羊膜联合角膜缘干细胞移植治疗角膜缘缺陷症42例

眼烧伤、复发性翼状胬肉等眼表疾病常导致眼表层完整性破坏,表现为持续性角膜上皮缺损,异常角膜上皮愈合,胬肉复发、睑球粘连等．称为角膜缘缺陷症。1999年6月至2002年6月我们以羊膜联合角膜缘干细胞移植治疗角膜缘缺陷症42例42眼,效果良好．现报告如下。     

角膜缘干细胞分布变化对角膜曲率的影响

目的　研究上下方角膜缘上皮非对称性损害对角膜曲率的影响。方法　将兔的 11 1点方位的角膜缘上皮保留 ,其他方位角膜缘在外围保留 0 2mm宽的上皮带 ,其余上皮全部刮除 ,造成角膜上下方干细胞储备的差异。采取角膜地形图测量、组织学等方法观察角膜形态变化。结果　角膜中央区出现锥形凸起 ,锥形凸起处屈光值 (5 7 2 5± 2 73屈光度 )比术前角膜对应点屈光值 (5 2 2 3± 1.91屈光度 )明显增大 ,差异有显著意义 (P <0 0 1) ,组织学观察角膜锥形凸起处有代偿性增生的上皮细胞团。结论　角膜中央代偿性上皮增生可以显著地改变角膜曲率 ,角膜缘干细胞的分布异常是造成角膜中央上皮代偿性增生的原因之一。     

深低温保存兔角膜缘干细胞的体外培养

目的 探寻深低温保存兔角膜缘干细胞的体外培养方法。方法 将2mm宽的兔角巩膜组织通过程序降温仪降温后置于-196℃液氮中深低温保存。1年后复温，应用消化培养法分别对冻存及新鲜的兔角膜缘干细胞进行体外培养，观察并记录细胞生长情况，HE染色观察培养细胞的形态特征。结果 经过深低温保存的兔角膜缘干细胞可以在体外被成功培养并传代，其在原代培养48h后开始贴壁生长，5d后生长较旺盛，但可见部分破裂和死亡细胞，约12d基本形成单层；传代培养时次日贴壁，7d形成单层。新鲜兔角膜缘干细胞原代培养时细胞形态相似，但破碎死亡细胞少见，且于7d左右即基本形成单层，传代时两者无明显差别。结论 深低温保存的角膜缘干细胞能被成功地进行体外培养，培养后细胞具有与培养的新鲜角膜缘干细胞基本相似的特性，为深低温保存的角膜缘干细胞培养后移植治疗临床眼表疾病提供了实验依据，并为眼库技术的发挥开辟了新的应用途径。     

角膜缘干细胞移植的现状及应用前景

角膜缘干细胞缺陷，可导致一系列眼表反应，角膜上皮反复缺损、糜烂、溃疡、新生血管长入及假性胬肉形成，最终导致失明。角膜缘干细胞移植的临床应用，为我们最终有效的治疗眼表疾病，恢复患者视功能，提供了一个新的治疗途径。现将角膜缘干细胞移植的现状及应用前景综述如下。     

兔角膜缘干细胞的形态学研究

目的 探讨兔角膜缘干细胞(1imbal stem cells,LSCs)的形态学特征、数量及分布.方法 健康成年新西兰大耳兔30只,体质量2.0～2.5 kg,雌雄不分,取双侧眼球,常规石蜡切片,HE染色及免疫组化p63染色显示角膜缘一般特征及LSCs的分布,并用BioMias图像分析软件对LSCs进行计数.另外取3只兔眼角膜缘制作超薄切片,透射电镜观察.结果 ①角膜缘上皮细胞排列紧密,层数较多,基底层细胞呈矮柱状或立方形,核大而圆,位于细胞中央,着色较深.LSCs(p63阳性细胞)呈矮柱状或立方形,多位于角膜缘上皮基底层,在角膜缘浅层及角膜边缘有少量分布,在角膜中央上皮未见LSCs出现.②透射电镜观察LSCs核较大,形状不规则,核内常染色质较多,异染色质散在分布,未凝集成块.细胞质少,含较丰富的游离核糖体,其他细胞器少,细胞间可见较多的缝隙连接.③图像分析显示高倍镜视野下角膜缘上皮LSCs数量为(35.25±8.93)个.结论 ①LSCs具有原始细胞的超微结构特征,与其他干细胞形态相似.②LSCs主要位于角膜缘上皮基底层,在角膜缘浅层上皮及角膜边缘上皮内也有少量LSCs存在,在中央角膜上皮未见LSCs分布.     

