表达BCRP的卵巢癌耐药细胞系3AO/BCRP的建立及其生物学特征

目的探讨乳腺癌耐药蛋白(BCRP)在卵巢癌中的作用和逆转其介导的MDR,建立表达BCRP的耐药细胞系3AO/BCRP。方法提取MCF-7细胞的总RNA,设计BCRP基因上下游引物,RT-PCR克隆出BCRP基因全长并连接到pcDNA3.1(-)上,转染3AO细胞后以G418筛选存活细胞。采用米托蒽醌外排实验、细胞毒性实验、细胞群体倍增时间、定量PCR、Western blot等方法鉴定构建的耐药细胞系。结果3AO/BCRP对米托蒽醌耐药指数增加至11.58;耐药细胞外排米托蒽醌的作用增强;细胞中BCRPmRNA的水平升高,细胞能表达一定量的BCRP。结论3AO/BCRP细胞具有BCRP的耐药表型,可作为进一步研究BCRP的生物学特性以及建立其介导的耐药逆转模型。     

多药耐药相关蛋白及其介导的肿瘤多药耐药

多药耐药相关蛋白与P-糖蛋白均属ABC转运蛋白超家族,但它们的结构、功能、耐药机制等并不完全相同.     

膀胱癌T24顺铂耐药细胞系的建立及生物学特性

目的 采用浓度梯度法诱导建立人膀胱癌顺铂耐药细胞系(T24/DDP),并观察其生物学特性.方法 利用人膀胱癌细胞株T24,采用顺铂(DDP)作为诱导剂在体外建立人膀胱癌顺铂耐药细胞模型T24/DDP(0.6μg/mL).通过倒置相差显微镜下观察T24、T24/DDP细胞形态,MTT法检测细胞多药耐药性,生长曲线检测细胞的增殖能力,流式细胞术测细胞的周期,qRT-PCR检测耐药基因MRP(muhidrug resistance-associated protein)的表达.结果 经过顺铂14个月的诱导,成功建立了T24/DDP.倒置相差显微镜下观察与T24细胞相比较,T24/DDP排列不规则,形态出现多形性,出现巨细胞;与T24相比较,T24/DDP对顺铂、阿霉素、长春新碱、甲氨蝶呤均产生不同程度的交叉耐药,比T24细胞倍增时间明显延长,细胞周期中G1期细胞增多,G2、S期细胞减少.qRT-PCR结果显示,耐药细胞MRP基因的表达明显高于亲本细胞.结论 人膀胱癌耐顺铂细胞株T24/DDP具有多药耐药性,可以作为研究膀胱癌细胞多药耐药的良好实验模型.     

HBV感染胎盘乳腺癌耐药蛋白的表达及意义

目的探讨乳腺癌耐药蛋白在HBV感染胎盘组织中的表达及其意义。方法选取HBV感染足月胎盘20例;选择无HBV感染足月胎盘20例作为正常对照组。实时荧光定量RT-PCR分别检测两组胎盘中ABCG2mRNA的表达。蛋白免疫印迹法分别检测两组胎盘中乳腺癌耐药蛋白的表达。结果各组荧光定量PCR检测ABCG2 mRNA的相对表达量为乙肝组(0.424±0.358),正常组(0.144±0.116),两组相比,差异有显著性(P0.005)。蛋白免疫印迹法检测乳腺癌耐药蛋白表达量为乙肝组(0.4250±0.3106),正常组(0.1129±0.1045),两组相比,差异有显著性(P0.001)。结论乳腺癌耐药蛋白在HBV感染胎盘组织中表达的升高,可能与乙型肝炎病毒感染有关。     

