应激活化蛋白激酶介导氯化镉致肾上腺皮质细胞凋亡作用探讨

目的 了解氯化镉（CdCl2)对豚鼠肾上腺皮质细胞应激活化蛋白激酶（stress activated protein kinase,SAPK）活性的影响及与凋亡的可能关系。方法 以0．625、1．25和2．50mg/kg CdCl2整体腹腔注射染毒雄性豚鼠,分别于染毒1h和12h处死动物,取肾上腺皮质进行SAPK活性测定（免疫沉淀－蛋白印迹杂交－化学发光法）和电镜观察细胞凋讯。结果 整体染毒1h、SAPK活性随CdCl2染毒剂量的增加呈增加的趋势;染毒12h,各组SAPK活性变化不明显。电观察染毒1h肾上腺皮质细胞未见凋亡征象;但染毒12h可见早期细胞凋亡。结论 SAPK活化在CdCl2诱导肾上腺皮质细胞凋亡过程中可能起重要作用。     

氯化镉诱发肾上腺皮质细胞凋亡与蛋白激酶B活力的关系

目的 了解氯化镉(CdCl2)诱发肾上腺皮质细胞凋亡的发生与蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)活力变化的关系.方法 体外分离培养豚鼠肾上腺皮质细胞,以蛋白因子添加素V和碘化丙啶联合标记,流式细胞仪检测,观察CdCl2诱发细胞凋亡的特征;采用免疫沉淀-化学发光法测定PKB/Akt活力.结果 6.25～100.00 μmol/L剂量CdCl2处理肾上腺皮质细胞2 h,细胞凋亡发生率随剂量增加而增加,25.00 μmol/L及更高剂量组与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);回归分析表明,CdCl2剂量与凋亡发生率呈剂量-效应关系.以50.00 μmol/L CdCl2处理细胞,细胞凋亡发生率随时间的延长而增加,CdCl2作用15 min～4h,平均凋亡率为5.58%-73.08%,其中1、2、4h时间点与对照相比,差异有统计学意义(P＜0.05);CdCl2处理时间与凋亡发生率呈时间-效应关系.6.25～200.00 μmol/L剂量CdCl2处理30 min,显示CdCl2可引起肾上腺皮质细胞PKB/Akt表达降低,在一定剂量范围内呈线性关系.结论 CdCl2诱发肾上腺皮质细胞凋亡的同时引起细胞内PKB/Akt表达水平的降低.     

氯化镉致豚鼠肾上腺皮质细胞凋亡作用

目的 探讨P44/42丝裂素活化蛋白激酶(P44/42MAPK)在CdCl₂诱发豚鼠肾上腺皮质细胞凋亡中的作用机制.方法 原代培养豚鼠肾上腺皮质细胞,以0,12.5,25,50,100和200μmol/L CdCl₂处理细胞2 h,及100μmol/L的CdCl₂处理0,0.5,1,2,3和4 h,以Annexin V碘化丙啶(PI)联合染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率;0,12.5,25,50,100和200μmol/L CdCl₂处理1 h,或者100μmol/L的CdCl₂处理0,15,30,60,90和120 min;采用蛋白印迹(Western Blot)法分析P44/42总蛋白量、磷酸化水平以及c-Fos的表达水平.结果 CdCl₂以时间和剂量依赖的方式诱导细胞凋亡,0,12.5,25,50,100和200μmol/L CdCl₂处理细胞2 h后,凋亡率分别为1.99%,14.79%,35.28%,44.62%,55.91%及73.48 7%;100μmol/L CdCl₂染毒0,0.5,1,2,3和4 h,细胞凋亡率分别为1.04%,14.70%,33.99%,49.36%,61.57%及71.55%.CdCl₂诱发P44、P42磷酸化水平升高及c-fos的高表达,以25,50,100和200μmol/L CdCl₂染毒1 h,P44磷酸化水平分别升高了1.0,1.2,2.1和3.2倍;100和200μmol/L CdCl₂染毒1 h,P42磷酸化水平升高了0.8和1.3倍;12.5,25,50,100和200μmol/L CdCl₂处理细胞1 h,c-Fos的表达水平升高了0.6,1.2,1.4,2.3和1.8倍.100μmol/L CdCl₂作用细胞15,30,60,90和120 min后,P44磷酸化水平分别升高了0.5,3.1,4.9,5.9和5.3倍;P42的磷酸化水平分别升高了0.1,0.5,0.9,1.1和1.1倍,同时c-Fos蛋白水平分别升高了1.6,2.3,2.3,3.1和2.8倍.结论 一定剂量CdCl₂作用肾上腺皮质细胞后,P44/42呈现过度磷酸化,并可能通过诱发c-Fos高表达,导致细胞凋亡.     

