巢式PCR法检测日本血吸虫低感染度宿主血清DNA的研究

目的探讨日本血吸虫低感染度宿主血清的DNA检测方法,为血吸虫病的早期诊断及疗效考核提供实验依据。方法建立并优化巢式PCR反应体系用于检测不同感染度家兔血清中的日本血吸虫特异性基因片段。结果在仅存活3～5对成虫的感染后家兔血清中均能扩增到特异性目的条带,尤其是感染后3d即可检出。结论巢式PCR可用于日本血吸虫低感染度宿主血清DNA检测,具有潜在应用前景。     

建立PCR方法检测日本血吸虫感染性钉螺

目的建立灵敏及特异的PCR方法检测日本血吸虫感染性钉螺。方法根据日本血吸虫18S-rRNA基因,设计1对引物,建立检测日本血吸虫感染性钉螺的PCR方法。测定PCR扩增产物的DNA序列,并进行PCR方法的灵敏性、交叉反应以及群体检测试验。结果PCR扩增日本血吸虫感染性钉螺,得到了与靶DNA位置相同的产物,测序长度为469bp,与靶DNA相同且序列一致,并将序列登陆Genbank,注册号:DQ442999。扩增阴性钉螺无产物出现。灵敏性试验提示,PCR方法可以检测出日本血吸虫毛蚴DNA的最低浓度为40pg/μl;交叉反应试验显示,该方法不能扩增出被单尾尾蚴感染的钉螺DNA;群体检测试验表明,PCR方法可以检测出被感染钉螺提取DNA的最高稀释度为1:640。结论初步建立检测日本血吸虫感染性钉螺的PCR方法,灵敏、特异且具有良好的群体检测效果。     

基于环介导等温扩增技术及规则成簇间隔短回文重复序列的日本血吸虫核酸检测方法的建立及评价

目的 建立一种灵敏、特异的基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)-规则成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的日本血吸虫核酸检测方法。方法 以日本血吸虫SjR2基因片段作为靶序列，设计LAMP引物、gRNA和ssDNA探针，建立并优化LAMPCRISPR反应体系。用LAMP-CRISPR方法检测含有SjR2靶序列的10倍梯度稀释的重组质粒，不同发育阶段日本血吸虫基因组DNA，以及肝片形吸虫、曼氏血吸虫、肥胖带绦虫、华支睾吸虫、似蚓蛔线虫、美洲钩口线虫、卫氏并殖吸虫、细粒棘球绦虫等蠕虫基因组DNA，评价其灵敏度和特异度。用LAMP-CRISPR方法分别检测15份血吸虫感染的阳性钉螺样本以及30份未感染的阴性钉螺样本，并与LAMP检测结果比较，以评价LAMP-CRISPR方法用于筛查感染性钉螺的应用效果。结果 建立的基于LAMP-CRISPR的核酸检测方法可特异性扩增并检测出日本血吸虫目的基因片段...     

猴D型反转录病毒巢式PCR检测方法的建立

目的建立SRV-1巢式PCR检测方法并进行初步应用。方法针对SRV-1env基因的保守区序列,设计特异性引物,以感染SRV-1 Raji细胞提取出的含有前病毒DNA的基因组DNA为模板,进行巢式PCR反应。扩增产物测序后与GenBank报道的序列进行同源比对。将DNA样本进行10倍梯度稀释,以检测巢式PCR反应的灵敏度。使用该方法对正常Raji细胞以及感染SIV、STLV的外周血淋巴细胞DNA样本进行扩增,检测该方法的特异性。用建立的巢式PCR方法检测40份储存猴血标本。结果使用巢式PCR扩增出的特异片段经测序分析,结果证实与GenBank报道的序列一致。所建立的巢式PCR检测法检测限度可达1.5×10-3ng/μL,而且方法特异。用此方法检测40份猴血标本,未检测到阳性标本。结论初步建立SRV-1的巢式PCR检测方法,该方法灵敏、特异,为SRV-1的检测提供了一个快速、有效的手段。     

