB10)纯化后,利用生物素标记试剂盒对其中1株纯化的mAb(SB10)进行标记,通过对重组马IFN-γ进行ELISA检测来建立马γ-干扰素双抗体夹心ELISA.结果:经过方阵滴定实验确定捕获抗体的最佳浓度为1 mg/L,检测抗体的工作效价为1∶1 000.利用建立的方法对不同稀释度的重组马γ-干扰素和丝裂原刺激的马外周血单核细胞培养上清进行检测.结论:此方法检测敏感度达到1μg/L,特异性良好,为马的细胞免疫学研究提供了方法,并为建立马γ-干扰素ELISPOT检测方法奠定了基础.     

人干扰素α2b ELISA配体结合分析检测方法的建立

目的：建立金黄地鼠血浆和组织重组人干扰素α2b定量ELISA检测法,用于药物研发检测。方法：采用双抗夹心法建立金黄地鼠血浆和组织重组人干扰素α2b含量检测方法,确定其检测范围,验证其选择性、精密度与准确度和稀释线性,并对样本稳定性进行研究。结果：建立的方法检测范围为0.50～16.00 ng/ml。选择性结果显示不同个体来源空白金黄地鼠组血浆和组织匀浆无差异,血浆质控样本准确度为78.62%～104.69%,批内精密度为0.69%～18.21%,批间精密度为6.71%～15.81%,总误差均<30%,稀释线性良好。稳定性样本在3种不同保存条件（冰上放置2 h;-80～-75℃放置4 d;反复冻融3循环）下稳定性较好,回收率均在±20%内。结论：成功建立了基于配体结合的人干扰素α2b ELISA检测法,该方法灵敏度高,重复性好,检测效率高,为新药研发提供了可靠的检测方法。     

双抗原夹心法ELISA在检测抗肾综合征出血热总抗体中的应用

目的建立可以检测不同来源血清中抗汉坦病毒抗体的简单、灵敏的方法。方法汉坦病毒核蛋白重组表达纯化后，同时作为捕获作用的固相抗原和检测作用酶标记抗原，建立检测血清中抗汉坦病毒总抗体的双抗原夹心法ELISA法，并与常用的IFA法进行比较分析。结果检测不同血清时特异性为100％，敏感性高于IFA法4～8倍。且不需考虑更换检测试剂，不同来源的血清样本对检测结果没有明显的影响。结论本方法操作简单，成本低，具有较高的敏感性和特异性，适合用于汉坦病毒感染的监测、调查和临床诊断以及宿主动物间病毒感染流行的调查与监测。     

建立基于核蛋白双抗体夹心ELISA的发热伴血小板减少综合征病毒滴定方法

目的 建立基于核蛋白双抗体夹心ELISA滴定发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的方法.方法 首先利用SFTSV核蛋白特异性多克隆和单克隆抗体建立双抗体夹心ELISA方法,用于SFTSV病毒滴度的检测,优化检测程序,评价检测方法的特异性与灵敏性,并与免疫荧光法和空斑试验法检测SFTSV滴度的方法进行比较.结果 所建立的基于双抗体夹心ELISA法滴定病毒与免疫荧光法和空斑试验法的滴定结果一致,相关系数分别为0.999和0.949.结论 基于SFTSV核蛋白双抗体夹心ELISA的滴定方法具有较高敏感性和特异性,操作简单,避免直接免疫荧光和空斑法滴定结果判定的主观性,并可适用于高通量检测.     

噬菌体表面表达人干扰素αlc/86D

目的为今后干扰素αｌｃ／８６Ｄ突变体文库的建立和筛选高活性的新型干扰素分子打下基础。方法利用ｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ技术表达人ＩＦＮαｌｃ／８６Ｄ基因。结果酶联免疫吸附试验、点杂交和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ均证明重组噬菌体颗粒具有干扰素的免疫反应性，生物学活性测定表明，当重组噬菌体为５×１０１０ＴＵ时，与４ＩＵ的重组ＩＦＮαｌｂ活性相当。结论人ＩＦＮαｌｃ／８６Ｄ在噬菌体表面能正确折叠和功能性表达。     