人喉癌长春新碱耐药细胞株的建立及其生物学特性

目的:建立人喉癌长春新碱多药耐药细胞系。方法:以药物浓度梯度递增法诱导筛选人喉癌Hep-2的多药耐药细胞株Hep-2/v,比较两组细胞的形态和倍增时间;MTT法确定细胞的IC50及其耐药指数;流式细胞仪检测两组细胞的细胞周期分布以及细胞内的罗丹明聚集情况;实时定量RT-PCR法检测MDR1基因的mRNA表达,Western blot法检测相应的蛋白表达情况。结果:建成的Hep-2/v耐药细胞株,其耐药性能稳定,耐药指数为45,并与顺铂及5-氟尿嘧啶有不同程度的交叉耐药性;Hep-2/v的体外群体细胞倍增时间较亲代细胞延长13.58小时;细胞周期分析结果显示其G0/G1期细胞升高,而S期细胞则明显降低(P0.05);罗丹明染色显示,Hep-2细胞内的罗丹明较Hep-2/v明显升高(P0.01);Hep-2/v细胞MDR1表达在基因及蛋白水平明显高于Hep-2细胞(P0.01)。结论:Hep-2/v细胞株具有明确及稳定的多药耐药性,是研究多药耐药机制及筛选逆转剂的良好模型。     

多药耐药相关蛋白及其介导的肿瘤多药耐药

多药耐药相关蛋白与P－糖蛋白均属ABC转运蛋白超家族,但它们的结构、功能、耐药机制等并不完全相同。     

反义寡聚脱氧核苷酸抑制卵巢癌细胞株SKOV3／mdr1中MDR1基因的表达

多药耐药基因（MDR1）编码的P－糖蛋白(Pgp,P-170)是导致卵巢癌化疗失败的重要因素之一。本研究将针对MDR1基因的硫代反义寡聚脱氧核苷酸导入卵巢癌耐药细胞株SKOV3/mdr1,观察其对该细胞株P170表达的影响。反义寡聚脱氧核苷酸（MDR1－AS）通过阳离子脂质体介导或单纯转染的方式导入SKOV3／mdr1 细胞,将正义寡聚脱氧核苷酸（MDR1－S)同样导入细胞为对照。经以脂质体介导的1．6μmol/L MDR1-AS转染后,Pgp阳性的细胞百分数从100％降至48．7％,经过16和10μmol／L两个浓度的单纯MDR1－AS转染后,Pgp阳性细胞的百分数也从100％分别降至52．6％和86．7％。同时,利用RT－PCR检测了MDR1mRNA水平的变化,以β-actin作为内对照,发现MDR1mRNA水平在MDR1－AS转染后降至内对照的60％左右,而用MDR1－S转染的细胞与SKOV3／mdr1细胞比无明显变化。所以导入MDR1基因硫代反义寡聚脱氧核苷酸可以部分抑制SKOV3／mdr1细胞中MDR1基因的表达。     

ABC家族基因在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM中的表达及雄黄对其作用初探

目的：探讨阿霉素耐药乳腺癌细胞系MCF-7/ADM的ABC家族基因的表达及其与敏感细胞系MCF-7/S的差异，观察中药雄黄对ABC膜转运蛋白超家族中各基因（mdr-1、mrp、bcrp）表达的影响。方法：应用RT-PCR检测ABC家族基因的转录表达，MTT法检测耐药性改变。结果：ABC家族基因在MCF-7/ADM细胞中均过表达，而在MCF-7/S细胞中均未见表达；雄黄可下调ABC家族基因的mRNA水平，降低化疗药物阿霉素（ADM）对MCF-7/ADM细胞的IC50。结论：乳腺癌MCF-7/ADM细胞获得ADM抗药性，与ABC家族基因过表达有密切关系；雄黄可部分逆转MCF-7/ADM细胞对ADM的抗药性。     

人骨肉瘤耐阿霉素细胞模型的建立及其生物学特性

背景：多药耐药是骨肉瘤化疗失败的重要原因,目前其耐药机制不明。 目的：诱导建立耐阿霉素的人骨肉瘤细胞株并观察多药耐药蛋白1、多药耐药相关蛋白1和肺耐药蛋白的表达。 方法：采用逐步递增阿霉素浓度间歇作用的方法诱导143B/WT细胞株建立143B/阿霉素耐药细胞株。 结果与结论：经阿霉素诱导45 d建立了143B/阿霉素细胞株,其对阿霉素高度耐药,对顺铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺、长春新碱和紫杉醇亦产生不同程度交叉耐药;流式细胞仪检测显示与143B野生型细胞相比,143B/阿霉素细胞周期中G1和S期所占比例增加,而G2/M期所占比例明显减少;罗丹明外排实验显示,143B/阿霉素细胞药物外排能力显著高于143B/WT细胞(P < 0.01);流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察发现,143B/阿霉素细胞阿霉素相关性细胞凋亡率显著低于143B/WT(P < 0.01);Western blot检测显示143B/阿霉素细胞多药耐药蛋白1表达水平较143B/WT显著升高(P < 0.01),二者多药耐药相关蛋白1和肺耐药蛋白表达差异无显著性意义(P > 0.05)。提示143B/阿霉素细胞多药耐药的产生与多药耐药蛋白1表达升高相关。     