PCR法和TP-ELISA法检测梅毒的结果分析

目的:探讨巢式PCR法在血液样本梅毒检测中适用性.方法:运用常规及巢式PCR 扩增了梅毒螺旋体(Treponema pallidum,TP)的DNA多聚酶I基因(DNA polymerase I,polA) 的特异性片段,与血清学方法比较,评价了两方法在诊断梅毒中的意义.结果:用PCR法和TP-ELISA检测89份拟诊为梅毒的血液标本,TP-ELISA方法与巢式polA(DNA polymerase I)PCR结果差异有统计学意义;巢式PCR敏感性高于常规PCR.结论:巢式polA(DNA polymerase I )PCR虽然具有高度敏感、特异等优点,但对全血、血清等标本要求较高,是否适合用于血液样本的检测有待进一步研究.     

基因芯片检测日本血吸虫及其现场应用

目的:建立敏感、特异的检测日本血吸虫的基因芯片并对其应用价值进行评价。方法:根据日本血吸虫高度保守的编码免疫原性毛蚴抗原5D基因,筛选、设计聚合酶链反应(PCR)的引物和基因探针,制成日本血吸虫基因芯片。采用基因芯片对江西、湖南和安徽三省现场采集的钉螺进行检测。检测时抽提待测钉螺的DNA,进行PCR扩增及不对称PCR荧光标记,然后与检测芯片杂交,最后进行扫描及分析。结果:建立的基因芯片能特异、敏感地检测出感染性钉螺,江西、湖南感染性钉螺的检出率为100％,安徽省品系的感染性钉螺检出率略低。结论:成功地建立了检测日本血吸虫的基因芯片,具有较高的实际应用价值。     

半巢式聚合酶链反应扩增全血中梅毒螺旋体polA基因

目的探讨半巢式聚合酶链反应（PCR）扩增梅毒螺旋体（Tp）的DNA多聚酶Ⅰ基因（polA）以探讨检测全血标本中微量Tp的可行性。方法应用半巢式PCR和常规PCR分别扩增165例可疑梅毒及非梅毒患者全血中Tp的polA,与血清学方法比较,探讨半巢式PCR方法在扩增全血中Tp DNA的意义。结果待测的165例标本中,与血清学方法比较,半巢式PCR检测Tp的敏感性和特异性分别为62.7%和95.9%,两者符合率为82.4%;两种PCR方法检测结果差异有显著性（P〈0.01）,半巢式PCR敏感性远高于常规PCR。结论半巢式polA PCR检测全血中Tp较常规PCR灵敏,是血清学方法诊断梅毒的有效补充,但其检测的灵敏度仍有待进一步提高。     

LAMP快速检测日本血吸虫感染性钉螺的研究

目的：建立一种快速检测日本血吸虫感染性钉螺的方法。方法采用环介导等温扩增技术（LAMP ）以日本血吸虫的特异基因为靶序列,利用Primer Explorer V3软件设计扩增靶基因的4条LAMP引物,酚氯仿法提取感染性钉螺中的日本血吸虫DNA ,取适量模板DNA加入LAMP反应体系进行对日本血吸虫靶基因扩增,经肉眼观察、SYBR Green I染色电泳及测DNA序列来判定扩增产物。在99个阴性钉螺中各加入1个阳性钉螺,其中每个阳性钉螺分别感染日本血吸虫毛蚴数量分别为10、8、6、4、2、1条。结果感染性钉螺检测管经显色呈绿色为阳性,阴性钉螺呈棕色;日本血吸虫的特异基因经LAMP扩增后电泳呈现LAMP特征性梯状条带,阴性钉螺及感染肝吸虫不出现LAMP特征性梯状条带;扩增产物经酶切及序列分析显示为目的基因;在100个钉螺中只要有2条日本血吸虫毛蚴感染便可检出。结论环介导等温扩增技术（LAMP）可快速有效检测日本血吸虫感染性钉螺,有望为疫区日本血吸虫感染性钉螺高效快速检测提供一种新方法。     

