-70℃超低温冻存细胞的实验研究

[目的]探索-70℃超低温条件冻存细胞的可行方法。[方法]用-70℃超低温冰箱冻存对数生长期的C6／36、BHK-21、Vero和MDCK细胞，冻存30、60和90d后，37℃水浴复苏，用MTT法测定细胞活性，计算冷冻存活率；同时观察复苏细胞形态，并与液氮冻存方法同步比较。[结果]-70℃冻存后复苏细胞均可获得90％以上的存活率，与液氮冻存细胞的复苏效果类似。光镜下显示，冻存细胞均可在拟定的冻存期内成功复苏。复苏即时镜下90％以上的细胞呈现良好的活细胞形态悬浮在培养基中。[结论]-70℃超低温冰箱冻存细胞的方法可行，尤其适用于基层或液氮来源困难地区开展细胞培养研究。     

体外人原代肝细胞分离与培养及冻存研究

目的通过对人原代肝细胞分离、培养、冻存,研究冻存前后肝细胞的形态功能,以期为生物人工肝、肝细胞移植的研究及应用提供细胞来源。方法采用多点穿刺两步灌流法分离原代肝细胞,体外预培养24 h,经程序降温盒冷冻法短期冻存。复苏后对细胞的活力、形态、微生物污染及相关功能基因表达进行测定。结果复苏后,肝细胞存活率达到(71.6±2.2)%,相较新鲜分离的肝细胞,存活率达到90%以上,体外培养时间长达12天,无微生物污染,复苏前后白蛋白(ALB)、谷氨酰胺合成酶(GS)、氨甲酰磷酸合酶1(CPS1)以及细胞色素酶P450 3A4(CYP3A4)功能基因表达无统计学差异(P>0.05)。结论初步建立了人原代肝细胞分离、培养、冻存方法,为生物人工肝及相关肝细胞治疗奠定了研究基础。     

Cryoloop和CPS超速玻璃化冷冻人三原核胚胎效果比较

目的:比较冷冻环(Cryoloop)和闭合型拉细麦管(CPS)超速玻璃化冷冻方法冻存人早期卵裂期胚胎的效果差异,以期建立1种有效的超速玻璃化冷冻方法。方法:将人三原核孕卵发育形成的126个6-10细胞胚胎随机分为3组:对照组30个、Cryoloop组36个和CPS组60个。通过形态学观察,比较胚胎复苏后存活率;经罗丹明123染色,激光扫描共聚焦显微镜摄片分析,测定复苏后存活胚胎线粒体跨膜电位(△Ψm)。结果:Cryoloop组复苏后胚胎存活率达100%,显著高于CPS组(P<0.05);Cryoloop组△Ψm显著高于CPS组(P<0.05),而与未冷冻对照组相比,无明显差异(P>0.05)。结论:Cryoloop超速玻璃化冷冻法获得了更高的胚胎存活率和胚胎活力,该方法更适于冷冻人早期卵裂期胚胎。     

两种冷冻方法对人卵巢组织冻存效果的分析

目的:比较程序化冷冻与玻璃化冷冻人卵巢组织的冻存效果。方法:收集19例人卵巢组织标本,每例分成2份,1份应用程序化方法冷冻,另1份应用玻璃化方法冷冻,复苏后分别移植到去卵巢的雌性裸鼠颈部皮下。38只重症联合免疫缺陷(SCID)裸鼠(移植宿主)随机分为2组:A组19只,移植程序化冷冻复苏的人卵巢组织;B组19只,移植玻璃化冷冻复苏的人卵巢组织。以去除移植宿主双侧卵巢日为D0,移植人卵巢组织日为D21,整个实验过程中,每日通过阴道脱落细胞学检查观察移植宿主动情周期变化,分别于D0、D21、D42、D63取裸鼠静脉血,酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测血清AMH浓度。结果:切除卵巢后移植宿主动情周期消失,D63共有14只裸鼠恢复动情周期,2组间差异无统计学意义(A组8只,B组6只,P0.05),但A组恢复时间显著少于B组[(16.38±1.60)d vs.(18.33±1.21)d,P0.05]。2组间AMH水平在D0、D21、D42、D63差异均无统计学意义(P0.05),但A组、B组D21 AMH水平均显著低于D0,差异有统计学意义(P0.05)。恢复动情周期移植宿主的AMH水平在D42和D63逐渐回升但未恢复至D0水平,未恢复动情周期移植宿主的AMH水平在D42和D63均未回升但仍低于D0。结论:程序化冷冻和玻璃化冷冻均能有效保存卵巢组织。在冷冻的卵巢组织经解冻-移植后宿主恢复动情周期方面,程序化冷冻要优先于玻璃化冷冻,但仍需进一步研究。     

