激光共聚焦显微镜观察脑缺血大鼠小胶质细胞的变化

目的观察大鼠局灶性脑缺血后不同时段小胶质细胞的变化,探讨小胶质细胞与脑缺血的关系.方法应用微创开颅法建立大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型,将27只大鼠随机分为2、6、12 h及1、2、3 d和1周共7个缺血组（n=3）,正常对照组和假手术组（n=3）.用lectin（一种小胶质细胞的标记物）荧光标记小胶质细胞,激光共聚焦显微镜观察大鼠局灶性脑缺血后其缺血中央区、缺血半暗区及正常灌注区小胶质细胞的变化.结果正常对照组和假手术组小胶质细胞体积小,呈分支状,在大脑皮质均匀分布.脑缺血后,在缺血中央区可见大量坏死细胞;在缺血周围正常灌注区及对侧脑组织,可见体积小、呈分支状的小胶质细胞,与对照组小胶质细胞形态相似,为静息状态的小胶质细胞;在缺血与正常组织交界区即缺血半暗区可见大量胞体增大,突起变短、变少的灌木样细胞,甚至变为胞体呈圆形,突起消失,呈＂阿米巴样＂的细胞,为激活的小胶质细胞,这些细胞在缺血后2、6、12 h数量很少,1 d后逐渐增多,3 d～1周数量最多,达高峰.结论脑缺血后有小胶质细胞的大量聚集和激活,小胶质细胞的活化、增殖规律可能与迟发性神经元损伤有关.     

脑缺血与小胶质细胞

近几年来人们注意到小胶质细胞作为中枢神经系统(ＣＮＳ)固有的免疫效应细胞参与其免疫反应[1 ] 。经研究发现小胶质细胞在脑缺血后异常活跃 ,缺血性脑损伤所激发的小胶质细胞反应极其复杂 ,已经远远超出了对神经元的营养作用和清除变性坏死组织的范围。现将小胶质细胞在脑缺血病理过程中的形态变化及免疫反应综合如下。1　小胶质细胞的来源和分类早在 2 0世纪西班牙学者ＤｅｌＲｉｏ Ｈｏｒｔｅｇａ在形态学的基础上 ,推测小胶质细胞在胚胎早期来自中胚层的骨髓前驱细胞 ,即单核吞噬细胞系统 ,至今这一观点仍被大多数学者所接受。成年期这…     

小胶质细胞对脑缺血的影响

小胶质细胞是中枢神经系统的重要免疫细胞,在脑缺血后的炎症反应过程中发挥炎性损伤和神经保护双重作用。脑缺血发生后,小胶质细胞出现活化和增生,并被激活为M1型和M2型,不同的小胶质细胞表型对脑缺血的作用不同。M1型极化的小胶质细胞通过释放促炎性介质抑制中枢神经系统恢复,而M2型极化通过释放抗炎细胞因子、转化生长因子、脑源性神经生长因子等促进组织的修复和再生。本文将对脑缺血后小胶质细胞的活化及机制、迁移增生、极化及小胶质细胞对脑缺血的影响作一综述。     

大鼠慢性脑灌注不足脑内小胶质细胞活化和脑的病理改变

目的：探讨慢性脑灌注不足脑内小胶质细胞活化规律与脑病理改变的关系。方法：利用大鼠双侧颈总动脉持久性结扎所致慢性脑灌注不足的动物模型,用OX18抗MHC I类抗原和OX6抗MHC Ⅱ类抗原的免疫组化染色,观察不同脑区小胶质细胞变化规律;用光镜观察脑的病理改变。结果：慢性脑灌注不足可引起脑内小胶质细胞的活化,随着缺血时间的延长,小胶质细胞在皮层和白质的活化有所增加;缺血后脑的病理改变以神经细胞变性、固缩和退变,皮层下白质的神经纤维和髓鞘溃变为主,普遍存在胶质细胞增生,形成胶质小结。经环孢素A治疗后以上变化明显减轻。结论：慢性脑灌注不足所致脑内小胶质细胞的活化与脑内病理改变有关,免疫抑制剂环孢素A对此有一定的治疗作用。     