检测弓形虫的PCR法和ELISA法的比较

目的:建立快速、敏感、特异的PCR方法,用于检测弓形虫感染。方法:选择弓形虫B1基因194bp片段作为扩增模板,优化反应条件,并测定其敏感性和特异性;以104弓形虫RH株速殖子腹腔接种小鼠,用PCR法检测感染动物全血DNA,并与ELISA法检测血清IgM进行比较。结果:本实验中,PCR方法的检测阈值为0.2pg弓形虫DNA,并且与人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA均无交叉反应。用PCR法检测感染动物全血DNA,感染后第2d即可测出阳性,总阳性数为1(313/15);而ELISA法检测血清IgM则到感染后第6d才测出阳性,总阳性数为2(2/15)。经统计学检验,二者存在显著差异(P<0.05)。结论:PCR是一种快速、敏感、特异的检测方法,可用于弓形虫病的早期诊断。     

隐孢子虫PCR检测体系的建立及其应用

目的建立快速检测隐孢子虫卵囊的PCR检测体系,以期在人群和食品及其饮用水腹泻原虫监测中推广应用。方法以隐孢子虫小亚基SSU r RNA和卵囊壁蛋白(COWP)为靶基因,设计巢式PCR和荧光PCR的引物和探针;以分离纯化后的微小隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行扩增,分别进行两种检测方法的敏感性和特异性试验;再用某水牛养殖场采集的58份牛粪样考核检测体系的应用价值。结果设计的巢式PCR引物和荧光PCR引物探针特异性都很高,巢式PCR对隐孢子虫DNA的检测最低OD阈值为2 pg隐孢子虫DNA;实时荧光PCR显示最低检测阈值为200 fg隐孢子虫DNA,灵敏性都比较高,实时荧光PCR的灵敏性比巢式PCR高1个数量级(10倍);58份检测样本中,有一份为阳性样本,PCR产物经序列分析显示为微小隐孢子虫。结论巢式PCR和实时荧光PCR检测隐孢子虫的特异性和灵敏性均高,操作简便,能为隐孢子虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段和方法依据。奶牛感染人兽共患微小隐孢子虫基因亚型,具有人兽共患传播的可能性。     

东方田鼠感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库的初步报告

东方田鼠 (Microtusfortis,Mf)对日本血吸虫 ( Schistosomajaponicum ,Sj)感染具有抗性。为探讨Mf感染Sj后是否产生针对虫体某些抗原分子的免疫应答 ,作者用Mf受感染血清对Sj成虫cDNA文库进行免疫筛选 ,经初筛和复筛 ,共筛选出 1 2个阳性克隆 ,这些阳性克隆经辅助噬菌体自动剪切后PCR扩增显示 ,插入的SjcDNA片段大小在30 0bp～ 1 .8kb之间 ,其中 30 0bp片段 6个 ,1kb片段 1个 ,1 8kb片段 5个。说明Mf感染血清可识别Sj的特异性抗原分子。后者的免疫保护作用值得进一步研究     

日本血吸虫成虫抗原基因的获取及生物信息学分析

目的 筛选新的日本血吸虫（Schistosoma japonicum,sj）候选抗原基因.方法 以Sj雄虫成虫DNA为模板,设计引物扩增并纯化特异性片段,构建pBS-T克隆载体,将其克隆入大肠杆菌DH5α菌株,筛选阳性克隆,初步进行菌落PCR鉴定后测序,与EBI数据库中的已知序列比对分析,并用蛋白质分析软件预测其结构与功能.结果 利用日本血吸虫cDNA序列设计并合成引物,以Sj雄虫DNA为模板,成功地扩增和克隆出一个目的基因.通过菌落PCR检验和测序,BLAST比对分析显示其与日本血吸虫22.6 kDa抗原分子具有很高同源性,氨基酸预测分析其具有潜在螺旋跨膜和酪氨酸激酶磷酸化位点.结论 成功克隆一个目的基因,通过氨基酸预测和功能分析,预测其在血吸虫病免疫防治领域具有一定的意义.     

