RNA干扰PAR基因表达对PC3细胞生长的影响

背景与目的：PAR（prostate androgen regulated）基因在雄激素非依赖性的前列腺癌中特异性高表达,可能与细胞的恶性转化有关。本研究采用RNA干扰技术下调前列腺癌PC3细胞中PAR基因的表达,并探讨其对PC3细胞恶性表型的影响及作用机制。方法：构建针对PAR基因的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）表达质粒psiRNA-PAR1、psiRNA-PAR2和psiRNA-PAR3,转染PC3细胞;采用RT-PCR法检测其对PAR基因的表达抑制作用;细胞计数、软琼脂克隆形成实验、流式细胞术检测PAR基因表达下调对PC3细胞生长的抑制作用及其作用机制。结果：3组shRNA表达质粒均可抑制PC3细胞中PAR基因的表达;PAR基因的下调可使细胞生长速率明显减慢,增殖受到抑制;克隆形成能力降低,其中以psiRNA-PAR1的抑制效应最明显,并在转染48h后对PAR基因表达的抑制率达最高峰,为（81.18±1.68）%;流式细胞术检测结果表明,细胞周期阻滞于G2/M期,凋亡增加。结论：PAR基因表达下调,明显地抑制PC3细胞的生长,其作用机制主要是通过诱导细胞G2/M期阻滞和凋亡实现的;PAR基因可能是一个新的与雄激素非依赖性前列腺癌细胞恶性表型相关的癌基因,有望作为基因及药物治疗雄激素非依赖性前列腺癌的一个新靶点。     

STAT3基因RNAi诱导肝癌细胞凋亡及对STAT3信号转导相关基因表达的影响

背景与目的:探讨STAT3基因RNAi对人肝癌细胞SMMC7721凋亡的影响,及对STAT3信号转导相关基因表达的影响,为STAT3信号通路的肿瘤靶向治疗提供理论依据.材料与方法:采用RNAi技术特异性沉默SMMC7721细胞中STAT3的表达,通过Westem blot技术检测经RNAi作用后SMMC7721细胞STAT3蛋白表达水平的变化.采用透射电镜和流式细胞术检测经RNAi沉默SMMC7721细胞中STAT3的表达后,对细胞凋亡的影响.通过半定量RT-PCR法检测细胞凋亡相关因子bcl-2和survivin基因表达的变化. 结果:STAT3基因RNAi可有效沉默SMMC7721细胞中STAT3的表达(P<0.05).STAT3的表达被RNAi沉默后,SMMC7721细胞凋亡率较对照组明显增加(P<0.01).且SMMC7721细胞bel-2和survivin mRNA的表达水平均受到明显抑制,与对照组间的差异均具有统计学意义(P<0.01). 结论:STAT3基因RNAi可有效沉默SMMC7721细胞中STAT3的表达,诱导SMMC7721细胞凋亡,下调SMMC7721细胞bcl-2、survivin mRNA的表达.     

靶向hTERT的小干扰RNA诱导前列腺癌PC3细胞凋亡的机制

[目的]研究靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）的 siRNA诱导前列腺癌PC3细胞凋亡的分子机制。[方法]化学合成的靶向hTERT的siRNA以脂质体法转染PC3细胞;应用寡核苷酸芯片技术分析细胞凋亡相关基因的转录谱变化;应用Westernblot检测细胞中hTERT、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL、凋亡抑制基因Bcl-2和胞浆Cytc的蛋白水平变化;流式细胞术分析细胞凋亡率变化;比色法测定Caspase-3和Caspase-8的相对活性改变。[结果]靶向hTERT的siRNA能有效抑制hTERT基因表达;转染hTERT-siRNA48h后可引起TRAIL的表达上调,Bcl-2表达下调,Cytc释放增加,Caspase-3活性增强,细胞凋亡率升高。[结论]靶向hTERT的小干扰RNA通过活化线粒体信号传导途径诱导PC3细胞凋亡。     

利用siRNA阻抑survivin基因表达诱导乳腺癌细胞系MCF-7细胞凋亡的研究

背景与目的:survivin属IAP基因家族成员,表达于多种肿瘤组织中,能促使细胞逃避凋亡,并促进细胞的异常有丝分裂。本研究旨在探讨敲除survivin基因后,癌细胞的增殖和凋亡情况。方法:利用RNAi阻抑人乳腺癌细胞内survivin基因的表达,RT-PCR和Westernblot法分析survivin基因mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞生长增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:survivinsiRNA转染组,survivin基因表达水平与未转染组比较下调了64%。随着siRNA浓度的增加,细胞增殖抑制率逐渐增高,200nmol/L剂量组细胞增殖抑制率最高,可达60.9%。不同浓度的siRNA可不同程度地诱导细胞凋亡,200nmol/L剂量组凋亡率最高,可达29.0%。结论:survivinsiRNA有可能成为治疗乳腺癌的新药物。     

