冷冻联合免疫疗法治疗无法手术的转移性乳腺癌

目的：研究冷冻联合DC-CIK（ dendritic cell-cytokine-induced killer）免疫疗法治疗转移性乳腺癌的疗效。方法回顾性分析2002年5月至2012年5月本院收治的120例转移性乳腺癌患者（共计222个转移灶）的临床资料,其中35例患者接受冷冻联合DC-CIK免疫疗法治疗（冷冻联合免疫疗法组）,29例患者接受冷冻联合化疗（冷冻联合化疗组）,27例患者接受冷冻治疗（冷冻治疗组）,29例患者接受化疗（化疗组）。在27例仅接受冷冻治疗的患者中,有18例患者接受单次冷冻治疗,9例患者接受多次冷冻治疗。对所有患者进行定期随访,总生存期以诊断为转移性乳腺癌时开始计算。采用单因素方差分析、Kruskal-Wallis检验和Friedman检验比较患者的一般情况。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,各组患者总生存期的比较采用Log-rank检验。结果冷冻联合免疫疗法组中位生存期为83（69．5~113．0）个月,冷冻联合化疗组中位生存期为48（30．0~64．0）个月,冷冻治疗组的中位生存期为43（30．5~53．0）个月,化疗组中位生存期为27（18．0~41．0）个月,4组间差异有统计学意义（χ2=20．30, P=0．000）;其中,冷冻联合免疫疗法组总生存期显著长于冷冻联合化疗组、冷冻治疗组和化疗组（χ2=27．58,P=0．000;χ2=27．76,P=0．000;χ2=74．21, P=0．000）。在冷冻治疗组中,多次冷冻组与单次冷冻组的中位生存期分别为54（37．0~67．0）个月和35（28．0~48．5）个月,多次冷冻组总生存期显著长于单次冷冻组（χ2=6．25,P=0．012）。各组乳腺癌患者均未发生严重的术后并发症。结论冷冻联合免疫疗法能显著延长无法手术的转移性乳腺癌患者的总生存期。     

木鳖子醇提物诱导小鼠黑素瘤B16细胞分化的作用机制

目的:探讨木鳖子醇提物(ethanol extract of cochinchina momordica seed,CMSEE)诱导黑素瘤B16细胞分化的作用机制。方法:CMSEE处理B16细胞后,瑞氏染色法观察B16细胞的形态变化;比色法检测B16细胞的黑素含量。Westernblotting检测经CMSEE和p38、ERK通路抑制剂SB203580、SD98059分别处理后B16细胞中p-p38、p-ERK表达的变化。结果:CMSEE可诱导B16细胞分化,使细胞的黑素量含量明显升高(P<0.01),10、20、40μg/ml CMSEE处理组B16细胞的黑素量D值分别为(0.057±0.007)、(0.173±0.005)和(0.249±0.002),而对照组为(0.037±0.002)。20μg/ml CMSEE处理B16细胞后,p-p38蛋白表达水平明显升高,处理60 min时的相对表达量最高,为对照组的5.6倍;而p-ERK表达水平明显降低(P<0.01),处理60 min时的相对表达量为对照组的25%倍。p38通路抑制剂SB203580可阻断CMSEE对B16细胞的分化诱导作用,而ERK通路抑制剂SD98059可增强CMSEE对B16细胞的分化诱导作用。结论:p38通路和ERK通路的活化参与了CMSEE对B16细胞的分化诱导作用。     

冷冻影响肝癌细胞HLA和B7分子表达的实验研究

目的：探讨冷冻治疗后机体免疫功能提高的机制。方法：应用流式细胞仪检测人肝癌细胞经0℃或－20℃冷冻后，HLA和B7分子表达率和平均荧光强度的变化。结果：0℃组与对照组比较，HLA－Ⅰ分子和B7－2分子的表达率和平均荧光强度均无明显变化；HLA－Ⅱ分子和B7－1分子的表达率增高，平均荧光强度增强。－20℃组与对照组比较，HLA－Ⅰ、HLA-Ⅱ、B7-1和B7－2分子的表达率均增高，平均荧光强度均增强。－20℃组和0℃组比较，HLA－Ⅱ和B7－1分子的表达率和平均荧光强度均无显著性差异；HLA－Ⅰ和B7－2分子表达率均增高，平均荧光强度均增强。结论：0℃和－20℃冷冻可增强人肝癌细胞HLA和B7分子的表达，这可能是冷冻治疗提高机体免疫功能的机制之一。     