日本血吸虫8k CaBP基因启动子区的克隆与分析

目的克隆日本血吸虫8k CaBP(Sj8CaBP)基因启动子区并对该序列进行分析。方法提取日本血吸虫基因组DNA，并按Clontech Universal Genome Walker^TMKit的操作手册说明，建立日本血吸虫基因组DNA文库。根据手册要求及Sj8CaBP基因的cDNA序列，设计合成该基因染色体步移的特异性引物与试剂盒提供的端子引物进行巢式PCR。将得到的PCR产物克隆测序，测序结果用启动子区的分析软件及与其cDNA序列比对进行分析。结果得到的Sj8CaBP基因长度为1079bp(GenBank登录号AY262018)，该基因包含Sj8CaBP基因完整的开放阅读框(ORF)，包括1个内含子及2个外显子，在其5′端UTR区具有明显的启动子区，包括TATA盒及CAAT盒，没有发现GC盒及一些血吸虫基因启动子区所常见的AP—1(Active protein 1)结合位点。结论从日本血吸虫基因组文库中获得一个长1079bp的Sj8CaBP基因片段(GenBank登录号为AY262018)，经分析证明，该片段包含一个启动子区，具有TATA盒及CAAT盒的结构及1个内含子2个外显子．     

日本血吸虫Sj31核酸疫苗联合IFN-γ重组质粒诱导小鼠保护性免疫的研究

目的　探讨干扰素 γ重组质粒对日本血吸虫组织蛋白酶B核酸疫苗在小鼠抗血吸虫作用的影响。　方法　将小鼠干扰素 γ基因PCR扩增片段克隆入真核表达载体pCDNA3 1以构建重组真核表达质粒pCDNA3 1 IFN γ ,并与日本血吸虫组织蛋白酶B真核表达质粒VR10 12 Sj3 1一同免疫小鼠。小鼠分为 4组 ,其中实验组每鼠同时肌注VR10 12 Sj3 1及pCDNA3 1 IFN γ各 10 0 μg ,3个对照组分别为VR10 12 Sj3 1肌注 10 0 μg ,pCDNA3 1 IFN γ肌注 10 0 μg和载体VR10 12及pCHAN3 1肌注各 10 0 μg。共免疫 3次 ,每次间隔 2周。于末次免疫后两周免疫组化检测表达质粒在小鼠肌细胞的表达 ,于末次免疫后 3周经小鼠皮肤攻击感染 40± 1条日本血吸虫尾蚴。 45d后杀小鼠计算减虫率。　结果　VR10 12 Sj3 1及pCDNA3 1 IFN γ均在小鼠肌细胞表达 ,日本血吸虫Sj3 1核酸疫苗联合IFN γ重组质粒免疫可诱导小鼠产生 2 7 3 7%的减虫率 ,与日本血吸虫Sj3 1核酸疫苗单独免疫组比较减虫率显著 (P <0 0 5 )。　结论　IFN γ表达质粒能增强日本血吸虫组织蛋白酸B核酸疫苗的抗日本血吸虫的作用     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

泰泽菌PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立和应用泰泽菌巢式PCR检测方法。方法 参照日本学者Goto检测泰泽菌16S rDNA序列设计的两对引物,对PCR的检测条件进行了改进和优化。结果 巢式PCR反应的外引物能引导扩增出一条625 bp的DNA片段,内引物则能引导扩增出一条196 bp的DNA片段。此625 bp和196 bpDNA片段的大小均与Goto报道的结果完全一致。试验证明196 bp的阳性带为泰泽菌16S rDNA特异性保守片段。通过将泰泽菌阳性肝组织标本经系列稀释的试验表明,该PCR方法的检测灵敏度为2个菌。另外,将阳性对照标本扩增的625 bp DNA片段作核酸序列测定,发现其碱基序列与Goto报道的泰泽菌MSK株及RJ株16S rDNA序列均有99％同源性。结论 根据上述结果,我们应用本方法对普通级小鼠、大鼠、金黄色地鼠肝组织标本各5份、普通级豚鼠肝组织标本10份、沙鼠肝组织标本10份、MHV3感染的小鼠肝组织1份进行了初步检测,结果未发现带菌动物。     

