Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养人牙髓细胞

目的 建立利用Ⅰ型胶原酶消化组织块体外培养人牙髓细胞方法。方法 通过组织块Ⅰ型胶原酶消化法进行人牙髓细胞体外培养，免疫细胞化学法鉴定细胞组织来源，进行细胞传代，酶组织化学法对体外复层生长的人牙髓细胞爬片进行碱性磷酸酶组织化学染色，并检测其矿化能力。结果 采用Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养的原代牙髓细胞，在第15～20d出现汇合，第4～6代牙髓细胞在连续培养后具有复层生长特性，并具有显著的碱性磷酸酶活性．阳性染色强弱部位呈区域性分布，连续培养的牙髓细胞可形成矿化结节。结论 Ⅰ型胶原酶消化组织块法可以很好地进行人牙髓细胞体外培养，可以用酶组织化学法研究牙髓细胞的生物学特性。     

圆盘电泳分离鉴定人血清碱性磷酸酶同工酶

本文介绍一个不连续缓冲系的聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳和一个新的活性染色程序。用牛犊小肠和人胎盘硷性磷酸酶作内标和外标,分离鉴定人血清碱性磷酸酶同工酶,所得电泳图谱与萘基磷酸固兰 BB 盐染色改进法比较,清晰度、灵敏性、和重现性均较好,可以扫描定量。分析120例以上体检和肝病血清,各同工酶(肝、骨、肠和其它高分子量碱性磷酸酶四带)电泳迁移率与文献参考比值完全一致。     

食管癌及贲门癌碱性磷酸酶同工酶表达形式的研究

利用阶段梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳对１１例食管癌和６例贲门癌织织中碱性磷酸酶（ＡＬＰ）同功酶进行了研究。结果显示，肿瘤组织中存在一条肿瘤特异性的快带──ＡＬｐ－１．该同功酶与胎盘型ＡＬＰ同功酶具有相同的电泳迁移率。提示ＡＬＰ－１为一种癌胚酶蛋白。     

牛小肠硷性磷酸酶同工酶性质的研究

本文采用正丁醇、丙酮等有机溶剂、经DEAE—纤维素22离子交换层析及Sephadex G—200凝胶柱层析从成牛、小牛小肠提取了硷性磷酸酶。所提成牛小肠硷性磷酸酶经垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后银染结果为单一条带。成牛及小牛小肠硷性磷酸酶56℃对热稳定。成牛该酶75℃大部失活;小牛该酶于70℃大部失活。10mmol/lL-苯丙氨酸抑制成牛、小牛小肠硷性磷酸酶活性分别为51％及77％。2M尿素抑制成牛、小牛小肠硷性磷酸酶活性均为25％左右。56℃热稳定实验及抑制试验表明成牛及小牛小肠硷性磷酸酶同工酶性质与人胎盘型硷性磷酸酶相似。     

体外培养人牙髓干细胞的生物学特性

目的研究体外培养的人牙髓干细胞的生物学特性。方法收集因正畸拔除的第一前磨牙,用酶消化法分离能够形成克隆且具有高增殖力的细胞,细胞以低密度接种传代培养;免疫荧光法检测第3代细胞表面标志的表达;取第4代细胞,用含有20%胎牛血清、地塞米松、β甘油磷酸钠和维生素C的培养液诱导3周,茜素红染色观察诱导后细胞矿化情况,免疫荧光法检测牙本质涎蛋白(DSP)表达,改良Kap low氏法检测诱导前后碱性磷酸酶的表达。结果诱导前细胞表达Stro-1、Cbfa-1、和Ⅰ型胶原,碱性磷酸酶呈弱表达,不表达DSP;诱导后细胞表达DSP,碱性磷酸酶呈强表达,并可见钙结节形成。结论分离所得细胞具有较高的增殖和分化能力,与间充质干细胞具有相似的表面标志,并在诱导后表达DSP而具备牙髓干细胞的特征。     