兔角膜缘干细胞的体外培养和生物学特性观察

目的 探讨兔角膜缘干细胞的体外培养方法并观察其生物学特性。方法 采用消化培养法，分2组培养，1组为消化并过滤后的角膜缘干细胞培养组，另1组为消化后未过滤的带组织块培养组，均用含20％胎牛血清的培养液培养，待细胞长成良好单层后消化传代，分别观察记录细胞在原代和传代培养时的生长特性并行HE染色观察。结果 过滤组角膜缘干细胞在培养24h后开始贴壁生长，7～10d形成良好单层，细胞以圆形或椭圆形为主，核较大，呈原始细胞特征，传代培养时见细胞体积逐渐增大，核变小，成纤维细胞少见；带组织块培养组原代培养时与过滤组无明显差异，传代时则见成纤维细胞渐增多，至第3代时占主导并抑制了角膜缘干细胞的生长。结论 采用消化培养法可成功培养出兔角膜缘干细胞，培养时应滤除组织块以减少成纤维细胞的影响。     

角膜缘干细胞治疗严重角膜烧伤6例

1 临床资料 1997-01/2002-12我院眼科采用角膜缘干细胞移植、角膜干细胞联合羊膜移植重建严重损伤的角膜表面6例,均为男性,年龄10～46(平均24)岁,其中爆炸伤3例,化学烧伤2例,铁水烧伤1例.     

自体角膜缘上皮移植治疗单眼石灰烧伤后角膜混浊一例

1996年初，贺炎炎等(1)报告自体角膜缘上皮移植治疗单眼化学烧伤后角膜混浊获得成功，至今未见有同类报告。我院于1997年2月应用该项新技术治愈一单眼石灰烧伤后角膜上皮长期不愈、基质持续浸润混浊的病人，现报告如下。l病例介绍1．1病史：范XX，男，48岁，住院号：422931。患者于1997年1月12日在搞基建时，不慎被石灰浆伤及左眼，在当地卫生院给抗菌素、阿托品眼液滴眼及结膜下注射自血治疗1个月未愈而转来我院。人院后检查：左眼视力：平动／眼前，光定位正常。眼睑痉挛，球结膜混合充血，角膜上皮完全缺损，有一7Xsmm浅表溃疡灶，基质…     

自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉

目的:探讨自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉的效果。方法:对37例(38眼)翼状胬肉在手术显微镜下切除胬肉,取材干细胞丰富的上方角膜缘上皮,移植于病变区。结果:术后35例(36眼)治愈,治愈率94.75%,2例(2眼)复发,复发率为5.26%。结论:自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉简便安全、符合眼部生理特点,复发率低。     

角膜缘干细胞移植的研究进展

1 以角膜缘干细胞缺陷为特征的眼表疾病及治疗 根据病因可将角膜缘干细胞缺陷为特征的眼表疾病分为两类：一类是角膜缘基质微环境异常导致的角膜缘干细胞缺陷，如无虹膜、神经麻痹性角膜炎、边缘性角膜溃疡以及翼状胬肉等；另一类也是最常见的为各种损伤造成的角膜缘干细胞破坏，如化学烧伤和热烧伤、紫外线和离子射线的放射性损伤、史一约综合症、良性黏膜类天疱疮、角膜缘多次手术或冷凝、配戴角膜接触镜、严重感染以及长期使用抗青光眼药物等。角膜缘干细胞的完全丧失会导致角膜结膜上皮化、新生血管长人、     

人胚胎干细胞来源角膜上皮样细胞用于治疗兔角膜缘干细胞缺乏

目的 通过小分子化合物诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)分化为角膜上皮样细胞,观察角膜上皮样细胞治疗兔角膜缘干细胞缺乏(limbal stem cell deficiency, LSCD)的效果。方法 利用拟胚体联合小分子化合物方法,将hESCs H9细胞系向角膜上皮样细胞分化,将角膜上皮样细胞在去上皮羊膜片上培养构建重组细胞膜片。选取造模成功的12只LSCD兔,按照随机数表法分为对照组和实验组,对照组接受去上皮的的羊膜片治疗,实验组接受角膜上皮样细胞膜片移植治疗。术后通过裂隙灯、前节照相等方法,对角膜透明度、新生血管、荧光素钠染色情况进行评分,并于移植后4周观察角膜病理切片结构。结果 成功将hESCs诱导为角膜上皮样细胞,细胞形状和结构类似角膜上皮细胞。病理结果显示,实验组的角膜形成复层上皮结构,上皮下炎症细胞浸润轻,治疗效果明显优于对照组。进行细胞移植治疗后发现,实验组的角膜透明度高、新生血管少,角膜评分明显优于对照组(P<0.05)。诱导后的角膜上皮样细胞的角膜上皮标记物ΔNP63和CK12的表达与hESCs H9相比差异...     

外源性基因在兔角膜缘干细胞中的表达及意义

目的 探讨外源性bFGF(fibronlast growth factor,bFGF)基因转染体外培养的兔角膜缘干细胞(human limbal stem cells,LSCs)的可行性.方法 体外培养兔LSCs并用AE5作鉴定.通过脂质体将重组质粒pEGFP-bFGF转染兔LSCs,观察转染结果 ,表达情况及对靶细胞活力的影响.结果 体外成功培养并用AE5鉴定原代免LSCs,基因转染48h后荧光显微镜下可见特异性的绿色荧光,没有发现明显的细胞毒性作用及对细胞活力的显著影响.结论 采用真核质粒可以介导外源性基因转染兔LSCs,为将来采用基因增强组织工程方法 治疗难治性眼表疾病提供初步的实验基础.     

