人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

目的 克隆人类DNA聚合酶（pol-β)基因全长cDNA，构建该基因的真核高铲表达载体。方法 抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT－PCR扩增，用pGEM-T载体经T／A克隆，DNA测序确定后，用双酶切将pol-β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体EGFP-Cl，转染大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆，双酶切鉴定重组质粒。结果 经RT－PCR获得1.03kb的产物，经DNA顺序，确定所扩增片段为人类pol-β基因全长cDNA，进而成功筛选出真核表达载体pEGFP-Cl-β。结论 成功构建人pol-β基因全长cDNA真核表达载体，为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础。     

人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

【目的】克隆人类DNA聚合酶 (pol β)基因全长cDNA ,构建该基因的真核高效表达载体。【方法】抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT PCR扩增 ,用pGEM T载体经T/A克隆、DNA测序确定后 ,用双酶切将 pol β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体 pEGFP C1,转染大肠杆菌DH5α ,筛选阳性克隆 ,双酶切鉴定重组质粒。【结果】经RT PCR获得 1 0 3kb的产物 ,经DNA测序 ,确定所扩增片段为人类 pol β基因全长cDNA ,进而成功筛选出真核表达载体 pEGFP C1 β。【结论】成功构建人 pol β基因全长cDNA真核表达载体 ,为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础     

重组野生型DNA聚合酶β表达载体VR1012-polβ的构建

目的:构建含有野生型 DNA聚合酶β基因的重组表达载体VR1012-polβ.方法:提取胎儿食管上皮组织的总RNA,反转录成cDNA,经PCR扩增、酶切后克隆入表达载体VR1012,重组子以小量质粒提取后酶切、PCR、测序鉴定.结果:插入片段与GenBank报道一致,并且插入方向正确.结论:重组野生型DNA聚合酶β表达载体VR1012-polβ的构建成功,为深入研究提供了工具.     

人核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人核心蛋白聚糖（DCN）真核表达载体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。 方法：采用聚合酶链反应（PCR）扩增目的片段,PCR产物及真核表达载体pcDNA3分别双酶切后进行连接,并转化入大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体。 结果：PCR获得与预期大小一致的、约1 000 bp的特异性DNA片段,PCR产物与表达载体经双酶切后连接,构建重组载体pcDNA-dec,经双酶切鉴定及测序证实,人DCN基因cDNA片段正确插入真核表达载体中。结论：成功构建人DCN真核表达载体pcDNA-dec。     

啤酒酵母鲨烯合酶基因的克隆及其基因表达载体的构建

[目的] 克隆啤酒酵母鲨烯合酶基因及构建其基因表达载体,为在微生物体内重建青蒿素合成途径打下基础.[方法]采用聚合酶链反应(PCR)扩增、扩增片段与T-载体连接和克隆片段的序列分析;酶切并回收目的基因,反向插入酵母表达载体pGAPZαA,双酶切鉴定重组子.[结果] 通过PCR扩增获得1 335 bp片段,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定.初步测序结果与GenBank上已登录的酵母鲨烯合酶基因序列基本吻合,相差仅数个碱基对;将此片段反向插入酵母表达载体pGAPZαA,构建了反义酵母表达载体,并通过双酶切加以鉴定.[结论] 成功克隆了啤酒酵母鲨烯合酶基因并进行了测序,同时构建了反义酵母表达载体.     

重组野生型DNA聚合酶β表达载体VRl012—polβ的构建

目的：构建含有野生型DNA聚合酶β基因的重组表达载体VRl012-polβ。方法：提取胎儿食管上皮组织的总RNA,反转录成cDNA,经PCR扩增、酶切后克隆入表达载体VRl012,重组子以小量质粒提取后酶切、PCR、测序鉴定。结果：插人片段与GenBank报道一致,并且插入方向正确。结论：重组野生型DNA聚合酶B表达载体VRl012-polβ的构建成功,为深入研究提供了工具。     