检测抗HIV-1/2型抗体的双抗原夹心方法的建立及其试剂盒的研制

目的 建立更敏感的检测人免疫缺陷病毒（HIV）抗体的方法,并研制检测试剂盒。方法 根据HIV－1／2型的基因序列及其所编码氨基酸结构,采用固相法合成了HIV－1型的gp41.1、gp41.2、gp120、p24和HIV－2型的gp36五条多肽,混合包被酶标板作为固相抗原。用辣根过氧化物酶标记以上多肽抗原作为标记物,建立检测血清中抗HIV－1／2抗体的双抗原夹心ELISA法。同时,应用该方法制备检测HIV抗体的试剂盒,并检测三批中国卫生中药品和生物制品检定所HIV诊断试剂国家参比品。结果 建立了检测HIV－1／2抗体的双抗原夹心法。用检定所参比品检测,该方法特异性、灵敏度均为100％,变异系数小于10％。与间接法相比较其灵敏度、特异性均高于间接法（P＜0．05）。检测210份其他病种患者血清均为阴性。与GBI公司的HIV抗体诊断试剂比较,检测40份卫生部药品和生物制品检定所提供的质控参比品（阳性20份,阴性20份）,GBI试剂阴、阳性符合率及总符合率分别为100%(20/20)、85％（17／20）及92．5％（37／40）,而应用该方法所研制的诊断试剂盒、阳性符合率及总符合率为100％。该试剂已通过国家卫生部质检。与雅培公司HIV诊断试剂比较检测90份献血员血清和88份HIV－1／2型感染者血清,符合率为100％。试剂盒于37℃放置4d后的检测结果的阴、阳性判定不受影响。结论 本法特异性强、灵敏度高、稳定性好,适用于献血员的筛选和临床HIV感染的检测。     

重组人干扰素α-2b喷雾剂人群试验的安全性评价

目的评价重组人干扰素α2b喷雾剂(远策素喷雾剂)人群应用预防SARS等呼吸道病毒感染的安全性。方法采用随机、同期平行对照的现场流行病学实验方法进行评价,用药5d,随访10d。结果用药期间,与对照组比较,用药组体温未见异常;用药期间用药组出现的不良反应有头痛(4.83%～7.09%)、头晕(7.17%～11.63%)、乏力(8.55%～15.06%)、肌肉酸痛(4.43%～7.09%)、咽干(12.10%～17.85%)、咽痛(6.25%～8.72%)、腹痛(2.30%～5.50%)、腹泻(2.45%～5.66%)等,不良反应的发生率均高于对照组(P<0.05);不良反应主要出现在用药的前3天;除咽干和乏力外,其他症状在停药后显著下降,其发生率甚至显著低于对照组;用药期间鼻塞、咳嗽和咯痰发生率两组差异无统计学意义;对照组的皮疹发生率显著高于用药组。在整个用药过程中未发现国外志愿者试验发生的血涕现象。结论应用远策素喷雾剂可引起一些较轻的流感样不良反应,但所有症状均为可逆性反应,停药后可消失;未见有其他严重不良反应的发生,在人群中应用是安全的。     

检测IL-8的ELISA间接夹心法的建立

利用抗IL-8的单克隆抗体4C3(包被抗体)和免抗IL-8多克隆抗体(第二抗体)建立了检测IL-8的间接夹心法ELISA,当包被抗体浓度为0.5μg/ml、第二抗体浓度为2μg/ml时,其检测下限可达1ng/ml。初步应用此法在部分感染病人血清中检测到明显高于正常人水平的IL-8。     

检测抗丙型肝炎病毒总抗体的双抗原夹心法的建立

以丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）结构区和非结构区基因工程表达抗原及人工合成多肽包被酶标板，用辣根过氧化物酶标记抗原，建立了检测血清中抗－ＨＣＶ总抗体的双抗原夹心法。与普遍采用的检测抗－ＨＣＶＩｇＧ的间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）比较，其灵敏度（１∶１２８）稍高于间接法（１∶６４），特异性相同，均为１００％。该法可同时检测抗－ＨＣＶ各类抗体，使检出率提高１０％。     