Survivin、Livin共沉默对前列腺癌细胞的联合促凋亡作用

目的：研究Survivin、Livin基因共沉默对前列腺癌细胞PC-3在细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、对化疗药物敏感性、克隆形成及裸鼠体内成瘤等方面的影响以及Survivin shRNA、Livin shRNA联合促前列腺癌细胞凋亡作用。方法：运用分子克隆技术,构建以Survivin、Livin基因为靶点的、含Survivin启动子的CGM30 miR     

RNAi 抑制GSK-3β 基因表达增强卵巢癌 SKOV3细胞对紫杉醇敏感度的研究

 目的构建GSK-3β基因特异性短发卡状（shRNA）干扰载体,观察RNA干扰技术对卵巢癌SKOV3细胞 GSK-3β基因表达的抑制作用,并且探讨促进紫杉醇药物敏感度的机制。 方法设计合成并构建针对GSK-3 β mRNA的特异性shRNA干扰质粒,将干扰质粒转染SKOV3细胞。筛选稳定转染的单细胞扩大培养,应用 RT-PCR、Western blot方法检测各组细胞GSK-3β表达抑制情况。流式细胞学检测法（FACS）检测细胞凋 亡率。比较抑制GSK-3β 基因前后卵巢癌SKOV3细胞抵抗紫杉醇药物的差异。结果成功构建pGSK3β-shRNA 干扰载体。SKOV3 细胞转染pGSK3β-shRNA干扰载体后,RT-PCR、Western blot方法显示,转染后GSK-3β mRNA 和蛋白表达均显著下降。FACS检测结果显示,转染pGSK3β-shRNA干扰载体,不同浓度紫杉醇作用 24h后,卵巢癌SKOV3细胞对紫杉醇敏感度都有显著性提高。细胞凋亡率显著增加（P<0.05）。结论运用 RNAi 技术构建的pGSK3β-shRNA干扰载体能特异、高效抑制靶基因GSK-3β表达;降低卵巢癌细胞中GSK-3 β基因表达水平,能增强卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感度,促进肿瘤细胞凋亡。     

肿瘤特异性Survivin、Livin共沉默RNAi载体的构建及其在前列腺癌细胞中的RNA干涉作用

目的:构建含Survivin基因启动子的、肿瘤特异性Survivin、Livin共沉默RNAi载体,研究该载体在前列腺癌细胞中的RNA沉默作用。方法:运用分子克隆技术,选取Survivin、Livin基因RNAi特异性序列,构建以Survivin、Livin基因为靶点的、含Survivin启动子的CGM30 miR-30 shRNA载体。经测序验证,用脂质体法转染PC-3细胞,RT-PCR、免疫印迹实验检测Survivin、Livin的表达变化,并用流式细胞术检测转染后PC-3细胞的凋亡变化。结果:构建的共沉默RNAi重组载体转染PC-3细胞后,Survivin、Livin基因在mRNA和蛋白水平上的表达均明显下调（P＜0.01）,且转染后的细胞凋亡增加了约15％,而正常前列腺上皮BPH-1细胞中则无此作用。结论:成功构建了含Survivin启动子、特异性沉默Survivin、Livin基因表达的RNAi共沉默载体CGM30-SP-svv-liv,转染该重组质粒后可促进肿瘤细胞的凋亡。     

沉默Livin基因表达对结肠癌LoVo细胞生物学特性的影响

目的:运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默结肠癌细胞株LoVo中Livin基因的表达,研究Livin对LoVo细胞增殖和凋亡等生物学特性的影响.方法:构建针对Livin基因的干扰质粒pSilencer4.1-L1和pSilencer4.1-L2,转染LoVo细胞,通过RT-PCR、Wes...     