不同状态下的小胶质细胞对脑缺血发病机制的作用

小胶质细胞作为中枢神经系统中最主要的免疫细胞,在缺血性损伤中涉及的炎症反应以及神经修复过程中起着重要的作用。生理情况下,小胶质细胞分泌营养因子对神经元提供营养支持,并参与神经环路的建立。脑缺血损伤时,小胶质细胞上的Toll样受体能识别并吞噬坏死的神经元,清除凋亡神经元;同时小胶质细胞也会释放出有害的细胞因子,加重神经元的损伤。脑缺血损伤发生时小胶质细胞会活化成两种状态：一种是促炎表型（M1型）：分泌白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1),IL-6和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),加重炎症反应;一种是抗炎表型（M2型）：分泌IL-4,IL-10和TGF-β1,抑制炎症促进组织修复。脑缺血发生后,与小胶质细胞相关的通路例如NF-κB通路、TLRNF-κB通路、NLRP3炎性小体通路、Notch信号通路、p38MAPK信号通路等可能会被激活,因此药物通过不同的作用机制或者通路对小胶质细胞的活化产生影响,可能是一种新的治疗策略。     

大鼠脑缺血损伤后星形胶质细胞活化及川芎嗪的影响

1材料和方法健康雄性SD大鼠24只,体质量260～300g（西安交通大学医学院实验动物中心）．将大鼠随机分为川芎嗪治疗组、缺血对照组、假手术组、对照组,每组动物6只．采用大鼠大脑中动脉阻塞再灌注制作模型．术后2h开始腹腔注射川芎嗪40mg／kg,1次／d．缺血对照组用等量生理盐水注射．动物在最后1次注射后1d处死,40g／L多聚甲醛灌注固定、取脑及后固定．标本石蜡包埋,进行GFAP免疫组化染色,WesternBlot检测GFAP表达．     

大鼠局灶性脑缺血后脑内星形神经胶质细胞反应

要用免疫组织化学技术显示脑内胶质纤维酸性蛋白的变化。以观察大鼠脑皮层局灶性脑缺血后星形神经胶质细胞的反应。结果表明,在假手术大鼠大脑皮层内,ＧＦＡＰ表达阳性细胞主要分布于大脑皮层Ⅰ－Ⅱ层;ＦＣＩ后２４ｈ。     

大鼠视神经切断后视网膜Muller细胞及小胶质细胞变化特点

目的观察视网膜Muller细胞和小胶质细胞在大鼠视神经切断后的变化特点．方法应用大鼠视神经完全横断模型,随机分为术后1d、3d、7d、14d4个损伤组和假手术组（每组n=5）;分别用Muller细胞和小胶质细胞特异性标记物谷氨酰胺合成酶（GS）和OX-42,进行免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶连结（sP）法染色,以显示视网膜Muller细胞和小胶质细胞的变化．结果在视神经切断后,大鼠视网膜Muller细胞GS阳性产物立即增粗、深染,并与周围细胞紧密联系在一起,3d达高峰,14d明显减弱;小胶质细胞OX-42的阳性产物表达在视神经切断后7d明显增强,14d达高峰．结论视神经切断后大鼠视网膜Muller细胞反应性增生,小胶质细胞被激活,但反应高峰晚于Muller细胞,其作用有待进一步研究．     

慢性脑缺血对小鼠脑内星形胶质细胞的影响

目的：研究慢性脑缺血对小鼠脑内星形胶质细胞的影响。方法：C57小鼠,3月龄时行改良双侧颈总动脉结扎术,假手术组对照。甲苯胺蓝染色观察模型有效性。于术后1、2、4、5、6个月胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）免疫组化观察小鼠脑内星形胶质细胞的病理改变。免疫印迹检测脑内GFAP表达量变化。结果：甲苯胺蓝灌注后,模型0 h组大脑冠状切面苍白色,假手术对照组呈深蓝色。慢性脑缺血后,星形胶质细胞增生,表现为细胞数量增多,胞体肿胀肥大,突起增多,变粗,变长。与假手术对照组比较,从模型2个月组开始,GFAP阳性细胞数量持续性增多,染色加深,累计光密度增强,且差异均具有统计学意义（P<0.05）。免疫印迹结果显示,与假手术对照组比较,模型2、4、5、6个月组脑内GFAP表达量增高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：慢性脑缺血后星形胶质细胞出现持续性增生,可能在缺血性脑损伤后脑内的不可逆病理改变中有重要意义。     

