DNA防龋疫苗经TSG途径免疫BALB/c小鼠实验研究

目的观察编码PAc结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法将25只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc。结果颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续数周。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论重组质粒pCIA-P是一种有效的免疫原,该DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期粘膜免疫的有效途径。     

DNA防龋疫苗诱导长期免疫反应及机制初探

目的:观察编码pac结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法:将20只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc的表达。结果:颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续24周以上。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论:DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期黏膜免疫的有效途径。     

DNA防龋疫苗经TSG途径免疫BALB／c小鼠实验研究

目的 观察编码PAc结构基因A—P片段的重组质粒pCIA—P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB／c小鼠后的特异性免疫反应，并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法 将25只BALB／c小鼠随机分为4组，分别以重组质粒pCIA—P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠，ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA—P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc。结果 颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高，并持续数周。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高，但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论 重组质粒pCIA—P是一种有效的免疫原，该DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期粘膜免疫的有效途径。     

靶向融合防龋DNA疫苗经肌肉免疫动物的实验研究

目的　观察靶向融合防龋DNA疫苗pGJA P在大鼠肌肉组织中的原位表达。检测靶向融合防龋DNA疫苗pGJA P经股四头肌注射途径免疫大鼠后体内抗体水平和防龋效果 ,并与融合防龋DNA疫苗pGLUA P进行比较。在小鼠体内长期观察抗体动态变化。方法　质粒pGJA P经股四头肌注射途径免疫大鼠 ,免疫组织化学方法检测重组蛋白的原位表达。质粒pGJA P和pGLUA P经股四头肌注射途径免疫定菌鼠 ,ELISA法检测血清IgG和唾液IgA抗体水平 ,Keyes记分法评估定菌鼠磨牙患龋情况。质粒pGJA P和pGLUA P经股四头肌注射途径免疫BALB/c小鼠 ,ELISA法检测血清IgG和唾液IgA动态变化。结果　大鼠股四头肌组织检测到表达的重组蛋白。大鼠pGJA P免疫组血清抗PAcIgG水平 (1∶2 0 0 0 0 0 )和抗GTFIgG水平 (1∶5 80 0 0 )均显著高于pGLUA P免疫组 (1∶2 30 0 0和 1∶110 0 0 )(均P <0 0 1)。大鼠pGJA P免疫组唾液抗PAcIgA水平 (1∶8)和抗GTFIgA水平 (1∶6 )均显著高于pGLUA P免疫组 (1∶2和 1∶2 ) (均P <0 0 1)。pGLUA P免疫组未能引起有效的唾液IgA反应。pGJA P免疫组龋齿记分显著低于pGLUA P免疫组和空白组 (P <0 0 1)。小鼠pGJA P免疫组有效血清IgG、唾液IgA和pGLUA P免疫组有效血清IgG均持续至本实验结束 ,pGJA P免疫组血清IgG和唾液Ig     

变异链球菌、表兄链球菌复合防龋DNA疫苗的研制

目的 构建包含变异链球菌和表兄链球菌两种致龋菌的主要抗原片段的复合防龋DNA疫苗,以期增强DNA防龋疫苗对表兄链球菌的抑制作用.方法 PCR获得表兄链球菌OMZ176GTF-1的CAT区,克隆至靶向防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX中,构建编码变异链球菌PAc、GLU基因序列和表兄链球菌CAT基因序列的复合防龋DNA疫苗pGJGAC/VAX,转染CHO细胞系检测其表达.重组质粒及对照质粒分别经股四头肌注射和鼻腔滴注免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清和唾液中的特异性抗PAc,抗GLU和抗CAT抗体水平.重组质粒及对照质粒经鼻腔滴注免疫分别定植了变异链球菌和表兄链球菌的Wistar大鼠,龋齿记分评价防龋疫苗的龋齿保护效能.结果重组质粒pGJGAC/VAX构建成功.免疫小鼠后实验组小鼠血清和唾液抗PAc、抗GLU和抗CAT抗体水平均显著高于空载体对照组(P<0.01).血清特异性抗CAT抗体水平最高值在肌肉免疫组第8周和黏膜免疫组第10周时出现,分别为62.13μg/ml和11.43 μg/ml;唾液特异性抗CAT抗体水平最高值在肌肉免疫组第8周和黏膜免疫组第10周时出现,分别为0.67%和0.80%.大鼠龋齿保护实验结果显示在变异链球菌和表兄链球菌定菌鼠中实验组釉质龋(E),牙本质浅龋(Ds)和牙本质中龋(Dm)均显著低于pVAX1免疫组(P<0.05),实验组Ds和Dm均低于pGJA-P/VAX免疫组,但两组间E差异没有统计学意义(P>0.05).结论 复合防龋DNA疫苗构建成功,可在真核细胞中正确表达,动物实验证实能有效地诱导黏膜和系统体液免疫反应,并增强了DNA防龋疫苗对表兄链球菌的抑制作用.     