Livin在白血病耐药细胞系THP-1R的表达

Livin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族新成员,在正常组织极少表达,而在多数恶性肿瘤组织细胞中高表达,与肿瘤抗凋亡和耐药性有关[1].为探讨Livin与白血病细胞耐药的相关性,本实验主要从分子水平研究Livin在人急性白血病细胞系THP-1与耐药细胞系THP-1R中的差异表达情况,为Livin在白血病多药耐药( multi-drug resistance,MDR)方面的意义提供实验依据.1材料与方法1.1材料主要试剂:RPMI 1640培养液(Promega公司);兔抗Livin抗体(博奥森生物技术有限公司);引物(上海生工生物工程公司);RT-PCR试剂盒(MBIFermentas公司);双链siRNA和RNAi-Mate转染试剂(上海吉玛生物技术公司).1.2方法1.2.1细胞培养:THP-1细胞为本室冻存,用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液在37℃、5％ CO2条件下培养,2～3d传代1次.采用逐渐增加药物浓度的方法[2]建立THP-1耐Ara-C的耐药系THP-1R,实验前2周撤去药物,以正常的RPM1640培养液培养,然后取对数生长期细胞用于后继实验.1.2.2 siRNA转染:参考文献[1],针对人Livin基因2个异构体的共同部分合成siRNA序列,正义链5’-GACAGUGCC AAGUGCCUGCdTdT-3’,反义链5'-GCAGGCACUUGGCACUG UCdTdT-3’.按照说明书所述比例配制siRNA/RNA-Mate复合物和完全培养基的混合液,用此混合液稀释细胞至所需浓度,再分配到培养板各孔.非转染对照组用生理盐水代替siRNA.同时转染有荧光标记的阴性对照siRNA,在荧光显微镜下观察和判断转染效果.     

耐药相关蛋白在大肠癌的表达及临床意义

目的探讨耐药相关蛋白在大肠癌的表达规律,并评价其指导临床化疗用药的意义.方法采用免疫组化S-P法检测73例大肠癌中5种耐药相关蛋白（P-gp、MRP、ToPoⅡ、GST-π和TS）的表达.结果 P-gp、MRP、ToPoⅡ、GST-π和TS阳性率分别为82.19%（60/73）、10.96%（8/73）、45.21%（33/73）、72.60%（53/73）和26.03（19/73）;73例大肠癌中,多药耐药产生涉及至少2种耐药相关蛋白者达69例（94.52%）;5种耐药相关蛋白表达率在患者性别、年龄、肿瘤部位、大小、分化程度、浸润深度、是否淋巴结转移间均没有显著差异（P〉0.05）.结论大肠癌细胞表达多种耐药相关蛋白,其联合作用可能是多药耐药产生的基础;耐药相关蛋白在大肠癌的表达存在明显异质性,多种耐药相关蛋白联合检测有助于临床合理选择化疗方案.     

卵巢癌多药耐药发生机制的研究进展

目的：卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一,对化疗药物的多药耐药（Multidrug Resistance,MDR）是影响卵巢癌患者临床预后的主要原因。卵巢癌首次化疗有效率高达76％,但复发后降至20％,近年来对其的研究也越来越受到重视。本文较为全面地综述了卵巢癌MDR发生的分子机制。     

肺耐药相关蛋白及其介导的多药耐药研究进展

肺耐药相关蛋白 (lungresistance─relatedprotein ,LRP)是一人类主要穹窿蛋白 ,分子量为12 0KD ,它定位于核孔复合物上 ,作为该复合物的转运单位LRP基因控制着多种底物的双向转运。本文对肺耐药相关蛋白的分子生物学特征和生理功能及其在肿瘤细胞中的过度表达所产生的临床意义作一综述     