PCR产物靶向克隆法构建原核表达载体pET15b-CAT

目的:将人过氧化氢酶(Catalase,CAT)cDNA的PCR扩增产物定向克隆到pET15b载体上以构建重组质粒pET15b-CAT.方法:扩增目的基因的PCR引物的5′端加上与线性化载体同源的碱基序列,以使PCR的扩增产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列.以pZeoSV2( )-CAT为模板进行靶向克隆所需的人CAT cDNA扩增.将纯化的人CAT cDNA PCR产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b以6:1摩尔数之比混合于含重组酶的反应液中,25℃反应30 min,将PCR产物定向克隆于目标载体pET15b上,获得重组质粒pET15b-CAT.重组质粒经PCR,XhoⅠ酶切和DNA测序鉴定.结果:人CAT cDNA的PCR扩增产物与经Xho Ⅰ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b发生了同源重组反应,经鉴定采用PCR产物靶向克隆法成功构建了pET15b-CAT.结论:PCR产物靶向克隆法是一种简便、高效地将PCR产物定向克隆于目标载体的方法,而无需对PCR产物进行酶切、末端抹平、载体去磷酸化及连接反应,适用于任何载体、任何插入片段和任意酶切位点.     

羊布鲁氏菌omp25基因原核表达载体的构建与鉴定

目的:利用PCR反应从羊布鲁氏菌基因组DNA中克隆omp25基因,并将其构建到原核表达载体pET-32a中。方法:试剂盒法提取羊布鲁氏菌基因组DNA,设计合适的引物,通过PCR反应从基因组中扩增外膜蛋白OMP25的编码基因(omp25)。将得到的基因片段连接到克隆载体pMD19-T的多克隆位点(MCS)中,将连接体pMD19-T-omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析与序列测定。利用酶切与连接反应将目的基因(omp25)插入载体pET-32a的多克隆位点中,将连接体pET-32a-omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析。结果:PCR扩增得到的基因片段与GenBank中已公布的羊布鲁氏菌omp25基因同源性为99%。酶切分析结果表明,omp25基因成功地插入载体pET-32a中。结论:成功地扩增得到了羊布鲁氏菌omp25基因并构建了携带该基因的重组原核表达载体pET-32a-omp25,为后续的研究提供了可靠的基础。     

人IGF-I基因真核表达质粒pIRES2-EGFP-IGF-I的构建

目的利用基因工程原理构建人胰岛素样生长因子I(IGF-I)全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-I.方法应用PCR方法从人肝细胞cDNA文库中提取人IGF-I全长cDNA序列,克隆入T载体pMD18中,经测序证实序列正确后,进行双酶切并定向插入真核表达载体pIRES2-EGFP中,利用双酶切、电泳和PCR证实插入片段的正确性.结果经测序证实,目的基因人IGF-I的全长基因序列被正确扩增;构建的真核表达载体经双酶切和PCR鉴定证实,hIGF-I被定向插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中.结论利用基因工程原理可以正确地构建人IGF-I全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-I.     

人乳头瘤病毒11型E6基因完整开放阅读框架的克隆和鉴定

目的 为构建人乳头瘤病毒11型（HPV11）DNA疫苗,从尖锐湿疣病变组织中克隆疫苗靶基因E6。方法 利用改良提取染色体外游离DNA的方法制备模板DNA,采用聚合酶链反应（PCR）技术进行基因克隆。结果 从病变组织中扩增出了全长人乳头瘤病毒11型E6基因完整开放阅读框架,并插入中介载体T-easy中构建重组质粒,转化JM109扩增后经酶切、PCR及测序分析,证实克隆成功。结论 该实验的成功为下一步制备HPV11的治疗性疫苗奠定基础 。     

pcDNA3.1(+)gpc-5真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建pcDNA3.1（＋）磷脂酞肌醇蛋白5（gpc-5）基因真核表达载体。方法：根据gpc-5基因序列设计一对引物,利用RT-PCR法扩增出gpc-5基因的编码区（CDS）,连接在PGM-T载体上,并进行pcDNA3.1（＋）gpc-5真核表达载体的构建、酶切鉴定以及测序。结果：gpc-5基因的体外扩增目的片段为2 083 bp。所构建的重组体pcDNA3.1（＋）gpc-5经双酶切鉴定,与预期片段大小一致,测序结果与NCB I收录gpc-5基因的CDS序列一致。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）gpc-5,为研究gpc-5基因在原发性肺癌的发生发展中的作用奠定了基础。     