以ABTS为底物的双抗体夹心间接ELISA法的建立及应用

以多-单克隆抗体与正常鼠腹水平行包被固相载体,并用一种新的底物——ABTS作指示系统,建立了EHFV的双抗体间接夹心ELISA法。结果表明:1)ABTS与酶的反应平稳,不需加终止剂终止酶的反应,结果易于肉眼观察;2)对EHFV的定量测定较IFA客观、准确;3)对EHFV抗原的检出范围为351.65±122.82～2091.87±31.27ng/ml;4)对EHFV感染组织和细胞内EHFV的检出率为100％。以上结果说明该法敏感、特异、快速、简便、实用。并指出ABTS作为辣根过氧化物酶的底物的换代产品,应用前景广泛。     

双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法检测相思子毒素

目的 建立相思子毒素(abrin)的酶联免疫检测方法,为abrin临床诊断、中毒治疗、法医学鉴定等应用领域提供技术基础和参考依据.方法采用双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法来检测微量abrin.结果该法检测abrin线性范围为0.125～31.25 μg/L,线性回归方程为y=0.52369X 0.51632(r=0.9816,P＜0.0001,n=9),检测限为0.125 μg/L.不同浓度蓖麻毒素(ricin)、葡萄球菌肠毒素(SEB)对检测结果基本无干扰,表明该法检测abrin具有很好的特异性.该法能用于abrin毒素污染水样、土样、食品、血液等模拟样品的分析,相对标准差为2.35%～4.14%,具有较好的重现性.结论 成功建立了夹心BA-ELISA法检测abrin,巧妙地将多克隆抗体的强富集能力、单克隆抗体的特异性以及生物素-亲和素系统的放大作用结合起来,达到了提高检测的灵敏度和特异性的目的 ,可适用于各种微量abrin样品的分析.     

庚型肝炎病毒IgM抗体检测方法的建立及其临床意义

目的建立一种早期、快速诊断庚型肝炎的血清学检测方法。方法以辣根过氧化物酶标记庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）多肽ＮＳ３,ＮＳ５区段抗原,建立了捕获酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）,用于检测血清中ＨＧＶＩｇＭ抗体。结果本法不受特异性ＩｇＧ的竞争和类风湿因子的干扰;与其它致肝炎的病毒（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＥＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ）无交叉反应。检测４６例非甲、乙、丙、戊型肝炎患者血清,抗－ＨＧＶＩｇＭ阳性１４例,阳性率３０．４３％,其中,６例同时为ＨＧＶＲＮＡ阳性,阳性符合率为４２．８６％（６／１４）,检测１２例庚型肝炎病人双份血清,其中,急性期血ＨＧＶＩｇＭ抗体均为阳性。结论该法检测ＨＧＶＩｇＭ抗体特异性强,敏感性高,且简便快速,适用于临床对庚型肝炎新近感染的早期诊断,有推广应用价值。     

ELISA定量检测抗卵巢抗体及其应用

用提取的人卵巢抗原，以兔抗人卵巢抗血清为定量标准，建立定量检测抗卵巢抗体的ＥＬＩＳＡ。结果表明：以３．０Ｕ／ｍｌ为正常上限，闭经、不孕和流产患者血清抗卵巢抗体的阳性率分别为７４．３％、３６．７％和２５．０％，均明显高于健康对照组（１．２％），Ｐ＜０．０１。本法批内、批间ＣＶ分别为５．４～８．７％和７．５～９．０％；特异性为９８．８％；对原因不明的早期闭经患者敏感性为７４．３％。此抗体的检测，有助于了解早期闭经、不孕和流产的病因。     

丙型肝炎病毒抗体化学发光检测方法的建立

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatits C virus,HCV)引起肠道外传播的一类传染病,输血及血液制品引起传播是本病的主要途径。目前,国内抗HCV检测主要是ELISA和进口的全自动化学发光法。进口的全自动化学发光检测,由于配套的全自动分析仪和试剂价格昂贵,限制了其在临床上的应用。本研究研制了一种更为便宜、更易操作的HCV抗体化学发光试剂盒。