雄黄对乳腺癌MCF-7/ADM细胞多药耐药的逆转及机制研究

目的　探讨中药雄黄对乳腺癌多药耐药细胞系 (MCF 7/ADM )的逆转作用及可能的逆转机制。方法　药物敏感试验采用四氮唑蓝 (MTT)比色法 ,细胞内药物浓度测定采用荧光分光光度法 ;基因表达水平检测采用RT -PCR法。结果　雄黄在 0～ 2 5 μg/ml浓度范围内对MCF 7/ADM细胞未见明显毒副作用 ;15 μg/ml、2 5 μg/ml雄黄逆转倍数分别为 2 0倍和 2 8倍 ,并能明显抑制mdr 1基因的转录水平。 结论　雄黄可以逆转MCF 7/ADM细胞的多药耐药性 ,并呈剂量依赖性 ;可能的逆转机制为下调mdr 1基因的表达     

原发上皮性卵巢癌耐药相关标志的表达及其意义

肿瘤组织中多药耐药 (ＭＤＲ)、谷胱甘肽转移酶 (ＧＳＴπ)、拓扑异构酶 (ＴｏｐｏⅡ )的表达与肿瘤耐药有关[1] 。因此 ,我们对 111例卵巢恶性肿瘤组织进行ＭＤＲ、ＧＳＴπ、ＴｏｐｏⅡ水平的测定 ,结合化疗疗效探讨其临床意义。一、资料与方法1 研究对象 :收集本院 1997年至 1999年 111例初治原发上皮性卵巢癌标本。所有病例均行全子宫、双侧附件、大网膜及阑尾切除术 ,对晚期患者同时行最大可能的肿瘤细胞减灭术。术后均接受 6个疗程ＣＡＰ联合化疗。随访检查包括盆腔检查和Ｂ超检查、Ｘ线胸片、血ＣＡ12 5测定。2 免疫组织化学 :采用…     

乳腺癌组织多药耐药类蛋白表达与化疗耐药关系

目的　了解多药耐药相关类蛋白P 糖蛋白 (P gp)、谷胱甘肽 S 转移酶 π(GST π)、DNA拓扑异构酶 Ⅱα(Topo Ⅱα)在乳腺癌化疗耐药机制中的作用及相互间关系。方法　用免疫组化S P法对 91例未经抗肿瘤治疗的原发性乳腺癌和 18例术后经化疗复治乳腺癌组织检测P gp、GST π、Topo Ⅱα蛋白表达。结果　 (1)P gp在原发性乳腺癌中阳性表达率为 40 %,术后经化疗复治乳腺癌中阳性表达率为 6 1%。两组P gp表达率差异有显著性 (P <0 0 5 )。 (2 )GST π和P gp在乳腺癌组织表达正相关 (P <0 0 5 )。 (3)原发性乳腺癌Topo Ⅱα表达水平与一些提示预后差的临床病理特征明显相关 (P <0 0 5 )。术后经化疗复治乳腺癌中阳性表达率为 17%,与原发癌相比显著降低 (P <0 0 5 )。结论　乳腺癌耐药是多因素参与的复杂过程 ,P gp、GST π、TopoⅡα均参与其化疗耐药性形成。化疗后的复治乳腺癌比初治原发癌具有更普遍的耐药性。TopoⅡα水平可作为评价乳腺癌恶性度的指标。     

腹水型S180细胞系获得性MDR表达鼠模型的建立

对接种腹水型S180细胞的小鼠反复定量联合化疗 ,建立获得性多药耐药基因 (MDR )表达小鼠模型 ,探讨临床早期发现化疗耐药、全面定量检测耐药程度的方法。应用流式细胞术动态检测MDR表达情况及S180细胞凋亡指标 ,同法检测同期外周血淋巴细胞上述指标。结果是实验组小鼠自化疗后 1周MDR表达逐渐增高 ,自第 5周后显著性增加 (P <0 0 5 ) ;而S180细胞凋亡率、细胞杀伤率及Fas因子表达率则随化疗时间的延长而逐渐下降。MDR表达显著性增加时 ,S180细胞凋亡率等则显著性降低 (P <0 0 5 )。第 5周时实验组MDR阳性表达小鼠占 61 4 %、第 7周占 83 3 3 %。实验组外周血淋巴细胞MDR、凋亡率与S180细胞有显著相关性     