液氮直投及程序冷冻冻存人卵巢组织的研究

目的 液氮直投法及程序冷冻法冻存人卵巢组织效果的比较研究.方法 采用液氮直投法及程序冷冻法冻存人卵巢组织,解冻后苏木素-伊红染色检测冷冻前后各级卵泡(始基卵泡、初级卵泡和次级卵泡)的组织形态,然后将卵巢组织体外培养3天,检测培养上清雌激素水平.结果 液氮直投法、程序冷冻法始基卵泡形态正常率分别为72.96%、81.87%,差异有统计学意义(χ2=11.27,P<0.05);初级卵泡形态正常率分别为58.62%、34.48%,差异有统计学意义(χ2=6.79,P<0.05).第3天、第6天血清雌激素水平检测,液氮直投法与程序冷冻法比较差异无统计学意义(108.38±9.27 vs 105.15±9.13,151.08±16.64 vs 147.38±20.48,均P>0.05).结论 程序冷冻法以及液氮直投法可有效保存卵巢组织,对卵巢组织和功能的影响较小,而且液氮直投法操作更简便、快捷.     

不同营养支持方案对早产儿生长发育的效果研究

目的分析不同营养支持方案对早产儿生长发育的影响。方法选取90例早产儿,采用随机数字表法分为3组,A组采用定量肠外营养支持方案、B组采用母乳喂养方案、C组采用配方奶喂养方案,观察并分析3组早产儿出院前体重、头围和身长增长速率、不良反应以及随访6~12月智力发育情况。结果 C组治疗后体重增长速率[(17.34±4.02)g/kg·d]明显优于A组[(13.34±3.23)g/kg·d]和B组[(13.98±3.98)g/kg·d],差异有统计学意义(P0.01);C组身长增长速率[(1.18±0.40)cm/周]明显优于A组[(0.90±0.32)cm/周]和B组[(0.91±0.33)cm/周],差异有统计学意义(P0.01);C组治疗后头围增长速率[(0.83±0.18)cm/周]明显优于A组[(0.71±0.12)cm/周]和[B组(0.70±0.11)cm/周],差异有统计学意义(P0.01);3组智力发育情况比较,B和C组智力发育明显优于A组(P0.01),而B和C组比较无统计学差异(P0.05);3组在肝肾功能指标以及并发症比较无统计学差异(P0.05)。结论配方奶喂养营养支持相对母乳喂养和场外营养支持能够达到理想的营养状态,临床上应该给予进一步研究推广。     

2型糖尿病患者翼状胬肉切除3种术式的疗效分析

[目的]比较3种疗法治疗2型糖尿病患者初发性翼状胬肉的临床疗效分析。[方法]糖尿病翼状胬肉112例(118眼),实行随机双盲,分别采用0.1%丝裂霉素C+单纯切除术(A组,36眼)、0.1%丝裂霉素C+羊膜移植术(B组,42例)、0.1%丝裂霉素C+自体带球结膜瓣的角膜缘干细胞移植术(C组,40眼),术后跟踪随访9～18个月,比较创面修复时间及胬肉复发率。[结果]复发率A组33.3%(12/36),B组9.5%(4/42),C组7.5%(3/40),C组较低(2=11.449,P0.05);角膜上皮愈合时间A组(3.49±0.66)d,B组(7.83±0.79)d,C组(5.65±0.71)d,A组愈合较快。[结论]采用0.1%丝裂霉素C+自体带球结膜瓣的角膜缘干细胞移植术治疗糖尿病患者初发翼状胬肉,既有效预防复发,又减少并发症。     