体外培养人牙髓干细胞的生物学特性

目的 研究体外培养的人牙髓干细胞的生物学特性.方法 收集因正畸拔除的第一前磨牙,用酶消化法分离能够形成克隆且具有高增殖力的细胞,细胞以低密度接种传代培养;免疫荧光法检测第3代细胞表面标志的表达;取第4代细胞,用含有20%胎牛血清、地塞米松、β甘油磷酸钠和维生素C的培养液诱导3周,茜素红染色观察诱导后细胞矿化情况,免疫荧光法检测牙本质涎蛋白(DSP)表达,改良Kaplow氏法检测诱导前后碱性磷酸酶的表达.结果 诱导前细胞表达Stro-1、Cbfa-1、和Ⅰ型胶原,碱性磷酸酶呈弱表达,不表达DSP;诱导后细胞表达DSP,碱性磷酸酶呈强表达,并可见钙结节形成.结论 分离所得细胞具有较高的增殖和分化能力,与间充质干细胞具有相似的表面标志,并在诱导后表达DSP而具备牙髓干细胞的特征.     

γ—射线照射后肝组织的酶组织化学观察

目的：观察经γ－射线照射后不同时间的正常肝组织8种酶酶活性的改变。方法：将正常新西兰大白兔分为对照组和6个实验组共7组，实验组分别为γ－射线照射后4小时，8小时，12小时，18小时，24小时和48小时组，照射剂量为单次200Gy。对照组不进行γ－射线照射。用酶组织化学方法观察经γ－射线照射后肝脏的琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、辅酶Ⅱ黄递酶、葡萄糖－6－磷酸酶、碱性磷酸酶、腺苷三磷酸酶、酸性磷酸酶和乳酸脱氢酶酶活性的变化。结果：除酸性磷酸酶外，所有的定位于膜系统和细胞器内的酶呈一致性的下降。结论：本实验剂量下的γ－射线照射肝组织后造成肝细胞质膜系统损伤。     

PAP法与PAAP法结合的双重免疫染色技术

介绍在同一切片上显示两种抗原物质在同一结构内比较分布的一种双重免疫染色技术。实验用过氧化物酶－抗过氧化物酶（ＰＡＰ）法作为第一染色序列，用碱性磷酸酶标Ａ蛋白（ＰＡＡＰ）法作为第二染色序列，最终分别产生深棕褐色和紫蓝色反应产物。其特点在于利用Ａ蛋白能与ＩｇＧ抗体分子Ｆｃ段牢固结合的分子生物学特性，在进行第二序列反应显色的同时，使第一序列反应产物的染色强度得以增加。结果表明，此技术能反差鲜明地显示含有     

肺炎支原体蛋白质抗原分析的研究

用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫吸印方法,分析肺炎支原体蛋白质抗原成份。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳经考马斯亮蓝染色可见多条泳带。免疫吸印法转移到硝酸纤维素膜,经酶标记染色可见12条带,其中明显可见者5条带,蛋白质分子量分别为165 000,90 000,65 000,46 000和28 000。其中有个别泳带未见报道,其意义有待进一步研究。     

日本血吸虫酚氧化酶同工酶分析

目的：观察日本血吸虫成虫单酚氧化酶(monophenol oxidase，MPO)和二酚氧化酶(diphenol oxidase，DPO)的同工酶酶谱形式。方法：将收集到的42d活成虫置含0．05％戊巴比妥钠的RPMIl640培养基中，23℃孵育8h，分别研磨雌、雄成虫呈匀浆，显色单酚氧化酶的样品匀浆时另加5％的TX-100。超声粉碎、低温高速离心取上清(含PO)．进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及酶染色后分析两种酚氧化酶同工酶酶谱形式。结果：单酚氧化酶的同工酶酶谱与二酚氧化酶的同工酶酶谱基本一致，电泳位置相同，表现为迁移率相同的一条带，但是单酚氧化酶的酶谱谱带较二酚氧化酶的酶谱显色弱。同时，雌虫及雄虫的单酚氧化酶和二酚氧化酶亦表现为迁移率相同的一条主带；但雄虫的酶带显色反应较雌虫弱。结论：日本血吸虫成虫体内酚氧化酶存在两种形式：单酚氧化酶和二酚氧化酶。而且不仅雌性虫含有酚氧化酶，雄性成虫也含有少量的酚氧化酶且两者酶分子相同。雄性成虫含有少量酚氧化酶的生理意义有待进一步研究。     