镉对肾上腺皮质细胞线粒体功能的影响

目的 研究镉对肾上腺皮质细胞线粒体功能的影响,为探讨其内分泌毒作用机制提供依据。方法 原代分离培养豚鼠肾上腺皮质细胞,用氯化镉（ＣｄＣｌ２）０、６．２５、１２．５０、２５．００、５０．００、１００．００、２００．００ｕｍｏｌ／ｌ处理细胞１ｈ,以５０ｕｍｏｌ／Ｌ ＣｄＣｌ２处理细胞０、１５、３０、６０、１２０、２４０ｍｉｎ,观察ＣｄＣｌ２对肾上腺皮质细胞线粒体功能毒作用的剂量－效应及时间－效应关系。应用四甲基偶氮唑蓝（ＭＴＴ）试验检测线粒体酶活力,用流式细胞仪结合罗丹明１２３（Ｒｈ１２３）和碘化丙啶（ＰＩ）双标记法检测线粒体膜电位（ＭＭＰ）和细胞存活状态。结果 ＣｄＣｌ２引起细胞线粒体酶活力及ＭＭＰ降低：以６．２５～２００．００ｕｍｏｌ／Ｌ ＣｄＣｌ２染毒细胞１ｈ,对照组ＭＴＴ的平均吸光度（Ａ５７０ｎｍ）值为０．     

氧化型低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞应激活化蛋白激酶活性及凋亡的影响

目的 观察氧化型低密度脂蛋白（Ox－LDL）对血管平滑肌细胞凋亡及应激活化蛋白激酶（SAPK）活性的影响。方法 采用3个时间水平（24、48、72h）、4个剂量水平（0、50、100、200μg/ml）的两因素析因设计观察Ox-LDL对兔主动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）凋亡影响的时间、剂量效应关系；Ox－LDL对兔主动脉血管平滑肌细胞SAPK活性影响。结果 Ox-LDL诱导VSMCs凋亡随时间和剂量升高而不断增加，呈现一定的时间、剂量效应关系（P＜0．01）；Ox－LDL可引起各血管平滑肌细胞SAPK活性升高。结论 Ox－LDL诱导血管平滑肌细胞凋亡与其作用浓度、时间相关；SAPK信号通路可能在Ox－LDL诱导的血管平滑肌细胞凋亡过程中起重要的信号转导作用。     

电磁噪声抑制工频磁场诱导的应激活化蛋白激酶磷酸化

目的　研究电磁噪声对 5 0Hz工频磁场诱导细胞内应激活化蛋白激酶 (stress activatedproteinkinase ,SAPK)磷酸化的影响 ,探索电磁噪声对极低频磁场生物效应可能存在的干预作用。方法　中国仓鼠肺成纤维细胞 (CHL)分别经 0 .4mT工频磁场、等强度的电磁噪声、工频磁场与噪声的复合磁场辐照及假辐照处理 3min和 15min后 ,裂解细胞 ,提取细胞蛋白质 ,以Western印迹技术测定并比较细胞内SAPK磷酸化 (活化 )的变化。结果　 0 .4mT的工频磁场可诱导细胞内SAPK的磷酸化。经 3min及 15min辐照后 ,磷酸化SAPK含量分别增至 4 9.3%及 5 7.0 % ,与假辐照组比较 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,而相同强度的电磁噪声不能增强SAPK的磷酸化 ,磷酸化SAPK分别为 37.7%及31.8% ,与假辐照组比较 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。复合磁场辐照 3min后 ,可明显抑制工频磁场对SAPK磷酸化的增强作用 ,磷酸化SAPK含量下降至 2 4 .4 % ,与辐照组相比 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;辐照 15min后也可降低工频磁场对SAPK磷酸化的诱导作用 ,磷酸化SAPK含量下降至 39.0 % ,与工频磁场组和假辐照组相比 ,差异均无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　一定强度的电磁噪声可以抑制工频磁场诱导SAPK磷酸化 ,对工频磁场的生物效应存在干预作用     

p38丝裂原活化蛋白激酶与细胞凋亡关系研究

p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号通路除了参与基因转录调控外,p38 MAPK还参与细胞凋亡、细胞因子生成、细胞骨架重构等生物事件并发挥作用,被认为是细胞信息传递的交汇点和共同通路。本文就p38 MAPK的特征和作用、p38 MAPK信号转导途径与细胞凋亡的关系及相关研究方法进行了综述。     