牛磺酸对大鼠脑缺血—再灌注时缺血区脑组织小胶质细胞活性的影响

目的观察牛磺酸是否能通过抑制脑缺血—再灌注时小胶质细胞激活,抑制炎性反应,发挥保护脑组织的作用。方法 2016年3月—2017年5月在首都医科大学北京市神经外科研究所进行实验。SD大鼠54只,6只用于制备栓子,余48只大鼠随机分4组各12只,缺血2 h再灌注4 h对照Ⅰ组,缺血2 h再灌注4 h给药Ⅰ组,缺血2 h再灌注22 h对照Ⅱ组,缺血2 h再灌注22 h给药Ⅱ组。应用血栓栓塞法制作大鼠短暂性局灶性脑缺血—再灌注动物模型,应用免疫组织化学方法检测主要组织相容性复合体(MHC)抗原,观察牛磺酸对局灶性脑缺血2 h后再灌注4 h及22 h小胶质细胞活性的影响。结果与对照组Ⅰ比较,给药Ⅰ组缺血侧灰质区、胼胝体区及尾壳核区含MHCⅠ、MHCⅡ抗原阳性小胶质细胞数目明显降低(t_(MHCⅠ)=3.594、5.169、4.269,t_(MHCⅡ)=3.511、3.087、4.743,P<0.01或0.05);与对照Ⅱ组比较,给药Ⅱ组缺血侧灰质区、胼胝体区、尾状壳核区、视神经区含MHCⅠ、MHCⅡ抗原阳性小胶质细胞数亦明显降低(t_(MHCⅠ)=11.691、13.262、6.070、1.914,t_(MHCⅡ)=30.533、38.554、5.913、2.311,P<0.01或0.05);结论牛磺酸可通过抑制脑缺血—再灌注时小胶质细胞激活,发挥对脑组织的全脑保护作用。     

甲状腺激素对慢性脑缺血大鼠认知功能障碍的改善作用

目的 研究慢性脑供血不足所致成年大鼠认知功能障碍的特点以及甲状腺激素对于认知功能的改善作用。方法 成年SD大鼠31只随机分为正常对照组12只;单纯手术组6只(双侧颈总动脉结扎术后5周);急性期给药组7只(双侧颈总动脉结扎术后当日始给予甲状腺激素灌胃,剂量20mg/只、频率1次/d、持续5周);慢性期给药组6只(双侧颈总动脉结扎术后第6周开始给予甲状腺激素灌胃,剂量20mg/只、频率1次/d、持续5周)。造模成功后用Morris水迷宫系统测试大鼠学习记忆能力。结果 定位航行实验单纯手术组之潜伏期较其他各组明显延长(P<0.05);空间探索实验正常组与单纯手术组、急性期给药组和慢性期给药组之间有差异(P<0.05);工作记忆正常组、急性期给药组与单纯手术组和慢性期给药组之间有显著差异(P<0.05),其中以单纯手术组成绩最差。结论 慢性脑供血不足导致成年大鼠空间认知功能全面障碍,其特点是以短期记忆能力受损为主,且不能通过学习形成新的长期记忆,甲状腺激素对于其认知功能障碍有防治作用,脑缺血早期用药效果更好。     

正常与慢性脑缺血大鼠海马比较蛋白质组学研究

目的: 通过研究正常大鼠和慢性脑缺血大鼠海马蛋白质表达的差异,探讨慢性脑缺血后脑损伤的发病机制。方法: 采用双侧颈总动脉结扎的方法建立慢性脑缺血模型,20只大鼠随机分为模型组(n=10)和假手术组(n=10),4周后对各组大鼠海马进行双向凝胶电泳分析,并通过质谱技术鉴定差异蛋白质。结果: 模型组与假手术组相比共有4种蛋白质上调,2种蛋白质下调,经质谱鉴定得到6种蛋白质的具体信息,包括泛素羧基末端水解酶L1;动力蛋白1;雄激素受体辅助活化因子;ATP合酶;rCG50513, isoform CRA_a和expressed sequence AU016693, isoform CRA_b。结论: 建立了分辨率较高且重复性较好的慢性脑缺血双向电泳图谱,并发现了6种可能与脑缺血后神经损伤相关的蛋白质。     