麻疹疫苗及加佐剂经滴鼻免疫小鼠的抗体应答

目的：观察麻疹减毒活疫苗和灭活疫苗经滴鼻免疫小鼠后的抗体应答。方法：用活的或灭活麻疹疫苗及分别加明胶、植物血凝素(PHA)的疫苗滴鼻免疫小鼠，于末次免疫后10d取血清、唾液、呼吸道分泌物，用间接ELISA法检测特异性IgG，IgA抗体水平，并与皮下注射组及对照组进行比较。结果：各滴鼻组小鼠血清及呼吸道分泌物中均产生一定水平的特异性IgG及In抗体，皮下注射组小鼠呼吸道分泌物中未产生特异性IgA抗体；加明胶后的免疫效果优于加PHA的。结论：麻疹疫苗滴鼻免疫小鼠后可诱导全身及局部抗体应答，明胶可增强其免疫效果，而麻疹疫苗皮下注射免疫小鼠未能诱导局部抗体应答。     

SARS病毒N蛋白真核表达质粒构建及诱导的体液免疫

目的构建SARS病毒核衣壳蛋白（N）的真核表达质粒，并研究其在小鼠体内诱导的体液免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS病毒N蛋白基因片段，定向克隆入真核表达栽体pVAC，构建pVAC-N重组质粒；大量制备该重组质粒，经基因枪腹部皮内注射免疫BALB／c小鼠三次，间接ELISA法测定免疫鼠IgG抗体效价。结果成功构建了重组表达质粒pVAC-N，免疫小鼠后可诱导产生出特异性的IgG抗体。结论构建的真核表达质粒pVAC-N能诱导小鼠产生特异性抗体，为SARS疫苗的进一步研究打下基础。     

变形链球菌亚单位疫苗SBR制备及经颌下腺免疫小鼠的抗体应答

目的:探讨变形链球菌(S.mutans)唾液结合区段(SBR)作为亚单位防龋疫苗的免疫原性,并评价经涎腺接种诱导有效免疫应答的可行性。方法:构建含S.mutansSBR基因的重组原核表达质粒pTriEx-4-SBR,用该质粒转化大肠杆菌E.coliJM109DE3,培养转化后的E.coli并诱导其表达SBR蛋白;以SBR蛋白作为亚单位防龋疫苗经颌下腺免疫BALBC小鼠,ELISA检测特异性抗体指标。结果:纯化得到的SBR蛋白与预期相符;ELISA结果表明,SBR蛋白经颌下腺免疫小鼠能够诱导血清抗SBR特异IgG(P<0.01)、唾液抗SBR特异IgGP<0.01、唾液抗SBR特异IgAP<0.01显著应答。结论:本实验所表达及纯化的SBR蛋白经涎腺接种途径可诱导明显的免疫应答。     

肺炎链球菌CbpA基因疫苗的构建及免疫学特性

目的：构建含有肺炎链球菌（SPN）毒力因子CbpA抗原编码基因的重组质粒pcDNA3.1/CbpA,测定其诱导特异性免疫应答的能力并评价其保护效果.方法：PCR扩增SPN CbpA编码基因,将该编码基因克隆到pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建pcDNA3.1/CbpA重组质粒,经测序鉴定后转染COS-7细胞,WesternBlot鉴定目的蛋白的表达,重组质粒免疫BALB/c小鼠,TIGR4型SPN攻击后,监测其生存时间.结果：CbpA能在COS-7细胞中表达;pcDNA3.1/CbpA重组质粒主动免疫BALB/C小鼠后,体内产生特异性IgG抗体,并诱导小鼠对SPN感染产生有效的保护.结论：成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1/CbpA,可为SPN基因疫苗的研制提供依据.     