热休克因子在乳腺癌细胞株MCF-7热/化疗前后的表达差异及其影响

目的探讨乳腺癌细胞株MCF-7经热处理及应用阿霉素前后热休克因子(HSF1)的表达差异及其对热休克蛋白(HSP70)以及P-糖蛋白表达的影响. 方法分别给予乳腺癌细胞株MCF-7非致死温度的热冲击43℃1小时、45℃15分钟以及阿霉素处理,继续培养4小时后收获细胞,进行免疫细胞化学染色,观察热/化疗前后热休克因子、热休克蛋白以及P-糖蛋白的表达情况. 结果乳腺癌细胞株MCF-7经上述处理后三组细胞的HSF1、HSP70较处理前蛋白表达有明显增高,43℃组、化疗组P-糖蛋白表达较处理前有明显增高,但45℃组P-糖蛋白的表达在热疗前后无明显变化. 结论经热疗或化疗后的乳腺癌细胞株MCF-7中热休克因子表达增高,并能促进热休克蛋白70及P-糖蛋白的表达;热疗可导致化疗耐药的产生.     

细胞因子诱导的杀伤细胞对卵巢癌耐药细胞SKOV3/CDDP的作用机制

目的：探讨卵巢癌耐药细胞在癌变过程中免疫逃逸的分子机制以及细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）对其耐药性及免疫原性的影响。方法：采用电镜、流式细胞术（FCM）、MTT等检测方法，观察CIK细胞作用人卵巢癌耐药细胞系SKOV3／CDDP细胞超微结构、细胞周期、凋亡率、耐药相关基因MDR1和Topo—Ⅱβ以及hB7-1、hB7-2、MHCⅠb、HLA—DR抗原表达的变化；应用放射免疫（RIA）ELISA等方法检测CIK细胞作用于和荷人卵巢癌SKOV3／CDDP耐药细胞SCID小鼠腹腔移植模型后血清IL-2、TNF—α、IFN-γ、GM—CSF等细胞因子含量的改变。结果：电镜显示：CIK组可见较多的凋亡细胞，表现为细胞体积萎缩，膜发泡，细胞密度增加，线粒体浓缩染色质固缩于核膜周边；与生理盐水组相比，CIK组的G0／G1期细胞比例下降，S＋G2／M期细胞比例升高，细胞周期阻滞于S＋G2／M期，有统计学意义（P〈0．05）；在抑制细胞增殖的同时，尚诱导细胞凋亡，其细胞凋亡率为9．07％，二者比较，有统计学意义（P〈0．05）；与NS组相比，CIK组细胞MDR-1和Topo—Ⅱβ表达明显下降（P〈0．05），提示CIK细胞可逆转人卵巢癌耐药细胞SKOV3／CDDP细胞耐药相关基因MDRI和Topo—Ⅱβ的表达；与NS组相比，CIK组细胞MHCⅠb、HLA—DR、hB7—1和hB7-2抗原的表达均明显升高（P〈0．01）。提示CIK细胞可提高人卵巢癌耐药细胞株SKOV3／CDDP的免疫原性；与NS组相比，CIK组小鼠血清中IL-2、TNF-α、INF-γ、GM—CSF含量均明显增加（P〈0．01）。结论：CIK细胞在将卵巢癌耐药细胞的细胞周期阻滞于S＋G2／M期的同时，尚能诱导其凋亡，降低耐药基因的表达，提高耐药细胞的免疫原性，分泌IL-2、TNF-α、INF-γ、GM-CSF等具有抗肿瘤活性的细胞因子发挥抗肿瘤作用。     

葡萄糖神经酰胺合成酶在人乳腺癌细胞的表达及其与多药耐药的关系

鞘脂类物质神经酰胺通过介导肿瘤细胞凋亡在一定程度上逆转了肿瘤多药耐药(MDR)。人乳腺癌细胞葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase,GCS)使神经酰胺糖基化为葡萄糖神经酰胺(GC),降低了神经酰胺的促凋亡作用,促进了肿瘤细胞MDR。试图经本实验探讨人乳腺癌细胞GCS表达与多药耐药的关系。