双歧杆菌对小鼠黑素瘤B16细胞增殖和细胞周期的影响

目的：探讨双歧杆菌对小鼠恶性黑素瘤B16细胞的增殖及细胞周期的影响。方法：用MTT比色法测定B16细胞活力,用H-E染色法观察B16细胞形态,用流式细胞术测定B16细胞周期。结果：1×10^9cfu/ml的双歧杆菌作用B16细胞24h后,细胞增殖抑制率为36.69%;1×10^8cfu/ml的双歧杆菌作用B16细胞72h后,抑制率为63.47%;由此可见,双歧杆菌对B16细胞具有显著的增殖抑制作用。经双歧杆菌处理后,B16细胞核浆比例下降,细胞变小,核仁减少,说明B16细胞胞质和细胞核都趋于成熟化;经双歧杆菌处理后B16细胞周期阻滞于G1期[对照组和处理组G1期细胞比例分别为（41.22±1.15）%和（67.25±3.13）%],但凋亡作用不明显[处理组凋亡率为（1.87±0.04）%]。结论：双歧杆菌通过影响细胞周期抑制B16细胞的生长。     

木鳖子单体化合物对羟基桂皮醛诱导小鼠黑素瘤B16细胞的分化及其机制

探讨从中药木鳖子中提取的单体化合物对羟基桂皮醛（p-hydroxylcinnamaldehyde,PHD）对小鼠黑素瘤B16细胞分化的影响及其可能的作用机制。方法: 以10、20、40 μmol/L PHD作用B16细胞,设空白对照及福司克林（Forskelin）阳性对照组。磺酰罗丹明（suphrhodamineB,SRB）法检测PHD对B16细胞生长的抑制率,平板克隆集落形成实验检测细胞的克隆形成能力,Giemsa 染色观察细胞形态,比色法检测细胞中黑色素含量和酪氨酸酶（tyrosinase,Tyr）活性,划痕愈合实验检测细胞的迁移能力,Western blotting检测Tyr、酪氨酸酶相关蛋白1（tyrosinase protein,Trp1）及MAPK信号转导通路中p-P38、p-JNK和p-ERK1/2的表达。结果：PHD对黑素瘤B16细胞具有明显的增殖抑制作用,10、20、40 μmol/L PHD作用B16细胞48 h后,其增殖抑制率与对照组相比明显增加[（12.78±0.87）%、（37.70±2.28）%、（42.17±4.18）% vs 0,P<0.05],20、40 μmol/L PHD组增殖抑制率与Forskelin组相比明显增加[（37.70±2.28）%、（42.17±4.18）% vs（22.00±1.13）%,P<005]。40 μmol/L PHD处理B16细胞24、48、72 h后,B16细胞呈典型分化形态,黑色素含量及Tyr活性与对照组相比均明显增加[（0097±002）、（0.13±0.04）、（0.15±0.05）vs（0.085±0.003）;（1.11±0.31）、（1.43±0.05）、（1.67±0.49）vs (0.64±010）,P<005];细胞集落形成能力和迁移能力都明显降低（均P<0.05）。与空白对照组相比,PHD处理组细胞Tyr和Trp1的表达明显增加（P<0.05）,MAPK信号通路中p-P38和p-JNK的表达水平也明显增加（P<0.05）,而p-ERK活性差异则无统计学意义（P>0.05）。结论：PHD通过上调MAPK信号通路中p-P38和p-JNK的活性而对小鼠黑素瘤B16细胞产生明显的增殖抑制,并在形态和功能上诱导黑素瘤细胞的分化。     