用登革Ⅲ型病毒免疫小鼠后特异性IgG抗体的动态变化

目的：以登革Ⅲ型病毒(DV3)免疫成年BALB／C小鼠,观察血液中特异性IgG抗体的动态变化。方法：以不同剂量DV3经皮下注射和肌肉注射接种成年BALB／C小鼠,用间接免疫荧光法检测不同时间机体末梢血中特异性IgG抗体及其水平。结果：不同剂量DV,免疫BALB／C小鼠均可诱导体液免疫应答,特异性IgG抗体于免疫后第8～12天开始产生,于第15～18天达高峰(1：80),继而下降。特异性IgG类抗体可维持47d以上,其中以1000TCID50DV3免疫BALB／C小鼠最早产生特异性抗体且水平最高。结论：经皮下和肌肉注射DV3,可诱导BALB／C小鼠产生特异性IgG类抗体。     

Cpn0585蛋白的免疫活性及血清学诊断初步评价

目的克隆肺炎嗜衣原体包涵体膜蛋白Cpn0585基因,初步探讨其在血清学诊断中的应用价值。方法构建pGEX-6p-2／Cpn0585重组质粒,诱导表达并纯化重组蛋白,免疫BALB／c小鼠,间接酶联免疫附试验（ELISA）检测小鼠血清抗体滴度,以重组蛋白作为ELBA包被抗原检测血清中CpnIgG抗体和检测36份Cpn-／Ct＋IsG阳性参考血清。结果高效表达和纯化出一相对分子质量约为95kDa的重组蛋白,蛋白质印迹法证明其能与人抗CpnIgG抗体发生反应;在被免疫的BALB／c小鼠体内,特异性IgG抗体的滴度为1：12800;检测104例临床血清标本中的IgG抗体,与以色列SavyonDiagnostics公司SeroCPTMIgGELISA诊断试剂盒的检测结果进行比较,符合率为98．3％。结论表达的Cpn0585重组蛋白具有良好的免疫活性,在Cpn的血清学诊断中具有较高的应用价值。     

人参皂苷Re对防龋疫苗rPAc免疫效应的影响

目的 研究人参皂苷Re作为防龋亚单位疫苗rPAc佐剂的免疫保护效应.方法 40只BALB/c小鼠随机分为4组:防龋疫苗(rPAc)组,人参皂苷Re( Re)组,Re+rPAc组和生理盐水( NS)组,分别用rPAc、Re、Re+rPAc、生理盐水经鼻黏膜免疫.2 周后加强免疫1 次.用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清和唾液中特异性抗体的水平.脾细胞刺激实验检测细胞因子分泌水平.将24只定植了变形链球菌的Wistar大鼠随机分为4组:rPAc组,Re组,Re+rPAc组和NS组,分别用rPAc、Re、Re+rPAc、生理盐水经鼻黏膜免疫.2周后加强免疫1 次.龋齿记分评价防龋保护效能.结果 Re+rPAc组血清特异性抗PAc IgG、IgG1、IgG2a水平及唾液中特异性抗PAc IgA抗体水平均明显高于其他组( P＜0. 01). Re+rPAc组较其他组脾淋巴细胞白细胞介素4和γ干扰素表达增强(P＜0. 05).大鼠龋齿保护实验显示Re+rPAc组定菌鼠釉质龋(E)、牙本质浅龋(Ds)和牙本质中龋(Dm)均显著低于其他组( P＜0. 05).结论 Re作为防龋亚单位疫苗rPAc的佐剂可提高防龋疫苗的血清和唾液中特异性抗体的水平及防龋保护效能,具有作为防龋疫苗rPAc免疫佐剂的可行性.     

pT-ureB及pT-hpaA核酸疫苗诱导小鼠免疫应答的实验研究

目的观察并比较携带Hp不同抗原基因的质粒pTCAE-ureB(pT-ureB)和pTCAE-hpaA(pT-hpaA)肌注小鼠后诱导的体液免疫应答。方法构建真核表达质粒pT-ureB;与已成功构建的质粒pT-hpaA分别作为疫苗方案,肌肉注射免疫BALB/c小鼠并设置空质粒对照,末次免疫后第2、4、6周分别用间接ELISA法检测小鼠血清特异性IgG抗体滴度。结果两免疫组在末次免疫后第2周均可出现特异性IgG,抗体滴度随时间逐渐增高;末次免疫后第6周,两免疫组的抗体滴度与对照组相比较,差异极显著(P<0.01);且pT-ureB免疫组抗体滴度显著高于pT-hpaA(P<0.01)。结论pT-ureB具有良好的免疫原性,诱导体液免疫应答的能力优于pT-hpaA。     