MDCK、HEp-2、Vero细胞混合冻存适用于分离培养常见病毒研究

目的建立犬肾细胞（MDCK）、人喉表皮癌细胞（HEp-2）和非洲绿猴肾细胞（Vero）3种细胞（MHV）混合细胞瓶冻存复苏方法,经冻存复苏的混合细胞用于分离常见呼吸道和肠道病毒,建立病毒性病原检测的方法学平台。方法对数生长期的MDCK、HEp-2和Vero细胞等量保存在含8%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DM-SO）冷冻保存液中,液氮经冻存4个月后复苏并进行细胞计数;在复苏后0 h、24 h和48 h倒置显微镜下观察细胞形态、细胞汇合;并用于分离培养常见呼吸道、肠道病毒,观察致细胞病变效应,采用直接与间接免疫荧光法鉴定。结果在液氮中保存4个月的MHV混合细胞,细胞复苏存活率超过99.20%,镜下细胞折光度好,细胞形态良好,均见到相应的致细胞病变效应和免疫荧光检测阳性结果。结论 MDCK、HEp-2和Vero细胞等量保存在含8%DM-SO冷冻保存液中液氮保存4个月复苏存活率高。混合细胞直接冻存复苏方法建立,为常见的病毒性病原分离培养提供了宽泛的合适细胞宿主,保证了病毒性传染病的快速诊断、实验室病毒性传染病监测的可操作性。     

不同冷冻速率在Vero细胞冻存复苏中的应用效果分析

目的：为了选择Veto细胞最佳的冷冻速率。方法：对Vero细胞应用不同的速率进行冻存，观察复苏效果。结果：采用一步直接法可获得90％以上的复活率。结论：不同的细胞具有不同的特性，其在冷冻过程中的生理变化及对保护剂的要求也不同，并具有不同的最适冷冻速率。     

永生化人晶状体上皮细胞的体外培养

目的:建立永生化人晶状体上皮细胞(Human lens epithelial cell,HLEC)培养、冻存与复苏技术。方法:传代培养人晶状体上皮细胞系B-3,并进行细胞冻存与复苏,台盼蓝染色法判断细胞活力。结果:接种后的HLEC在短时间内即可贴壁及延伸,12～24 h后大部分细胞贴壁生长,具有上皮细胞的形态特点,约3～4 d细胞基本融合。冻存后复苏的HLEC活力超过90%,保持正常的细胞形态,并可长期传代培养。结论:成功建立永生化HLEC培养、冻存与复苏技术,为白内障相关研究提供理想的细胞材料。     

卵子玻璃化冷冻在体外受精胚胎移植周期中的临床应用

目的:探讨卵子玻璃化冷冻保存的可行性,更好提高卵子复苏率、受精率,提高卵子冻存患者的妊娠率。方法:在河北医科大学第二医院生殖医学门诊行体外受精胚胎移植(IVF-ET)患者中,由于取卵日男方取精失败行卵子冻存。于2011年2月～2012年8月共行5例患者卵子冻存并复苏。结果:冷冻MII卵子55枚,复苏率94.5%(52/55),受精率92.3%(48/52),卵裂率95.8%(46/48),移植胚胎11枚,临床妊娠3例,冷冻保存胚胎22枚。结论:卵子玻璃化冷冻是可行的,可应用于取卵日取精困难的患者。     

输卵管积水对新鲜胚胎移植和冻融胚胎移植妊娠结局的影响

目的 探讨输卵管积水对体外受精新鲜胚胎移植和冻融胚胎移植临床结局的影响。方法 回顾性分析2017年1月至2020年6月因输卵管因素在郑州大学第二附属医院生殖中心行常规体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)治疗的496例不育患者的资料,按IVF-ET前患者输卵管积水的发生和移植情况分为：A组无积水组并新鲜胚胎移植181例;B组新鲜胚胎移植当天行输卵管积水抽吸术51例;C组因输卵管积水行胚胎冷冻,积水治疗后首次复苏移植,根据复苏距离取卵时间分为C1(≤1年)136例,C2(>1年)84例;D组为暂行胚胎冷冻,复苏移植当日行积水抽吸术44例。比较各组妊娠结局。结果 A组的临床妊娠率(69.1%)明显高于B组(54.9%)和C、D组(55.0%和54.5%)(P<0.05),A组的种植率(41.9%)也高于其他组(B组34.5%,C组33.0%,D组32.9%)(P<0.05),获卵数A组(9.4±6.1)低于其他各组(P<0.05),多胎妊娠率A组(15.2%)高于B组(3.9%),受...     