日本血吸虫(大陆株)Sj26基因的克隆与序列分析

目的 构建日本血吸虫(大陆株)26kDa谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26)基因的真核表达载体，并测定基因序列和进行序列分析。方法 用PCR的方法特异性地扩增Sj26基因，并将此基因克隆于真核表达载体pcDN3，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，阳性克隆的重组质粒DNA经酶切、PCR扩增鉴定，用双脱氧链末端终止法进行序列测定，应用BIAST方法分析Si26基因序列并进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的Sj26基因，双酶切及PCR鉴定表明获得正确的pcDNA3-Sj26重组质粒，测序结果获得的基因片段大小为651bp，编码217个氨基酸残基。基因序列同源性为99％。结论 成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-Sj26。     

PCR技术检测RH株弓形虫组织内感染的实验研究

目的：建立敏感，特异的聚合酶链反应（PCR），以检测组织内弓形虫感染。方法：优化PCR反应关键步骤的条件。以相同的B1引物扩增相近的病原体判断其特异性，扩增倍比稀释的DNA检测其灵敏度，并以PCR法检测实验鼠肝，血中DNA的动态变化。结果与免疫组化法进行比较。评价其检测生物学样本的可行性。结果：实验建立的PCR技术的灵敏度能达到检测出一个虫体的DNA，且特异性强，不扩增鼠DNA，人DNA，隐孢子虫，卡氏肺孢子虫，鼠疟原虫的DNA，检测实验感染小鼠血，肝脏样本，在感染后2天，3只鼠血样本PCR结果阳性，3只小鼠肝标本2只阳性；感染后3天至濒死前后有小鼠检测结果均阳性；血样本阳性检出率100%（11/11），肝脏组织样本阳性检出率81.8%(9/11)。结论：PCR方法是一种敏感，特异快速的诊断方法，可用于诊断血和肝脏组织内的弓形虫。     

新型MGB探针特异性检测变形链球菌

目的:设计一种新型TaqManMGB探针,利用实时荧光定量PCR检测变形链球菌,提高PCR法检测变形链球菌的特异性,减少检测的假阳性。方法:提取6种不同链球属细菌的DNA,分别进行巢式PCR和TaqManMGB实时荧光定量PCR,比较两种PCR方法检测变形链球菌的特异性。巢式PCR第1轮扩增的引物是细菌16S rRNA基因通用引物,第2轮扩增使用变形链球菌16S rRNA基因可变区序列的特异性引物。TaqManMGB实时荧光定量PCR的引物与第2轮巢式PCR特异性引物相同,设计的MGB探针序列与变形链球菌16S rRNA基因中特异性序列相匹配,不与其他细菌的基因序列匹配。将变形链球菌标准株的DNA样本从2.5 mg/L至0.16μg/L按5倍梯度稀释,制备出实时荧光定量PCR的标准曲线。结果:变形链球菌和格氏链球菌在巢式PCR中均扩增出282 bp的DNA片段,出现假阳性结果。TaqManMGB实时荧光定量PCR能定量检出变形链球菌标准株和临床株,不检出其他链球菌,比巢式PCR特异性更好。TaqManMGB实时荧光定量PCR对变形链球菌DNA的最低检出浓度为20μg/L。结论:本研究设计出一种针对变形链球菌的TaqManMGB探针,建立利用TaqManMGB实时荧光定量PCR特异性检测口腔中变形链球菌的方法。