双歧杆菌对小鼠黑素瘤B16细胞增殖和细胞周期的影响

目的: 探讨双歧杆菌对小鼠恶性黑素瘤B16细胞的增殖及细胞周期的影响。方法:用MTT比色法测定B16细胞活力，用HE染色法观察B16细胞形态，用流式细胞术测定B16细胞周期。结果:1×109 cfu/ml的双歧杆菌作用B16细胞24 h后，细胞增殖抑制率为36.69％；1×108  cfu/ml     

围冷冻手术期施行免疫疗法的抗肿瘤作用

目的 通过动物实验总结冷冻外科联合生物免疫治疗恶性肿瘤的经验,为临床应用提供依据。方法 将接种黑色素瘤Ｂ１６的荷瘤小鼠Ｃ５７ＢＬ／６随机分为冷冻免疫治疗组,冷冻对照组,免疫对照组,盐水对照组。实验组在围冷冻手术期,去除免疫抑制,配合生物免疫治疗,强化抗肿瘤免疫作用;其他３个对照组分别进行冷冻治疗,免疫治疗,注射生理盐水。     

木鳖子醇提物对黑素瘤B16细胞增殖的抑制及其可能机制

目的：观察木鳖子醇提物(ethanol extract from cochinchina momordica seed, CMSEE)对黑素瘤B16细胞增殖的影响,初步探讨其作用机制。方法：MTT法和克隆集落形成实验检测CMSEE对小鼠黑素瘤B16细胞生长的影响,倒置相差显微镜和瑞氏吉姆萨染色观察细胞形态学变化,流式细胞技术（FCM）检测B16细胞周期分布和凋亡率的变化,比色法检测CMSEE对B16细胞黑素生成和酪氨酸酶活性的影响,RTPCR法检测CMSEE对B16细胞中Cmyc、〖STBX〗P38和Tyr〖STBZ〗基因表达的影响。结果：CMSEE（10～100 mg/L）明显抑制B16细胞的增殖(P<0.05, P<0.01),呈质量浓度和时间依赖性。10～40 mg/L CMSEE处理后,B16细胞呈现典型的细胞分化形态,细胞周期阻滞于G0/G1期,黑素产生和酪氨酸酶活性增加(P<0.01),Cmyc基因表达下调,〖STBX〗P38和Tyr〖STBZ〗基因表达上调;100 mg/L CMSEE处理后的B16细胞呈现凋亡形态变化\[凋亡率达(37.2±329)%\],黑素生成减少(P<0.05),酪氨酸酶活性降低(P<0.01)。结论：CMSEE体外对B16细胞增殖有明显的抑制作用,其机制与其低剂量诱导分化和高剂量诱导凋亡有关。     

晚期黑素瘤免疫及靶向治疗的研究进展

随着v-raf鼠类肉瘤滤过性病毒致癌基因同源体B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)基因作为一种驱动基因被发现,以及对于机体免疫系统认知的提高,使得针对转移性黑素瘤的靶向治疗和免疫治疗获得了较大的发展。对于经过优选的患者采用靶向治疗的临床疗效取得了可喜的进展,但在大多数患者中,耐药似乎不可避免。然而,通过"免疫检查点阻断"的方法解除T细胞的免疫抑制,可提高机体免疫系统的抗肿瘤能力,并且使应答持续时间延长。因此,免疫治疗和靶向治疗的联合治疗,将优于单一方案的治疗。现就晚期黑素瘤的免疫治疗和靶向治疗的最新进展作一综述。     