工频磁场对应激活化蛋白激酶及上游激酶磷酸化和活力的影响

目的　研究 5 0Hz工频磁场对细胞内应激活化蛋白激酶 (stress activatedproteinkinase,SAPK/JNK)信号转导途径的影响 ,探索工频磁场生物效应相关的细胞信息转导机制。方法　细胞分别经 0 .4、0 .8mT的工频磁场进行不同时间辐照后 ,利用Western印迹方法 ,比较辐照后细胞与对照细胞胞浆中SAPK及SAPK激酶 (SAPK/ERKkinase 1,SEK1/MKK4 )磷酸化程度。随后以固相激酶分析法(solid phasekinaseassay) ,对经 2个强度分别辐照 15min后的细胞SAPK活力进行测定。结果　 0 .4及0 .8mT工频磁场辐照处理可呈时相性增强SAPK磷酸化 ,并且均在 15min时达到最大值 ,SAPK磷酸化分别提高 2 0 %和 17% ;同时SAPK激酶活力也相应增强 ,分别是对照的 (2 .9± 0 .4 )和 (2 .1± 0 .9)倍。然而 ,0 .8mT诱导SAPK磷酸化的时程长于 0 .4mT ,而脱磷酸化的时程短于 0 .4mT。SAPK上游激酶SEK1/MKK4的磷酸化不受工频磁场的影响。结论　工频磁场可以激活SAPK ,但其激活并非通过SEK1/MKK4激酶途径 ;其生物学效应可能与SAPK信息转导途径相关     

氯化镉诱导293细胞凋亡的实验研究

目的 采用体外细胞培养方法观察CdCl2在不同时间、剂量作用下，诱导293细胞凋亡关系。方法 实验中选择0，12．50，25．0，50．0μmol／L共4种浓度CdCl2在体外与293细胞共育不同时间后（12h24h，48h），采用台盼蓝拒染法测定细胞存活率，观察293细胞转化，用DNA凝胶电泳及ELISA方法检测细胞凋亡。结果 12．5，25．00，50．00μmol／LCdCl2可诱导细胞亡；不同浓度CdCl2可引起细胞存活率下降，与CdCl2时间、剂量有关。结论 CdCl2在体外可诱导293细胞凋亡，与CdCl2的作用时间、作用浓度有关。     

铝致大鼠皮层神经元凋亡及应激活化蛋白激酶活性的变化

目的：探讨氯化铝（AlCl3）对大鼠皮层神经元凋亡的诱导作用及其与应激活化蛋白激酶，又称c-jun氨基末端激酶（SAPK／JNK）信号转导通路的关系。方法：原代无血清培养至第7天，用不同剂量AlCl3(0、10、100、1000μmol/L）处理大鼠皮层神经元48h，然后用琼脂糖凝胶电泳及AnnexinⅤ联合PI染色法检测细胞凋亡；用免疫印迹法(Western blot)检测SAPK／JNK磷酸化水平的时间变化规律。结果：各染铝组均出现DNA ladder这一典型的凋亡特征，且随剂量增加渐趋明显，各剂量组细胞凋亡率明显升高，与对照组相比差异有显著性（P＜0．05），呈明显的剂量－效应关系。6h时SAPK／JNK磷酸化程度达到最高，以后逐渐降低，呈时间－效应关系（P＜0．05）。结论：铝诱导大鼠皮层神经元凋亡可能与SAPK／JNK信号转导通路有关。     

Fas-independent apoptosis induced by UVC in p53-mutated human epithelial tumor A431 cells through activation of caspase-8 and JNK/SAPK

A431 cells/UVC-induced apoptosis/Caspase 8/Fas/JNK/PAPK. We previously observed that p53-mutated human epithelial tumor A431 cells underwent apoptosis after ultraviolet C (UVC) irradiation through the caspases-8 and -3 pathway. Fas/FasL is known to initiate apoptosis in several cell lines via caspase-8 activation. Then, to determine if Fas/FasL mediates apoptosis in A431. we investigated Fas expression and modulation in UVC-irradiated A431 cells. A431 constitutively expressed Fas, which gradually decreased after UVC-irradiation. Pretreatment with a neutralizing anti-Fas antibody, ZB4, did not abrogate the UVC-induced apoptosis. An agonistic anti-Fas antibody, CH11, very slowly induced apoptosis in A431. suggesting that the constitutively expressed Fas had a low functional potential. Hence, UVC-induced apoptosis in A431 seems to occur independent of the Fas signal. Interestingly, however, a pretreatment with CH11 remarkably potentiated UVC-induced apoptosis. An inhibitor of caspase-8, Ac-IETD-CHO, partially inhibited UVC-induced apoptosis. JNK was phosphorylated immediately after exposure to UVC. prior to apoptotic chromatin condensation. Our data suggest that the activation of caspase-8 occurs independent of Fas upregulation, and that JNK/ SAPK contributes to UVC-induced apoptosis in human epithelial A431 cells.     