玻璃化冷冻法在未成熟卵子冷冻技术中的应用

目的:探讨玻璃化冷冻法在未成熟卵子冷冻方面的应用价值。方法:选取GV期卵母细胞744枚,随机分为5组,A组(128枚),GV期卵子直接进行未成熟卵母细胞体外培养(IVM);B组(220枚),GV期卵子直接行玻璃化冷冻;C组(155枚),GV期卵子直接行IVM,待培养至MⅡ期,再行玻璃化冷冻;D组(112枚),GV期卵子去除冠-丘细胞,行玻璃化冷冻;E组(129枚),GV期卵子保留除冠-丘细胞行玻璃化冷冻。比较各组卵母细胞的存活率、成熟率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果:与A组相比,B组和C组的成熟率、受精率、卵裂率和囊胚形成率均降低(P<0.05);B组与C组间存活率、成熟率、受精率、卵裂率和囊胚形成率无差异(P>0.05)。E组的成熟卵子率较D组提高(P<0.05),但两组在解冻卵子存活率、受精率、2细胞数和>2细胞数方面无差异(P>0.05)。结论:未成熟卵子的玻璃化冷冻保留冠-丘细胞可显著提高冻融效果。     

冷冻联合咪喹莫特乳膏治疗肛周尖锐湿疣的临床研究

[目的]探讨泠冻联合味喹莫特乳膏治疗肛周尖锐湿疣的临床疗效和安全性.[方法]将120例患者随机分为3组,每组各40例,联合组(A组):冷冻术后局部外用咪喹莫特乳膏;泠冻组(B组):用冷冻治疗;咪喹莫特组(C组):仅外用咪喹莫特.疗程均8周.疗程结束后治愈病例继续随访3个月,观察3组患者复发情况.[结果]A、B、C 3组治疗后2周、4周、6周、8周治愈率分别为12%、45%、70%、92.5%;10%、20%、45%、65%;0%、15%、35%、52.5%.A分别与B、C两组相比,P＜0.05,差异有统计学意义.A、B、C 3组疗程结束后治愈病例继续随访3个月,观察3组患者复发率分别为2.7%、15.4%、33.3%.A、C 2组眯喹莫特乳膏的局部不良反应发生率为50%、40%,P＞0.05,差异无统计学意义.主要表现为用药局部红斑、瘙痒、水肿、灼热、疼痛和糜烂,其局部不良反应容易耐受而且暂停用药后适宜处理可痊愈,无系统性不良反应.[结论]冷冻联合咪喹莫特乳膏治疗肛周尖锐湿疣有较好的临床疗效,安全性高.     

白藜芦醇苷对大鼠睾丸扭转缺血和再灌注损伤的保护作用

目的 探讨白藜芦醇苷对大鼠睾丸扭转的保护作用。 方法 选取4周龄雄性SD大鼠36只,随机分为3组:假手术组(A组)、扭转复位组(B组)、扭转复位+白藜芦醇苷组(C组)。B组和C组大鼠建立睾丸扭转复位模型,A组不扭转。扭转4 h后复位睾丸,复位前15 min B组腹腔注射生理盐水1 ml;C组腹腔注射白藜芦醇苷1 ml(5.0 mg/kg)。复位后4 h处死所有动物取睾丸待测。以原位缺口末端标记法(TUNEL)检测生精细胞凋亡指数;化学比色法测定睾丸组织中总抗氧化能力(T-AOC)活性,羟胺法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,TBA法测定丙二醛(MDA)含量;精密称重睾丸后睾丸组织HE染色观察组织形态变化。 结果 B组T-AOC[(20.31±2.55)U/mg]、SOD[(72.76±5.58)U/mg]比A组[(33.62±3.29)U/mg]、[(165.33±5.42)U/mg]明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05),而C组T-AOC[(30.05±2.08)U/mg]、SOD[(103.15±14.16)U/mg]较B组明显升高(P＜0.05)。B组MDA[(42.38±8.94)U/mg]比A组[(11.51±1.89)U/mg]明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05),而C组[(23.87±4.47)U/mg]较B组明显减低(P＜0.05);C组凋亡指数[(12.2±1.34)％]较B组显著下降(P＜0.05);B组睾丸扭转复位后损伤的组织学改变较A组损伤明显;生精小管变薄,细胞脱落坏死。C组的组织学改变较B组明显改善;生精小管变薄减少,细胞脱落坏死减少。 结论 白藜芦醇苷具有明显对抗睾丸扭转复位后的氧化损伤,对因睾丸扭转导致的缺血再灌注损伤具有保护作用。     