RNAi沉默β-arrestin2基因对人乳腺癌Bcap37细胞凋亡的影响

目的:通过体外实验观察β-arrestin2的小分子干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）对人乳腺癌Bcap37细胞凋亡的影响。方法:针对β-arrestin2基因设计siRNA序列,克隆到空载体PGPU6/GFP/Neo,转化DH5α菌株,提取质粒,进行测序分析。在脂质体lipofectamineTM2000的介导下转染Bcap37细胞,同时转染空白对照组及阴性对照组。转染后用定量Western blot 检测Bcap37细胞β-arrestin2蛋白的表达情况,流式细胞仪检测Bcap37细胞的凋亡情况。结果:我们的研究表明,β-arrestin2的siRNA能有效下调β-arrestin2的表达,与对照组相比,β-arrestin2干扰组β-arrestin2的表达明显下降（P＜0.05）;β-arrestin2干扰组Bcap37细胞凋亡率显著高于对照组。结论:β-arrestin2干扰组能有效降低β-arrestin2的表达,有效促进Bcap37细胞凋亡;β-arrestin2可能成为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。     

骨桥蛋白下调对前列腺癌PC3细胞生物学行为的影响

目的观察骨桥蛋白(osteopontin, OPN)下调后对前列腺癌PC3细胞生物学行为的影响.方法构建针对OPN的siRNA(small interference RNA)表达质粒, 用脂质体方法转染PC3细胞.RT-PCR和Western blot检测转染后PC3细胞OPN 的表达; MTT比色法和流式细胞仪检测PC3细胞OPN下调对细胞的生长和细胞周期的影响;软琼脂生长实验检测OPN下调后对PC3细胞集落形成的影响.结果 RT-PCR和Western blot证实经RNA干扰介导的PC3细胞存在OPN表达下调,转染的细胞生长受抑制,出现细胞周期S期阻滞和细胞凋亡,在软琼脂上的细胞集落形成率下降.结论经RNA干扰的选择性OPN下调可使PC3细胞在S期阻滞并出现细胞凋亡,细胞的恶性程度下降.     

凋亡抑制蛋白Survivin在前列腺癌细胞系中的表达

目的：研究凋亡抑制蛋白survivin在前列腺癌细胞系PC-3、PC-3M、DU145、LNCaP和22RV1中的表达水平.方法：应用免疫细胞化学技术,免疫印迹技术及RT-PCR技术检测5种前列腺癌细胞系中凋亡抑制蛋白survivin的表达.结果：免疫细胞化学染色结果显示,各前列腺癌细胞系survivin阳性细胞百分率,PC-3为23%,DU145为18%,LNCaP为15%,22RV1、PC-3M分别为11%和12%.免疫细胞化学染色阳性分值,PC-3为49.42＋4.71,PC-3M为28.45＋6.82,DU145为34.27＋6.08,LNCaP为34.09＋5.22,22RV1为31.66＋7.13.与其他细胞系相比以PC-3细胞系中survivin的表达量最高（F=22.84,P＜0.01）.Westernblot结果显示,PC-3、LNCaP、DU145细胞系中的survivin蛋白总量相对较高,而22RV1、PC-3M中的survivin蛋白总量相对较低,RT-PCR结果显示,PC-3、LNCaP细胞中的survivinmRNA水平相对较高.结论：5种前列腺癌细胞系中均有survivin的表达但表达水平略有差别.研究前列腺癌细胞系中凋亡抑制蛋白survivin的表达对研究前列腺癌的发生、抗药性机制及新药物靶位的筛选具有重要意义.     

RNA干扰Survivin基因沉默对卵巢癌SKOV3及SKOV3/ADM细胞凋亡的影响

背景与目的:RNA干扰技术被广泛应用于肿瘤基因治疗、抗病毒感染、基因药物筛选等许多领域。Survivin基因在卵巢癌细胞株SKOV3及其耐药株SKOV3/ADM中高表达,是进行卵巢癌基因治疗理想的靶点。本研究探讨Survivin基因沉默后对卵巢癌细胞SKOV3及其耐药株SKOV3/ADM凋亡的影响。方法:将重组质粒pshRNA鄄Survivin以脂质体转染至SKOV3、SKOV3/ADM细胞。分别用半定量RT鄄PCR、Westernblot检测细胞内SurvivinmRNA和蛋白表达的变化,吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)染色法、TUNEL及流式细胞仪检测重组质粒诱导细胞凋亡的情况。结果:转染pshRNA鄄Survivin后,SKOV3、SKOV3/ADM细胞中SurvivinmRNA拷贝数明显减少,抑制率分别为83.79%和91.56%,蛋白质的表达水平显著降低;干扰组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,Survivin沉默后48h,SKOV3、SKOV3/ADM的细胞凋亡率分别为14.05%和21.02%,而在对照组未检测到明显凋亡。结论:重组质粒pshRNA鄄Survivin可明显抑制SKOV3、SKOV3/ADM细胞内SurvivinmRNA和蛋白的表达,介导卵巢癌细胞凋亡。     