慢病毒载体介导 CDK2 基因沉默对黑素瘤B16-F1细胞生物学行为的影响

目的:探讨由慢病毒载体pUL介导的pUL-CDK2-shRNA3 (CDK2-shRNA)沉默CDK2基因后对小鼠黑素瘤B16-F1细胞恶性生物学行为的影响,初步探索其作用机制.方法:利用重组慢病毒载体CDK2-shRNA转染B16-F1细胞,MTT法检测其对细胞增殖的影响,DAPI染色、AnnexinV-FITC/PI双染流式术检测细胞凋亡情况,流式术检测细胞周期变化,细胞黏附实验、transweU小室实验分别检测细胞黏附、侵袭和迁移能力变化,Western blotting检测细胞周期信号通路上RB蛋白(成视网膜细胞瘤蛋白)、pRB蛋白、细胞周期相关转录因子E2F1及侵袭迁移相关蛋白基质金属酶-2(MMP-2)、基质金属酶-9(MMP-9)的表达水平.结果:与空白对照组和阴性对照组相比,CDK2-shRNA组细胞相对增殖率、细胞黏附率、细胞侵袭和迁移能力均显著下降(均P＜0.05).细胞凋亡率显著增加(均P＜0.05);G1期细胞显著增加而S期和G2期显著降低(P＜0.05).细胞周期相关蛋白pRB、E2F1明显降低而RB显著升高(P＜0.05),细胞侵袭和迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9明显降低(P＜0.05).结论:慢病毒载体pUL介导的shRNA沉默CDK2基因对B16-F1细胞恶性生物学行为有显著的抑制作用,其机制主要与细胞周期和细胞侵袭迁移相关蛋白表达变化有关.     

OK-432 INHIBITED B16 MELANOMA GROWTH AND INDUCED A TH1 DOMINANT STATE IN TUMOR BEARING MOUSE

OK-432 was produced by culturing a low virulence Su strain of Type III, Group A streptococcus pyogens of human origin in Bernheimers basal medium supple- mented with penicillin G potassium. It has been extensively used as an adjuvant immune-potentiator for cancer therapy in Japan. Concurrent administration of OK-432 with chemotherapy has led to an improvement of the survival rate of caner patient[1]. The antitumor mechanism of OK-432 has been investigated extensively. It has been reporte…     

亚硒酸钠和维甲酸联合对HL—60细胞DNA与蛋白质合成和细胞周期的影响

目的观察亚硒酸钠和维甲酸联合作用对ＨＬ┐６０细胞ＤＮＡ与蛋白质合成和细胞周期的影响。方法以人早幼粒白血病细胞（ＨＬ┐６０）为实验对象，利用３Ｈ┐脱氧胸苷（３Ｈ┐ＴｄＲ）和３Ｈ┐亮氨酸（３Ｈ┐Ｌｅｕ）参入实验以及流式细胞仪进行分析。结果５．８μｍｏｌ／Ｌ亚硒酸钠和０．１μｍｏｌ／Ｌ维甲酸（ＲＡ）联合可显著抑制ＨＬ－６０细胞的ＤＮＡ和蛋白质合成，联合作用强于两者单独作用。流式细胞分析的结果表明：单独硒组的ＨＬ┐６０细胞在Ｇ２＋Ｍ期和Ｓ期有一定的阻滞；维甲酸的作用主要是阻滞Ｇ１期向Ｓ期移行，使Ｇ１期细胞蓄积，但该剂量单独作用较小；联合组主要表现在Ｇ１期阻滞作用要大于单独ＲＡ组的作用。结论亚硒酸钠和维甲酸联合作用的效果强于单独应用     

B7-1基因转染后对小鼠体内的免疫增强作用

目的 研究转染Ｂ７－１基因后的小鼠宫颈癌Ｕ１４细胞在体内的免疫原性变化。方法 （１）分别用病毒感染法和电穿孔法将ＬＮＳｍＢ７和ｐＣＥＰｍＢ７导入Ｕ１４细胞,用流式细胞仪检测阳性混合克隆细胞Ｕ１４／ＬＮＳｍＢ７和Ｕ１４／ｐＣＥＰＭＢ７的Ｂ７－１分子表达率;（２）取不同数量的Ｕ１４,Ｕ１４／ＬＮＳｍＢ７和Ｕ１４／ｐＣＥＰｍＢ７细胞分别下皮接种昆明种小鼠,４周后观察各组小鼠肿瘤大小和病理结果;（３）取１     