角膜缘干细胞移植后供体干细胞的检测与分析

目的观察新西兰兔角膜缘干细胞移植后供体干细胞数量的变化与角膜上皮化的关系,为角膜缘干细胞移植手术效果提供理论依据.方法新西兰兔30只,分为自体移植和异体移植两组,建立角膜缘干细胞缺损动物模型,分别进行自体和异体角膜缘干细胞移植.术后1周、1月、3月空气栓塞各处死5只,取包括角膜缘的角膜标本,免疫组织化学p63蛋白抗体检测供体干细胞的存活数量和增殖分化状况,比较两组的移植效果.结果自体移植术后1周,供体干细胞仍然局限于受体角膜缘;1个月后,上皮细胞覆盖角膜全层,但是层次非常少;3个月后,干细胞的储备数量基本上恢复到正常水平,角膜完全上皮化.异体移植1周,干细胞的数量有一定的减少;1个月后,角膜缘干细胞储备数量明显减少;3个月后,角膜缘已经检测不到干细胞.结论干细胞的储备数量和增殖分化状况直接影响到角膜上皮化的结局;有效的干细胞检测结果可以为临床角膜缘干细胞移植效果提供依据,p63蛋白抗体可以作为一个检测角膜缘干细胞的特异指标.     

角膜缘干细胞研究进展

刘祖国，中山大学眼科学教授，博士生导师，教育部“长江学者”特聘教授。现任中山大学中山眼科中心副主任，中山大学眼表疾病研究中心主任，兼任国际眼表疾病委员会委员、亚太平洋眼矫形及重建委员会主任及执行委员会成员、中华眼科学会全国角膜病学组委员兼秘书、《中华眼科杂志》等5家杂志编委。研究方向主要为角膜病和眼表疾病。研究成果先后获国家科技进步二等奖3项，省部级科技进步奖10余项。获23项科研课题资助，在国内外著名眼科杂志发表论文100多篇，其中被SCI收录16篇；参与撰写专著15本，主编完成的《角膜地形图学》荣获2003年全国优秀科技图书三等奖。     

人角膜缘干细胞初步建系研究

目的：探讨建立人角膜缘干细胞系，为组织工程研究提供足够的细胞储备。方法：取健康人角膜缘深部色素区组织块，经消化后，在含有RPMI—1640、20％胎牛血清的培养瓶和以羊膜细胞外基质为培养载体的培养皿中分别进行体外培养，并对连续传代的细胞行光镜、扫描电镜观察，比较细胞形态的变化并进行细胞计数与冻存处理。结果：人角膜缘干细胞具有人上皮细胞培养的特性，在培养液中传33代后，细胞仍然保持旺盛的分化、增殖能力，并且更适宜在羊膜细胞外基质上生长；目前我们冻存细胞的复苏率为82．2％。结论：将人角膜缘干细胞经体外培养33代并逐代冻存后初步建立了人角膜缘干细胞系。     

角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉

翼状胬肉是眼科常见病，其发病主要与环境有关，尤其是阳光、沙尘、干燥气候等慢性刺激。手术是治疗翼状胬肉的有效方法，但传统手术方法的复发率高，为降低手术后复发率，我们采用自体角膜缘干细胞移植治疗胬肉，取得了较满意的临床效果．现总结如下：[第一段]     

兔自体血清与胎牛血清培养兔角膜缘细胞的比较性研究

目的：探讨自体血清与来源于同一个体的组织培养之间的关系及比较兔自体血清与胎牛血清培养兔角膜缘细胞的不同。方法：采用组织块培养法,分别采用兔自体血清及胎牛血清培养兔角膜缘细胞。结果：兔血清培养72h,细胞从组织边缘流出,第8天,膜布满整个孔底,第10天细胞呈空泡样,第14天,膜化解;胎牛血清培养48小时,细胞从组织边缘游出,第8天,膜布满整个孔底,第11天细胞呈空泡样,第16天,膜化解。结论：从形态学上观察,兔自体血清和胎牛血清培养的兔角膜缘细胞无明显差别,兔自体血清可用于兔角膜缘细胞的培养。     

兔角膜缘干细胞的体外原代培养和生物学鉴定

目的 建立兔角膜缘干细胞体外培养方法,观察其生物学特性。方法 用含20％胎牛血清1640培养液对兔角膜缘干细胞进行体外培养,倒置显微镜观察培养细胞体外生长的形态,电镜观察培养细胞的超微结构并进行免疫细胞化学和间接免疫荧光鉴定。结果 植块48～72h细胞开始贴壁生长,7～10d形成良好的单层,细胞呈圆形、卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接,胞质丰富,胞质细胞器较多,含有线粒体等结构;免疫细胞化学和间接免疫荧光染色显示,培养第8天少量细胞角蛋白K3(AE5)免疫反应呈阳性,细胞质被染色,培养第14天和第21天,较多细胞．AE5免疫反应阳性。结论 含20％胎牛血清1640培养液能作为角膜缘干细胞培养的基础液。应用组织培养方法获得的原代培养细胞具有与正常角膜缘干细胞相一致的生物学特性。     

结膜下角膜缘干细胞移植

本科采用自体结膜下角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉取得了良好效果。报告如下。