体外拼装凋亡素基因

目的 以凋亡素基因为例,探讨用寡核苷酸片段体外拼装基因的方法。方法 按已知的凋亡素基因序列(GeneBank登录号:AY171617),设计40bp的凋亡素基因寡核苷酸片段,并将其中的172位(BglII,agatct→agatcc)和306位碱基(HindIII,aagctt→aatcct)进行同义突变,Taq消除这两个酶切位点。在pfu酶的PCR系统中,对寡核苷酸片段进行拼装和扩增。产物稀释后进一步纯化扩增,在Tag酶存在的条件下对产物两末端加T,然后TA克隆于pGEM-Teasy载体中。阳性克隆经测序鉴定。结果 凋亡素基因寡核苷酸片段第1次PCR拼装后,产物呈拖尾状。但产物经进一步稀释,并用两未端引物进行2次扩增后,即可见明确的产物带及其他梯形带状产物。目的产物TA克隆后,筛选得到阳性克隆,其经测序鉴定,与设计的凋亡素基因序列完全一致。结论 体外基因拼装法是一种非常有效的基因克隆方法,可用于基因或载体的合成,及一次性对基因进行广泛的突变。     

含人SOD_2基因启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建和鉴定

目的:从人基因组中克隆SOD2基因的启动子并插入到荧光素酶报告基因载体中并进行基因测序鉴定。方法:以人基因组DNA为模板,用PCR的方法扩增出人SOD2基因启动子片段后,将其插入到pGL3-basic载体的荧光素酶报告基因上游,将构建的重组质粒通过双酶切片段的凝胶电泳分析和DNA测序以确定插入位置和序列的正确性。结果:双酶切反应和测序结果显示SOD2基因启动子插入的位置和序列是正确的。结论:成功克隆了SOD2基因启动子,为后续SOD2转录调控机制的研究提供重要的实验基础。     

HBX基因逆转录病毒载体的构建及在LO2细胞内的稳定表达

目的 构建乙型肝炎病毒X基因(HBX)逆转录病毒载体,并使其在人正常肝细胞LO2内的进行稳定表达.方法 PCR扩增HBX基因,克隆到逆转录病毒载体质粒pSEB-Flag中,构建表达HBX的重组逆转录病毒载体质粒pSEB-Flag-HBX,通过通过PCR、酶切、测序验证HBX基因后;体外将重组质粒pSEB-Flag-HBX与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBX基因的重组逆转录病毒,并感染靶细胞人正常肝细胞LO2,稻瘟菌素(Blasticidin)筛选,获得成功转入HBX的LO2细胞.通过RT-PCR和Western blot进一步验证HBX基因及HBx蛋白在LO2细胞内的表达.结果 (1)成功获得携带HBX基因的阳性重组质粒pSEB-Flag-HBX;(2)HBX基因被逆转录病毒成功地导入靶细胞LO2细胞,并实现稳定表达,RT-PCR检测到HBX mRNA在靶细胞中的表达,Western blot检测到HBx蛋白在靶细胞LO2-HBx细胞中的表达.结论 成功构建了携带HBX基因的重组逆转录病毒载体,感染人正常肝细胞LO2后能够稳定表达HBx蛋白,为进一步探讨HBx在肝癌发生发展中的作用提供了较为理想的实验模型.     