不同冷冻方案对人早期胚胎发育潜能的影响

目的:比较开放式、封闭式玻璃化冷冻技术及程序化慢速冷冻法对辅助生殖技术人早期胚胎冷冻复苏的效果.方法:回顾性分析622例胚胎冷冻复苏资料,将体外受精-胚胎移植(ⅣF-ET)患者第3天需要冷冻的胚胎,分别采用开放式、封闭式麦管玻璃化法及程序化慢速冷冻法冷冻,比较3组胚胎复苏率、空泡出现率、胚胎完整率、植入率、临床妊娠率、周期取消率、胚胎丢失率及流产率.结果:开放式冻存组共复苏280个周期、627个胚胎,胚胎复苏率、胚胎完整率、植入率和临床妊娠率分别为97.13％、94.89％、28.90％、52.61％,与程序化冷冻组(复苏165个周期、477个胚胎)胚胎复苏率(73.79％)、胚胎完整率(70.02％)、植入率(16.75％)和临床妊娠率(35.44％)相比差异有统计学意义(P＜0.05),与封闭式冻存组(复苏177个周期、400个胚胎)相比差异均无统计学意义(P＞0.05),3种冷冻组空泡出现率、周期取消率、胚胎丢失率及流产率差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:两种玻璃化冷冻法能获得同样的冷冻效率,且均优于程序化冷冻法;封闭式麦管玻璃化法能更好地保存胚胎复苏后的发育潜能,是冻存人早期胚胎较为理想的方法.     

贵州省水族和仡佬族永生细胞系建立

目的建立贵州省水族和仡佬族少数民族永生细胞系, 为生命科学研究提供技术支持。方法采用EB病毒(EBV)感染和环孢霉素A(CyA)处理方法, 对来自贵州省三都县的144名水族和来自务川县的124名仡佬族人群外周静脉血B淋巴细胞进行转化, 并对转化的细胞进行细胞形态学观察, 用直接计数法绘制转化细胞的生长曲线并计算细胞倍增时间, 对转化的细胞进行传代、冻存和复苏实验, 采用培养法进行支原体污染检测。结果成功建立了138个水族和115个仡佬族人群的永生化B淋巴细胞株, 转化率分别为95.8%和92.7%;转化的B淋巴细胞呈现典型的细胞变形和克隆化生长特点, 能持续传代、冻存复苏后生长良好, 无支原体污染。结论贵州省水族和仡佬族人群B淋巴细胞被成功转化为永生化细胞系。     