重组Calpain蛋白诱导抗体产生及检测日本血吸虫感染的研究

目的 研究在大肠杆菌中表达的日本血吸虫Calpain蛋白的免疫原性及其在日本血吸虫病诊断上的应用。方 法用重组Calpain蛋白免疫BALB／c小鼠，ELISA法测定特异性IgG抗体的动态变化及其IgG亚型(IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)产生特征；同时用重组Calpain蛋白作为诊断抗原，粪检血吸虫病阳性患者血清作为一抗，肝吸虫阳性患者血清作为考核交叉反应血清。结果 重组Calpain抗原免疫小鼠后，产生了一个极高的抗Calpain特异性抗体，免疫4周IgG类抗体达到高峰，与对照组鼠相比较免疫鼠血清中IgG1，IgG2a，IgG2b特异性抗体也显著上升；Calpain重组抗原血清检测日本血吸虫和粪检的符合率为100％，粪检阳性EPG低的个体抗Calpain抗体滴度高，EPG高的患者抗Calpain抗体滴度反而低，与肝吸虫的交叉反应率为37％。结论 日本血吸虫Calpain是一个具有免疫原性的蛋白，能够激发宿主产生高水平的免疫球蛋白，能够敏感地测定日本血吸虫的感染，提示Calpain可以发展成为日本血吸虫病的诊断抗原和日本血吸虫疫苗候选分子。     

尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛重组质粒 pcDNA3畅0-fimH 的免疫保护作用

目的：研究尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛重组质粒pcDNA3.0-fimH产生的免疫反应及其对小鼠的免疫保护作用。方法选取BALB/c小鼠60只,随机分为3组（ PBS对照组、空质粒对照组、疫苗免疫组）,3组分别用构建成功的重组质粒pcDNA3.0-fimH（为疫苗免疫组）,载体质粒（pcDNA3.0）（为空质粒对照组）和PBS液（为PBS对照组）,经股四头肌注射免疫小鼠,于第21天和第35天加强免疫。于免疫第0、14、28及42天收集小鼠膀胱冲洗液,检测各组SIgA水平。于免疫第42天采血,检测各组特异性IgG、IgG1、IgG2a水平。结果免疫后,疫苗免疫组小鼠膀胱灌洗液中sIgA水平随时间延长呈上升趋势,且明显高于PBS对照组及空质粒组（F＝10.08,P＜0.05）;疫苗免疫组小鼠血清特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体均明显高于对照组及空质粒组（P＜0.05）;结论 pcDNA3.0-fimH基因疫苗可诱导BALB/c小鼠产生特异性体液免疫,对小鼠尿道具有一定的免疫保护作用。     

Eg95基因疫苗不同免疫途径的体液免疫应答比较

目的：用构建的细粒棘球蚴95(Eg95)抗原基因真核表达重组质粒pcDNA3-Eg95．直接免疫小鼠，观察其所诱导的体液免疫反应。方法：碱裂解法大量提取重组质粒。采用肌肉注射、静脉注射、皮下注射3种免疫途径和不同剂量的重组质粒免疫小鼠．用ELISA法测定小鼠血清抗体滴度。结果：在相同剂量下，重组质粒免疫小鼠刺激机体产生抗体反应强度的免疫途径依次为肌肉、皮下和静脉注射，阳性反应率由高到低依次为皮下、肌肉和静脉注射。以肌肉注射方式免疫小鼠的抗体反应维持时间较长，主要产生IgG2a为主的抗体。结论：用pcDNA3-Eg95重组质粒DNA免疫小鼠可以产生体液免疫应答。     

恶性疟原虫FCC1／HN株CSP基因表达产物免疫鼠体内抗原定位研究

目的：用恶性疟原虫FCC1／HN株CSP基因表达产物免疫小鼠，观察其在宿主体内各组织的抗原分布情况。方法：提取目的基因PfCSP在HeLa细胞中的表达产物，免疫注射BALB／c小鼠。取免疫后4周及7周小鼠心脏、肝脏、脑、脾及肌肉，通过免疫酶组织化学法及间接免疫荧光法检测组织内的抗原。结果：免疫7周后的BALB／c小鼠肝脏组织枯否氏细胞内及肝细胞膜上可见棕黄色特异性抗原－抗体反应，而免疫鼠心、脑、肌肉未出现明显的阳性反应。结论：恶性疟原虫FCC1／HN株CSP基因表达蛋白能被肝实质细胞特异性识别，其免疫后的抗原分布主要在肝脏。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2 DNA疫苗与重组亚单位疫苗在小鼠中诱导中和抗体的效力分析