肺癌细胞中survivin与紫杉醇作用的实验研究

目的:探讨survivin与紫杉醇作用机制可能的关系.方法:分别以体外药物敏感试验(MTT法)、流式细胞术、Western blot观察紫杉醇作用后,A549细胞生长抑制情况以及细胞周期、凋亡、survivin蛋白等指标的变化.结果:紫杉醇作用12h后,A549细胞才表现出生长抑制,并且这种抑制具有明显的时间依赖性(P＜0.05).不同作用浓度对A549生长的影响也存在差异,在同一时间点,紫杉醇浓度越大,细胞存活率越低(P＜0.05).时间依赖性实验中,10nM紫杉醇诱导的survivin表达与G2/M期阻滞一样,早在4h即已出现,延长作用时间(48h或更长),表达反而降低,但凋亡所占比例则与作用时间呈正相关(P＜0.05).浓度依赖性实验中,不同浓度紫杉醇同样表现出有效诱导survivin表达的能力(P＞0.05),G2/M期阻滞则呈浓度依赖性特点,凋亡比例于10nM达高峰;survivin表达与G2/M期阻滞、凋亡无相关性(P＞0.05).结论:紫杉醇对A549的生长抑制作用呈时间依赖性,紫杉醇诱导的survivin表达与G2/M期阻滞及凋亡的关系可因紫杉醇浓度而不同.时间依赖性实验中,10nM紫杉醇诱导的survivin表达与G2/M期阻滞变化趋势基本一致,但与凋亡相反,提示有丝分裂生存途径可能是肺癌细胞通过survivin拮抗紫杉醇诱导凋亡的一种重要方式,抑制survivin表达可能成为增加肺癌细胞对紫杉醇敏感性的有效途径.     

染料木黄酮和顺铂对耐药卵巢癌细胞SKOV-3中survivin表达的影响

目的：观察不同浓度的染料木黄酮和顺铂对耐药卵巢癌细胞系SKOV-3中survivin表达的影响。方法：采用RT-PCR和免疫细胞化学方法，检测不同浓度顺铂和染料木黄酮作用于SKOV-3细胞后survivin mRNA及蛋白表达的变化。结果：与对照组相比，顺铂组survivin mRNA及蛋白表达增强，染料木黄酮组及联合用药组survivin mRNA及蛋白表达减弱（P〈0．05）。结论：染料木黄酮能够降低SKOV-3细胞中survivin mRNA及蛋白的表达，并抑制顺铂诱导的survivin过高表达。这一作用可能是其增加SKOV-3细胞对顺铂敏感性的重要机制之一。     

超声靶向微泡破裂法介导RNA干扰沉默survivin基因对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响

目的:通过超声靶向微泡破裂(ultrasound targeted microbubble destruction ,UTMD)法介导基因转染,观察RNA干扰对宫颈癌HeLa细胞survivin基因的沉默效应和诱导细胞凋亡的作用.方法:构建靶向survivin基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,将其和微泡共同处理后加入HeLa细胞并予以超声辐照,以空白细胞、单纯质粒、单纯超声辐照、质粒+超声辐照和质粒+Lipofectamine转染作为对照;采用荧光显微镜和FCM法评估基因转染效率,同时对超声辐照参数进行优化;应用FCM法和Hoechst染色及DNA ladder分析法检测细胞凋亡,应用RT-PCR检测survivin mRNA水平的变化.结果:经酶切鉴定及测序分析证实重组质粒构建成功.HeLa细胞采用UTMD处理后,基因转染率显著增加(P＜0.01),并在超声强度为1.0 W/cm2、辐照3 min的条件下最为显著(P＜0.01).PT-PCR检测结果显示,质粒与微泡共同作用加超声辐照组的survivin mRNA抑制率为(83.33±2.73)%,均显著高于各对照组(P＜0.01);FCM法检测结果显示,该组细胞的凋亡率同样显著高于各对照组(P＜0.01);Hoechst染色及DNA ladder检测结果显示,只有经脂质体或UTMD转染处理后的细胞中可检测到明显的细胞凋亡形态及凋亡梯带,其余各组均未检测到明显凋亡.结论:UTMD可有效增强表达质粒的转染效率,是一种新的、有应用前景的非病毒基因转移体系.UTMD介导RNA干扰沉默survivin基因可诱导明显的细胞凋亡,为肿瘤基因治疗及研究提供了新的方法.     