冷冻膜及冷冻环在人早期胚胎玻璃化冷冻中的应用比较北大核心CSCD

目的探讨冷冻膜和冷冻环2种载体行玻璃化冷冻对人卵裂期胚胎和囊胚的效果。方法采用回顾性队列研究分析912个解冻复苏周期,比较2种载体行玻璃化冷冻后胚胎复苏结局和临床结局的差异及其相关危险因素。结果 (1) 385枚卵裂期胚胎中,冷冻环组(n=251)和冷冻膜组(n=134)的胚胎复苏率、完整胚胎存活率、临床妊娠率、种植率、流产率、移植周期出生率、双胎出生率、早产率及出生男女比率差异均无统计学意义(P>0.05);冷冻环组新鲜周期优质胚胎率(24.78%)、平均移植周期数(1.3±0.6)、复苏后优质胚胎率(40.76%)、复苏后平均移植胚胎数[(2.1±0.4)个]及低体质量儿出生率(19.01%)均明显高于冷冻膜组[18.59%,P=0.002;1.2±0.4,P=0.001;28.13%,P=0.001;(1.9±0.4)个,P=0.000;4.08%,P=0.015]。(2) 527枚囊胚中,冷冻环组(n=287)和冷冻膜组(n=240)的平均移植周期数、胚胎复苏率、完整胚胎存活率、复苏后囊胚扩张率、流产率、双胎出生率、早产率、低体质量儿出生率及出生男女比率差异均无统计学意义(P>0.05);冷冻环组的临床妊娠率(67.94%)、种植率(49.72%)、移植周期出生率(52.96%)、新鲜周期优质胚胎率(27.0%)、平均移植胚胎数[(1.9±0.4)个]显著高于冷冻膜组[54.17%, P=0.001;39.58%,P=0.002;41.25%,P=0.047; 23.0%, P=0.002;(1.8±0.5)个,P=0.004]。Logistic回归显示,新鲜周期优质胚胎数、内膜厚度及冷冻胚胎所用载体类型与冷冻囊胚复苏移植后临床妊娠密切相关(P=0.017、P=0.049、P=0.044),而年龄、复苏后平均移植胚胎个数、复苏后囊胚扩张数、平均移植周期数及内膜分型等差异均无统计学意义(P>0.05)。结论对于卵裂期胚胎,冷冻膜和冷冻环冷冻胚胎的复苏结局和临床结局均是相当的。对于囊胚,冷冻环组的临床结局优于冷冻膜组。     

胚胎卵裂球数及取卵后2天和3天冷冻对冻融胚胎移植临床结局的影响

目的：探讨胚胎卵裂球数及取卵后2天（D2）和3天（D3）冷冻对胚胎的复苏效果以及冻融胚胎移植（FET）临床结局的影响。方法：回顾性分析2010年1月—2012年5月行FET的417个周期的临床资料,分别按胚胎冷冻的时间（D2/D3）、卵裂球数、移植优质胚胎数进行分组,比较各组的胚胎复苏效果及临床结局。结果：D2≥4-细胞组的胚胎复苏率和卵裂球全存活率显著高于D2＜4-细胞组（89.35% vs. 79.11%,42.01% vs. 30.22%,P＜0.05）;D3≥6-细胞组的胚胎复苏率和卵裂球全存活率显著高于D3＜6-细胞组（86.52% vs. 72.43%,41.13% vs. 31.07%,P＜0.01）。D2组冷冻胚胎复苏后的优质胚胎率（56.84%）高于D3组（48.82%）,但D3组FET临床妊娠率（38.52%）高于D2组（27.61%）,差异均有统计学意义（P＜0.05）,2组间胚胎复苏率和流产率差异无统计学意义（83.50% vs. 79.44%,10.81% vs. 10.09%,P＞0.05）。随着移植优质胚胎数的增加,临床妊娠率和多胎率增加,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：D2≥4-细胞和D3≥6-细胞的胚胎冻融效果较好,D3冷冻胚胎的FET临床结局优于D2冷冻胚胎。     

OPS法玻璃化冷冻未成熟卵母细胞的效果观察

目的:探讨OPS(open pu lled straw,开放式拉细麦管)法玻璃化冷冻技术冻存未成熟卵母细胞的效果。方法:小鼠GV期卵母细胞用OPS法玻璃化冷冻复苏后行体外成熟培养(in-vitro m aturation,IVM)或直接行IVM,所获成熟卵行体外受精(IVF)和胚胎的体外培养(IVC)。以体内成熟卵行IVF/IVC作为in-vivo对照组。结果:GV期卵冻融后65.11%存活,IVM后成熟率为52.86%,其成熟率显著低于IVM对照组。冻融卵成熟后受精、卵裂率(33.78%、76.00%)低于IVM对照组和in-vivo对照组,培养后未见囊胚形成。结论:OPS法玻璃化冷冻技术可有效冻存GV期卵母细胞,复苏后可发育成熟,但卵的受精和继续发育能力欠佳。