Polyacrylamide Gel Affinity Electrophoresis for Separation of Enzyme Isoforms

Affinity electrophoresis of differently glycosylated isoforms of enzymes using lectin as affinity ligand has been reported on support media such as cellulose acetate membrane (CAM) or agarose gel. We report a method for affinity electrophoresis in polyacrylamide gel (PAG) using wheat germ agglutinin (WGA). WGA is added to acrylamide-Bis mixture and incubated for 10 minutes at room temperature. This causes WGA to react covalently with acrylamide and Bis. Polymerization is initiated with addition of N,N,N,N-tetramethylethylene diamine (TEMED) and ammonium persulphate to give polyacrylamide gel with immobilized lectin. This gel has been found to effectively separate differently glycosylated isoforms of alkaline phosphatase (ALP). Concanavalin – A, similarly immobilized, did not give effective separation of ALP isoforms. The immobilization of lectin on polyacrylamide as support media requires less amount of lectin in comparison to CAM and agarose. Additional advantage of affinity electrophoresis on PAG is separation of biomolecules according to size.Key Words: Affinity electrophoresis, Alkaline phosphatase, Isoforms separation, Lectin, Polyacrylamide gel     

Comparison between a second generation automated multicapillary electrophoresis system with an automated agarose gel electrophoresis system for the detection of M-components

During the last decade, capillary electrophoresis (CE) has emerged as an interesting alternative to traditional analysis of serum, plasma and urine proteins by agarose gel electrophoresis. Initially there was a considerable difference in resolution between the two methods but the quality of CE has improved significantly. We thus wanted to evaluate a second generation of automated multicapillary instruments (Capillarys, Sebia, Paris, France) and the high resolution (HR) buffer for serum or plasma protein analysis with an automated agarose gel electrophoresis system for the detection of M-components. The comparison between the two systems was performed with patients samples with and without M-components. The comparison included 76 serum samples with M-components > 1 g/L. There was a total agreement between the two methods for detection of these M-components. When studying samples containing oligoclonal bands/small M-components, there were differences between the two systems. The capillary electrophoresis system detected a slightly higher number of samples with oligoclonal bands but the two systems found oligoclonal bands in different samples. When looking at resolution, the agarose gel electrophoresis system yielded a slightly better resolution in the alpha and beta regions, but it required an experienced interpreter to be able to benefit from the increased resolution. The capillary electrophoresis has shorter turn-around times and bar-code reader that allows positive sample identification. The Capillarys in combination with HR buffer gives better resolution of the alpha and beta regions than the same instrument with the beta1-beta2+ buffer or the Paragon CZE2000 (Beckman) which was the first generation of capillary electrophoresis systems.     

琼脂糖电泳法分离血清碱性肝型和骨型同工酶方法的改进

目的：介绍一种琼脂糖电泳法分离血清碱性磷酸酶肝型和骨型同工酶的改进方法。方法：将血清用神经氨酸苷酶处理,在此基础上选用四种缓冲液配制成０．７％的凝胶,加入１％的ＴｒｉｔｏｎＸ－１００电泳,并进行荧光扫描。     

琼脂糖凝胶电泳法快速筛选轮状病毒

本文用琼脂糖凝胶电泳检测轮状病毒RNA,并与聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果相比较,结果43份聚丙烯酰胺凝胶电泳阳性的标本,琼脂糖凝胶电泳亦均为阳性。两种方法检测轮状病毒RNA的敏感度一致,而琼脂糖电泳省时、简便、经济。可作为一种快速方法用于轮状病毒感染的筛选和快速诊断。     