目的 探讨以严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）受体结合区（RBD）和表面刺突蛋白（S蛋白）S1亚基为疫苗靶抗原诱导中和抗体的效果。方法 构建SARS-CoV-2 RBD与小鼠IgG1 Fc段（mFc）融合蛋白表达质粒pVRC-RBD-mFc,转染人胚肾细胞293T并进行培养。用蛋白质印迹法检测细胞培养上清中的RBD-mFc融合蛋白,用微量中和实验检测细胞培养上清中的RBD-mFc及CHO细胞重组表达的SARS-CoV-2 S1与人IgG1 Fc段（S1-hFc）融合蛋白对SARS-CoV-2感染的抑制作用。分别用质粒pVRC-RBD-mFc及S1-hFc融合蛋白通过肌内注射接种BALB/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清中的抗-S1 IgG,用微量中和实验检测小鼠血清的病毒中和活性。结果 pVRC-RBD-mFc质粒转染293T细胞的培养上清中可检测到RBD-mFc融合蛋白,超滤浓缩的细胞培养上清及S1-hFc融合蛋白均呈浓度依赖性抑制SARS-CoV-2对Vero E6细胞的感染;经pVRC-RBD-mFc质粒及S1-hFc融合蛋白免疫的小鼠血清中均可检测出抗-S1 IgG,且能中和SARS-CoV-2的感染;S1-hFc融合蛋白免疫小鼠血清的抗体滴度及病毒中和活性均高于质粒pVRC-RBD-mFc免疫小鼠血清（P均<0.01）。结论 SARS-CoV-2 RBD和S1蛋白均可能作为有效的疫苗抗原,重组亚单位疫苗较DNA疫苗能更有效地诱导中和抗体。     

日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗不同免疫途径免疫保护效果研究

目的:观察本室所构建日本血吸虫大陆株31kDa组织蛋白B DNA疫苗在BALB/c小鼠体内的不同免疫途径的免疫保护效果.方法:用纯化的空白质粒载体VR1012、重组质粒VR1012-Sj31免疫BALB/c鼠,将36只6～8周龄BALB/c鼠随机分为3组,每组12只,对照组(A组)肌肉注射空白质粒载体VR1012,实验组(B组)皮下注射重组质粒VR1012-Sj31,C组肌肉注射重组质粒VR1012-Sj31.质粒剂量均为100μg,每隔2w免疫1次,共免疫3次,第3次免疫后第21d,每只鼠经腹部感染10条尾蚴,42d后剖杀计数各小鼠成虫数和每克肝卵数,观察诱导产生的减虫和减卵效果,并用ELISA分析小鼠血清中的抗体.结果:ELISA分析表明,第3次免疫后小鼠出现特异性IgG抗体.与空白质粒对照组比较,2个实验组的减虫率分别为15.0%(P＞0.05)和25.0%(P＜0.05),减卵率分别为38.22%和54.90%(P＜0.001).与皮下免疫组相比,VR1012/Sj31肌肉免疫组的减卵率分别为26.99%(P＜0.001).结论:DNA疫苗VR1012-Sj31能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用,肌肉注射的保护效果大于皮下注射.     

重组空肠弯曲菌蛋白疫苗免疫 BA LB／c小鼠的研究

目的探讨重组空肠弯曲菌rLTB-PEB1蛋白疫苗的免疫机制。方法经口服免疫 BALB/c 小鼠后，ELISA 法检测特异性抗体IgG 、IgA 水平；ELISPOT 法检测派伊尔结特异性抗体分泌细胞；实时荧光定量PCR 检测IFN-γ、IL-4 mRNA 表达的差异。计算疫苗保护率。结果免疫组小鼠派伊尔结特异性抗体、IFN-γ、IL-4 mRNA 水平明显增高（ P ＜0．05）。免疫组的疫苗保护率为89．3％～93．7％，可维持30周。结论重组空肠弯曲菌rLTB-PEB1蛋白疫苗口服免疫小鼠可有效预防空肠弯曲菌的感染，其免疫机制可能为诱导了TH1/TH2型免疫应答。