MTT法应用于肝癌化学免疫治疗敏感性研究

目的 探讨MTT法应用于肝癌细胞化疗敏感性检测及化疗与免疫治疗的合理应用。方法 应用MTT法检测肝癌细胞的化疗敏感性和化疗对肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的毒性。结果 肝癌细胞和TIL细胞数增多与生成的甲Xun（formazan)的光密度（OD）值呈线性正相关。TIL在体外对自体肝癌细胞显示高活性的细胞毒作用。肝癌细胞对化疗药物的敏感性存在较大的个体差异。化疗药物对TIL的毒性作用大于对肝癌细胞的杀伤作用。结论 以MTT法作肝癌细胞化疗敏感性检测,既可指导临床选用肿瘤敏感性化疗药物,又可避免盲目选用肿瘤非敏感性化疗药物对机体抗肿瘤免疫的毒性;TIL过继免疫治疗与化疗不宜同时应用。     

人转铁蛋白-阿霉素结合物的制备及其体外细胞毒作用

目的 介绍人转铁蛋白－阿霉素结合物的制备及细胞毒性。方法 采用氧化葡聚糖（ＤＥＸ）Ｔ－４０作为中介体，联结人转铁蛋白（ＨＴＦ）与阿霉素（ＡＤＲ）制备人转铁蛋白－阿霉素交联物９ＨＴＦ－ＤＥＸ－ＡＤＲ）。ＨＴＦ与ＡＤＲ的克分子比为１：４０￣４５。以ＭＴＴ法测其细胞毒性。结果 交联物对肿瘤细胞Ｋ５６２１ｈ处理的ＩＣ５０中游离ＡＤＲ的４．２倍，对正常人单核细胞４８ｈ处理的杀伤只有游离ＡＤＲ的１／９。结论     

三氧化二砷诱导恶性黑色素瘤A375和B16细胞凋亡的研究

目的: 研究不同浓度的三氧化二砷(As-2O-3)对恶性黑色素瘤人A-{375}细胞和小鼠B-{16}细胞的凋亡诱导作用,为As-2O-3治疗恶性黑色素瘤提供新的理论和实验依据.方法:用流式细胞术(FCM)检测A-{375}细胞和B-{16}细胞的凋亡诱导及杀伤作用:用不同剂量的As-2O-3(0.1 mmol*L{-1}、0.25 mmol*L{-1}和0.5 mmol/L{-1}),对小鼠进行腹腔注射(10 ml*kg{-1},连续注射10 d后,检测小鼠血清与心、肝、肾有关的生化指标.结果:As-2O-3浓度分别为5 μmol*L{-1}、10 μmol*L{-1}和20 μmol*L{-1}时,A-{375}和B-{16}细胞的凋亡率分别为11.85 %、55.51 %、54.90 %和9.81 %、26.45 %、9.93 %:As-2O-3诱导A-{375}和B-{16}细胞总的凋亡和坏死率分别为11.90 %、55.71 %、57.40 %和12.96 %、26.99 %、87.13 %;不同剂量的As-2O-3(0.1 mmol*L{-1}～0.5 mmol*L{-1})对小鼠肝、肾和心肌等功能无明显影响,与对照组各项指标无显著性差异(P>0.05).结论:不同浓度的As-2O-3能明显诱导恶性黑色素瘤A-{375}及B-{16}细胞凋亡和坏死,对A-{375}细胞的凋亡诱导作用强于B-{16}细胞.As-2O-3(0.1 mmol*L{-1}～0.5 mmol*L{-1})对小鼠肝、肾和心肌等功能无明显损伤.     