慢性脑缺血对大鼠海马微血管构筑及胆碱乙酰基转移酶蛋白表达的影响

目的：探讨慢性脑缺血致大鼠海马胆碱能神经元损伤的作用,初步阐明其作用机制。方法：选取90只健康成年雄性SD大鼠,随机分为假手术组（30只）和实验组（60只）。实验组大鼠采用结扎双侧颈总动脉的方法,建立慢性脑缺血模型;假手术组大鼠颈部正中切口,分离双侧颈总动脉,不做结扎。分别于术后第7、14和21天随机各取假手术组大鼠10只、实验组大鼠20只处死取材。免疫组织化学SP法观察海马神经元胆碱乙酰基转移酶（ChAT）蛋白表达水平的动态变化,单宁酸-氯化铁媒染法观察大鼠海马微血管构筑的动态变化,采用MiVnt图像分析系统定量分析免疫组织化学阳性结果、大鼠海马水平部的微血管密度（MVD）和微血管面积密度（MVA）。结果：实验组大鼠海马神经元ChAT的表达水平较假手术组大鼠明显降低（P<0.05);且随缺血时间的延长,ChAT的表达水平逐渐降低,实验组14 d时大鼠ChAT的表达水平明显低于实验组7 d时（P<0.05),实验组21 d时明显低于实验组14和7 d（P<0.05）。实验组各时间点大鼠海马的MVA和MVD均较假手术组明显降低（P<0.05）。随着造模时间的延长,MVA逐渐降低,实验组14和21 d时大鼠的MVA明显低于实验组7 d时（P<0.05）;随着造模时间的延长,MVD也逐渐降低,实验组14和21 d时的MVD明显低于实验组7 d（P<0.05）,实验组21 d时明显低于实验组14 d（P<0.05）。结论：慢性脑缺血可致大鼠海马MVA、MVD及ChAT蛋白的表达水平进行性下降,进而导致学习和记忆功能障碍逐渐加重,这可能是血管性痴呆发生的原因之一。     

大鼠局部脑缺血后NADPH-d神经元的变化

目的：观察缺血性脑损害中一氧化氮合酶（ＮＯＳ）神经元的变化规律,探讨一氧化氮（ＮＯ）参与缺血性脑损害的机制。方法：采用组织化学染色方法观察大鼠局灶性脑缺血后尼克酰胺腺啶呤二核酸磷黄递酶（ＮＡＤＰＨ－ｄ）阳性神经元的变化规律。结果：大鼠局灶性脑缺血后ＮＡＤＰＨ－ｄ阳性神经元明显增加,缺血２ｈ后出现形态学改变,且以细胞皱缩、胞浆致密为主要死亡方式。结论：ＮＡＤＰＨ－ｄ阳性元对缺血性损害相对耐受,细胞凋     

丹芪偏瘫胶囊对慢性脑缺血大鼠认知功能的影响

[目的]探讨丹芪偏瘫胶囊对慢性脑缺血大鼠认知功能的影响。[方法]40只大鼠随机分为模型组,假手术组（给予羧甲基纤维素钠溶液）,丹芪偏瘫胶囊给药组（43.2 mg/mL）。制备四动脉结扎大鼠缺血模型,造模后2周开始给药,给药周期为1个月。采用Morris水迷宫及疲劳仪考察各组对前脑缺血模型大鼠平衡及学习记忆能力的影响。[结果]与模型组相比,丹芪偏瘫胶囊给药组大鼠的逃避潜伏期明显减少（P<0.05）,在平台停留显著增高（P<0.01）,穿越平台次数明显增多（P<0.01）,从转棒上掉落下来的次数明显减少（P<0.01）,在转棒上的最长停留时间明显增加（P<0.05）。[结论]丹芪偏瘫胶囊对四动脉结扎所致的慢性脑缺血大鼠的认知功能具有一定的改善作用。     

乌龙丹对慢性脑缺血大鼠学习记忆功能的影响

目的探讨乌龙丹对慢性脑缺血大鼠学习记忆功能的影响。方法实验分为假手术组、慢性脑缺血模型组、乌龙丹高,中,低剂量组、银杏叶片组。采用双侧颈总动脉永久性结扎建立慢性脑缺血模型;术后第2天开始灌胃给药,连续8周。通过Morris水迷宫和避暗实验检测大鼠的空间学习记忆能力和被动回避学习记忆能力;尼氏染色观察大鼠海马组织结构的变化。结果与模型组比较,乌龙丹给药组和银杏叶组大鼠在Morris水迷宫实验中寻台时间明显缩短（P〈0.05,P〈0.01）;在避暗实验中潜伏期明显延长、错误次数减少（P〈0.05,P〈0.01）。尼氏染色：模型组海马CA1区神经细胞数量显著减少,排列紊乱,细胞核固缩,与假手术组和乌龙丹高剂量组比较具有明显差异。结论乌龙丹能改善慢性脑缺血大鼠学习记忆能力,其机制可能与保护大鼠海马组织结构有关。     