镉致大鼠心肌细胞H9c2凋亡作用

目的 研究不同浓度氯化镉(CdCl2)引起大鼠心肌细胞H9c2凋亡作用。方法 采用姬姆萨染色法观察氯化镉对细胞毒作用的形态学改变;采用Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)流式细胞技术(flowcytometric,FCM)检测氯化镉对H9c2细胞凋亡的影响;采用流式细胞术法检测线粒体膜电位(MMP)的变化;采用免疫细胞化学法检测细胞色素C表达。结果 5,10,30,50,80μmol/L的氯化镉分别作用H9c2细胞6,12,24 h可以诱导细胞凋亡;随着镉剂量的加大及作用时间的延长,线粒体膜电位明显下降,与阴性对照比较,差异有统计学意义(P<0.05);随着镉剂量增加,CytC表达增强。结论 镉可以通过线粒体途径诱导H9c2细胞凋亡。     

Induction of apoptosis through the activation of SAPK/JNK followed by the expression of death receptor Fas in X-irradiated cells

A post-irradiation treatment of the human leukemia cell line MOLT-4 with the antioxidant Trolox attenuated caspase-3 dependent apoptosis. The increase in the p53 expression and SAPK/JNK activation after X irradiation was also inhibited by a Trolox treatment, but the expression of BCL-2 and BAX, which would occur downstream from p53, was not changed. Studies on the effects of the intracellular calcium chelator BAPTA-AM on the induction of apoptosis and the activation of SAPK/JNK and caspase-3 proved that the chelation of calcium merely delayed the onset of radiation-induced apoptosis and the activation of SAPK/JNK and caspase-3. When the effects of the protein synthesis inhibitor cycloheximde on the apoptotic signaling pathways, including the activation of caspase family proteins and SAPK/JNK, were investigated, the expression of death receptor Fas through SAPK/JNK activation was found to be required for radiation-induced apoptosis. Finally, the relationship between the amounts of DNA dsb and induction of apoptosis was examined by irradiating BrdU-incorporated cells. An increase in DNA dsb caused by BrdU was found, but the induction of apoptosis was not enhanced. From these data, we could get no positive evidence for DNA as a target of X-rays and p53 as an indispensable factor to induced apoptosis in X-irradiated MOLT-4 cells.     

镉致293细胞凋亡过程中JNK信号传导通路与Bax基因关系研究

目的利用RNAi技术探讨JNK、c-Jun、Bax基因在镉致293细胞凋亡过程中的作用及相互关系。方法细胞转染siRNA-JNK或siRNA-Bax后染镉,用Western blotting法测基因蛋白表达,流式细胞术测细胞凋亡。结果 30μmol/L氯化镉可使293细胞相关基因表达明显增高,细胞凋亡增加。siRNA-JNK可抑制这些效应,而siRNA-Bax只能抑制Bax表达和细胞凋亡,对其他基因无明显影响。结论 JNK信号传导通路可能通过上调Bax基因表达促进细胞凋亡。     

镉致HEK293细胞凋亡中氧化应激作用

目的探讨镉在诱导人胚胎肾细胞（HEK293）凋亡中氧化应激的作用。方法采用流式细胞仪检测细胞凋亡率;采用流式细胞仪和激光共聚焦检测胞浆内的活性氧（ROS）水平,采用分光光度法检测细胞内丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）含量,蛋白印迹法检测Bcl-2蛋白、Caspase-3酶原表达量的变化。结果在一定浓度范围内随着镉浓度的升高,凋亡率升高。在60μmol/L氯化镉诱导细胞6h,凋亡率达到最高;细胞内ROS生成显著增多;MND含量明显增多（P〈0.01）,GSH含量大幅下降（P〈0.01）;Bcl-2表达量较镉处理3h时表达量有所下降;Cas-pase-3酶原蛋白表达下降。结论镉诱导HEK293细胞凋亡的机制与ROS上升及其导致的氧化损伤、Bcl-2蛋白表达下调和Caspase-3的激活有关。