小蘖碱等20个植物药对肿瘤细胞DNA多聚酶及细胞生长的影响

目的　探讨20 个植物药对肿瘤细胞DNA多聚酶的作用及对肿瘤细胞生长的影响。方法　自对数生长期的小鼠艾氏腹水癌细胞中提取核酶液,根据Ono 法,以3H-dTTP掺入活化小牛胸腺DNA的量作为DNA 多聚酶活性指标。用MTT法测定药物对肿瘤细胞生长的影响。结果　巴马汀和小蘖碱抑制小鼠艾氏腹水癌细胞DNA 多聚酶,在100 μg/m l浓度下,巴马汀抑酶率为68.5 % ±6.0 % ,小蘖碱为68.6 % ±15.3 % ,其余18 个植物药均不抑制DNA多聚酶。小蘖碱对体外培养的人早幼粒细胞白血病HL60 细胞和人类淋巴母细胞CCRF-CEM 细胞均有抑制作用,IC50 分别为5.14 μg/m l和34.55 μg/m l。结论　巴马汀和小蘖碱均是肿瘤细胞DNA多聚酶的抑制剂。小蘖碱对体外培养的肿瘤细胞有抑制作用。对DNA 多聚酶的抑制作用可能是其抗瘤机制之一。以DNA多聚酶为靶点筛选抗癌药物可作为现有筛选方法的补充     

12-0-十四酰佛波-13-乙酸酯对培养细胞和小鼠皮肤脂质过氧化的影响

研究了促癌剂12—0—十四酰佛波—13—乙酸酯(TPA)对脂质过氧化的影响。经TPA处理的结肠癌细胞共脂质过氧化明显降低;经TPA处理的小鼠皮肤其脂质过氧初期升高,其后降低。γ—亚麻酸抵消TPA对小鼠皮肤脂质过氧化的影响。实验结果支持吞噬细胞,如中性粒细胞和巨噬细胞,对佛波酯的反应方式是产生超氧化物阴离子和氧自由基,但不表明氧自由基在促癌作用中起重要作用。推测促癌剂TPA引起脂质过氧化减弱的促癌过程。     

丙谷胺抑制人结肠癌细胞株SW480增殖的机制研究

目的 探讨丙谷胺在胃泌素促进人结肠癌细胞株SW480中的作用及其机制。方法 采用噻唑氮蓝（MTT）比色分析法,^3H－肌醇掺入法,Ca^2 荧光测定技术和γ－^32P－ATP掺入法,在体外观察丙谷胺（PGL）对5肽胃泌素（PG）促人结肠癌细胞株SW480增殖的影响。结果 PG＋PGL组的SW480活细胞数（viable cell count,VCC)降低,与对照线相比（P＜0．01）,与PG组相比（P＜0．01）;PG＋PGL细胞胞内三磷酸肌醇（inositol-1,4,5-triphosphate,IP3)、Ca^2 浓度降低,与PG组相比（P＜0．01）,与对照组相比（P＞0．05）;PG＋PGL组膜蛋白激酶C（protein kinase C,PKC)。结论 本研究提示丙谷胺可能通过肌醇质脂信号通路抑制胃泌素促进人结肠癌细胞株SW480的增殖,为结肠癌的抗信息传导治疗提供实验依据。     

环磷酰胺诱导小鼠HAC肝癌细胞凋亡和抑制增殖的体内实验研究

目的 探讨环磷酰胺对荷瘤鼠ＨＡＣ肝癌细胞凋亡和增殖的影响。方法 建立小鼠ＨＡＣ肝癌荷瘤模型,用ＴＵＮＥＬ法和免疫组化法检测环磷酰胺作用下,ＨＡＣ肝癌细胞的凋亡和ＰＣＮＡ表达的变化。结果 １５ｍｇ／ｋｇ环磷酰胺的抑瘤率４３％。ＨＡＣ肝癌细胞的凋亡指数１．９３％,较荷瘤对照组１．１１％明显升高（Ｐ〈０．０５）。增殖指数３５．７５％,较荷瘤对照组５６．３８％明显下降（Ｐ〈０．０１）。结论 环磷酰胺有诱导