骨髓间充质干细胞源性外泌体促进小胶质细胞/巨噬细胞M2极化抑制急性期脑缺血大鼠炎症反应

为探究骨髓间充质干细胞（bone marrow meaenchymal stem cells, BMSCs）源性外泌体（exosomes, Exos）对急性期脑缺血大鼠小胶质细胞/巨噬细胞M1/M2极化的影响,采用超高速离心法分离提取外泌体并鉴定;采用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型;采用Longa评分和角实验评价大鼠神经功能,2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2, 3, 5-triphenyltetrazole chloride, TTC）染色检测大鼠脑梗死体积;采用CD16/32/Iba1、CD206/Iba1免疫荧光双标法检测小胶质细胞/巨噬细胞M1/M2表型;采用RT-qPCR检测大鼠脑缺血周边区CD86、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitricoxide synthase, iNOS）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）、精氨酸酶1（arginase-1, Arg-1）、白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）和转化生长因子β（transforming growth factor beta, TGF-β）的mRNA表达。实验结果表明,BMSC-Exos减少缺血周边区CD16/32⁺/Iba1⁺阳性细胞数量（P < 0.01）,增加CD206⁺/Iba1⁺阳性细胞数量（P < 0.01）,减少iNOS、CD86和TNF-α的mRNA表达,增加Arg-1、TGF-β和IL-10的mRNA表达（P < 0.05或P < 0.01）。本研究提示BMSC-Exos调控急性期脑缺血大鼠小胶质细胞/巨噬细胞M1/M2极化,减轻神经炎症,改善脑缺血损伤。     

丁基苯酞对慢性脑缺血大鼠认知和脑组织形态的改善

目的观察丁基苯酞对慢性脑缺血大鼠认知和脑组织神经元形态异常的改善作用。方法持久性结扎大鼠两侧颈总动脉3个月,制备慢性脑缺血模型。实验分4组,每组8只:假手术组、模型组、丁基苯酞30和120 mg/kg组。造模后第46天开始给药,每天1次,连续45 d后,用水迷宫定位航行和空间探索实验检测大鼠的空间认知能力。同时,取皮层和海马,用HE染色法观察神经元形态。结果水迷宫定位航行实验中,随着训练天数的增加,模型组逃避潜伏期逐渐长于假手术组;与模型组比较,丁基苯酞两个组的潜伏期逐渐缩短。空间探索实验显示,模型组大鼠的目标象限活动时间明显少于假手术组(P<0.01),而与模型组比较,丁基苯酞2个剂量明显延长大鼠的目标象限活动时间(P<0.05)。同时,HE染色显示模型组大鼠脑组织神经元形态明显异常,而该药对神经元形态异常有明显的改善。结论丁基苯酞能够改善慢性脑缺血大鼠的认知缺陷,并改善脑组织神经元的形态异常。     

脑缺血对大鼠皮层、海马铁含量及膜铁转运蛋白1的影响

目的 探讨脑缺血对大鼠皮层、海马铁含量及膜铁转运蛋白1（ferroportin1，FP1）的影响。方法 雄性Wistar大鼠60只，随机分为脑缺血1d、3d、7d、28d和假手术对照组，每组各12只。实验组结扎双侧颈总动脉造成大鼠脑缺血，假手术对照组仅分离出双侧颈总动脉但不结扎。应用石墨炉原子吸收分光光度法检测皮层及海马铁含量，应用DAB增强的Perls＇铁染色法观察细胞内铁分布，用免疫组织化学观察FP1在皮层及海马组织中的表达。结果 与假手术对照组相比，脑缺血第7天组皮层、海马铁含量开始增加（P〈0.05），缺血第28天组显著增加（P〈0.01）;缺血第28天组铁染色明显增强，皮层和海马神经元中有大量铁沉积颗粒。正常皮层及海马组织中FP1表达明显，主要定位于锥体神经细胞。而脑缺血第7天FP1表达开始减少，缺血第28天降到最低水平。结论 脑缺血引起了大鼠皮层及海马铁含量升高，神经元中铁沉积;同时引起了FP1表达减少。提示脑缺血后FP1表达减少可能参与了铁的沉积。