Survivin基因RNA干涉对HeLa宫颈癌细胞凋亡及顺铂敏感性的影响

背景与目的:Survivin基因是凋亡抑制因子家族的新成员,它在人类多种恶性肿瘤,包括宫颈癌中均高表达,其表达下调可提高恶性肿瘤的化疗敏感性。本研究观察了survivin基因RNA干涉对宫颈癌细胞HeLa凋亡及顺铂敏感性的影响。方法:通过脂质体介导将含人survivin基因siRNA的重组真核表达质粒pS ilencer2.1-s2转染宫颈癌细胞系HeLa,G418筛选阳性克隆,半定量PCR、W estern b lot分别检测survivin mRNA和蛋白表达,激酶活性检测法测定半胱氨蛋白水解酶-3(caspase-3)活性变化,流式细胞仪、Hoechst染色观察细胞凋亡情况,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率并计算顺铂的50%抑制浓度(IC50)。结果:G418筛选24天后出现阳性克隆,与转染阴性对照质粒(HeLa-NC)、空载质粒(HeLa-U6 neo)及未转染(HeLa)细胞比较,转染pS ilencer2.1-s2质粒者survivin mRNA和蛋白表达明显下降,表达抑制率分别为:62.8%和60.1%;caspase-3激酶活性增强,A405达1.26±0.04;细胞凋亡率明显升高,为(29.2±1.4)%(P<0.05);在同一药物浓度下,细胞存活率明显下降,顺铂的IC50值降低为0.87±0.02ug/m l(P<0.05)。结论:Survivin基因RNA干涉可通过阻抑HeLa细胞中survivin表达,增强caspase-3激酶活性,诱导细胞凋亡并显著提高宫颈癌细胞对顺铂的敏感性。     

抗凋亡基因survivin与宫颈癌

Survivin基因是近年来发现的一种抗凋亡基因,与人体大多数肿瘤的发生、预后有关.本文综述近年来有关survivin基因的研究进展及其与肿瘤特别是宫颈癌的关系survivin对肿瘤的诊断及治疗方面的作用.     

survivin基因表达与非小细胞肺癌发生发展的关系

目的研究非小细胞肺癌(NSCLC)组织中survivin mRNA的表达,探讨其在NSCLC发生发展、浸润转移中的作用.方法原位杂交法检测12例正常支气管粘膜上皮、9例不典型增生、34例NSCLC、12例淋巴结转移癌组织中survivin mRNA的表达.结果在正常支气管粘膜上皮、不典型增生、肺癌及淋巴结转移癌组织中survivin mRNA阳性表达率呈递增趋势,分别为16.67%(2/12)、33.33%(3/9)、61.76%(21/34)、91.67%(11/12),其中肺癌、淋巴结转移癌组织阳性表达率与正常支气管粘膜上皮比较,差异均有显著性(P<0.01,P<0.01).低分化肺癌survivin mRNA阳性表达率88.89%(8/9)和中分化肺癌75.00%(12/16)均显著高于高分化肺癌11.11%(1/9)(P=0.003,P=0.004).survivin基因表达与NSCLC组织学类型及有无淋巴结转移无明显关系(P>0.05,P>0.05).结论 survivin 基因可能在肺癌的发生发展中起着重要作用;封闭或下调survivin基因的表达水平,恢复正常凋亡调控机制,可能成为肺癌基因治疗的新思路.     

Frequent silencing of the GPC3 gene in ovarian cancer cell lines

GPC3 encodes a glypican integral membrane protein and is mutated in the Simpson-Golabi-Behmel syndrome. Simpson-Golabi-Behmel syndrome, an X-linked condition, is characterized by pre- and postnatal overgrowth as well as by various other abnormalities, including increased risk of embryonal tumors. The GPC3 gene is located at Xq26, a region frequently deleted in advanced ovarian cancers. To determine whether GPC3 is a tumor suppressor in ovarian neoplasia, we studied its expression and mutational status in 13 ovarian cancer cell lines. No mutations were found in GPC3, but its expression was lost in four (31%) of the cell lines analyzed. In an of the cases where GPC3 expression was lost, the GPC3 promoter was hypermethylated, as demonstrated by Southern analysis. Expression of GPC3 was restored by treatment of the cells with the demethylating agent 5-aza-2'-deoxycytidine. A colony-forming assay confirmed that ectopic GPC3 expression inhibited the growth of ovarian cancer cell lines. Our results show that GPC3, a gene involved in the control of organ growth, is frequently inactivated in a subset of ovarian cancers and suggest that it may function as a tumor suppressor in the ovary.