含绿色荧光蛋白报告基因pUC18筛选载体的构建

目的：以绿色荧光蛋白（GFP）基因为报告基因，将GFP基因克隆入pUC18建立大通量的筛选载体。方法：用PCR方法扩增目的DNA片段，碱裂解法小量制备质粒DNA，用限制性内切酶消化质粒DNA，用低熔点琼脂糖凝胶分离和纯化大片段DNA，GFP基因与pUC18连接，用氯化钙法转化感受态细胞，DNA序列测定，琼脂糖凝胶电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果：pUC18-atg-GFP载体意外表达GFP蛋白，新合成的上游引物与原下游引物扩增GFP基因，克隆入pUC18构建pUC18-GFP载体，通过PCR，酶切鉴定和DNA序列分析，GFP基因的读码框架与原设计方案完全一致，该载体自身无GFP表达。结论：筛选载体内的GFP基因与克隆基因的融合基因可表达一种融合蛋白，在琼脂平板上含有该融合基因的克隆在紫外线激发下可发绿色荧光，因此，可表达基因能被挑选出来。     

催化系统对聚丙烯酰胺凝胶聚合的影响

目的探讨不同的催化系统对不同酸碱条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶聚合的影响。方法采用不同剂量的过硫酸铵(AP)四甲基乙二胺(TEMED)催化系统组合和过硫酸铵(AP)硫酸亚铁(FeSO4)-抗坏血酸(VC)催化系统组合,进行碱性PAGE和酸性PAGE,观察各组凝胶聚合所需时间。结果AP-TEMED在碱性电泳中应用,0.05%～0.1%的AP和0.1%的TEMED用量,凝胶聚合在0.5h内完成;在酸性电泳中应用时,0.2%的AP和0.3%～0.4%的TEMED用量,凝胶聚合在2h内完成。AP-VC-FeSO4催化系统应用于酸性电泳时设计的10组用量,48h均未发现凝胶形成。结论AP-TEMED催化系统在碱性PAGE中的效果好于酸性PAGE。在碱性电泳中,以0.05%～0.1%的AP和0.1%的TEMED为宜;在酸性电泳中,以0.2%的AP和0.3%～0.4%的TEMED为宜。     

DNA检测中琼脂糖凝胶重复使用效果

目的：摸索在DNA检测中琼脂糖凝胶多次重复使用的效果。方法：按常规制备琼脂糖凝胶,胶不离框,上样、电泳,电泳后胶连框一起放于饭盒内,盖好盒盖,于4℃冰箱保存。下次使用时保证电泳方向与前次相反,即把胶调转方向加样、电泳。结果：重复使用6~7次,DNA条带仍清晰可见。结论：这是一种简便易行、效率高、节省实验经费并易于推广的好方法。     

不同种属转移因子的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

不同批号人转移因子(TF-h)和猪转移因子;(TF-p)在聚丙烯酰胺凝胶电泳上均出现一条深色带,其电泳位置较为接近。此外,还可看到电泳位置基本相同的二条浅染色带,提示二种TF主要组成分子所带电荷及分子量都比较接近,这些不同分子带与转移因子生物活性的关系,有待进一步研究确定。     

贵州小香猪超氧化物歧化酶和过氧化物酶同工酶的组织分布

用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定贵州小香猪心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、卵巢、子宫等９种组织中超氧化物歧化酶和过氧化物酶同工酶。超氧化物歧化酶同工酶在Ｒｆ０．２２和０．２６处分别各有一条共有谱带，而过氧化物酶同工酶在Ｒｒ０．３９处有一条共有谱带。肝、肺、肾中两种酶活力较高，脑中未测得过氧化物酶。     

用TRIzol试剂抽提新生鼠脑组织总RNA

目的:建立一种快速提取组织RNA的方法.方法:Trizol试剂抽提组织总RNA,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳.结果:用此法提取的总RNA通过甲醛变性凝胶电泳获得完整RNA条带.结论:此方法提取的总RNA完整无降解.