结缔组织生长因子的克隆及其真核表达载体的构建

目的结缔组织生长因子(CTGF)在肿瘤发生,胚胎发育、骨折愈合、细胞增殖和分化、血管形成等众多领域都有着重要的作用,对结缔组织生长因子进行克隆及构建其真核表达载体,对其在功能上的进一步研究及应用有积极意义.方法以含有鼠CTGF基因序列的EST克隆为模板,通过PCR的方法克隆出目的基因CTGF,再以分子克隆学的方法将CTGF克隆入真核表达载体pAdTrack-CMV,进一步以PCR、酶切、DNA测序的方法筛选出正确的真核表达质粒.并通过Western-Blotting的方法对质粒的表达功能进行研究.结果 PCR、酶切、DNA测序的方法均证实已经成功克隆获得序列正确的目的基因CTGF,并将CTGF克隆入真核表达载体pAdTrack-CMV.Western-Blotting的结果表明构建的表达CTGF的真核表达载体高表达CTGF蛋白质.结论成功克隆目的基因CTGF并构建其真核表达质粒,证实在蛋白质水平获得了表达.     

辣根过氧化物酶同功酶C3基因在毕赤酵母中的克隆与分析

目的克隆辣根过氧化物酶同功酶C3(HRPC3)基因,为此基因的表达做准备。方法用PCR方法从辣根的基因组DNA中扩增得到一种辣根过氧化物酶同功酶C3基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体上。测序证明正确后,再以带有EcoRI和NotI酶切位点的引物进行PCR,然后将目的基因切下,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组pPIC9K质粒,用电转化转入毕赤酵母。提取转化子的基因组DNA,用PCR进行鉴定是否含有HRPC3基因。结果重组pPIC9K质粒转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HRPC3。     

BLU基因慢病毒表达载体的构建

目的:构建BLU基因慢病毒表达载体。方法:采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出BLU基因,将其接入慢病毒载体(pSL6-IRES-EGFP)中,经菌落PCR、酶切和测序鉴定,然后转染293T细胞观察表达情况。结果:PCR、酶切和测序鉴定克隆了重组子(pSL6-BLU-IRES-EGFP),并在293T细胞中成功表达BLU基因。结论:成功地克隆了含有BLU基因的慢病毒表达载体。     

干血滤纸片试剂盒和水煮法提取间日疟原虫DNA用于PCR检测的比较

目的：比较水煮法和干血滤纸片基因组DNA分离试剂盒提取间日疟原虫DNA用于PCR检测及克隆研究的差异。方法：采集间日疟患者末梢血制备干血滤纸片,分别用水煮法和QIAamp DNAmini kit试剂盒提取间日疟原虫基因组DNA10份。PCR扩增LDH基因,并克隆质粒pGEM-PvLDH。分析比较2种提取方法的差异。结果：水煮法和试剂盒法提取的间日疟原虫gDNA,均扩增出LDH基因特异条带,但试剂盒提取的gDNA目的条带亮于水煮法。结论：水煮法操作简便、快速、经济,在等量血源条件下,所得DNA量较少、纯度较低;试剂盒提取可获得较高的得率,在定量检测和复合扩增时受到的影响因素较少,成功率较高。     

5-LO真核表达载体的构建及其在RAW264.7细胞中的表达的初步研究

目的构建5-LO真核表达载体并初步研究其在RAW264．7细胞中的表达,为建立5-LO高表达转基因小鼠模型提供表达载体。方法从人全血标本中提取细胞总RNA,以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法扩增5-LO基因,分别构建5-LO目的基因的克隆载体与表达载体,提取质粒,进行酶切、PCR和DNA测序鉴定,将重组融合表达载体pEGFP-5-LO稳定转染RAW264．7细胞,RT-PCR、western blot方法检测pEGFP-5-LO的表达情况。结果构建了重组克隆载体pUCm-5-LO和真核表达载体pEGFP-5-LO,经酶切、PCR及测序鉴定正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到pEGFP-5-LO融合蛋白的表达,RT—PCR和Westemblot结果表明转染pEGFP．5-LO的RAW264．7细胞中有5-LO的表达。结论成功克隆了5-LO基因,构建的表达载体pEGFP-5-LO在RAW264．7细胞中表达5-LO蛋白,为进一步5-LO高表达转基因鼠模型的建立和临床应用奠定了基础。