反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒的研究进展

反义寡核苷酸(ASODN)是近十年来迅速发展起来的一种新的生物技术。它为乙型肝炎病毒(HBV)治疗提供了一种新的基因治疗途径。本文就ASODN抗HBV的研究进展：ASODN抗HBV的反义与非反义作用机制研究；ASODN的化学修饰；针对HBV各基因区关键位点的ASODN抗HBV效果评价以及利用联合或串联ASODN和靶向技术抗HBV作用的研究分三部分进行综述。     

反义RNA和反义硫代寡核苷酸抗HBV转基因小鼠病毒疗效的比较

目的　比较人工合成的反义硫代寡核苷酸 (asODN )和反义RNA真核表达质粒 (PCEP4-ac)在乙型肝炎(HBV)病毒转基因小鼠体内的抗病毒作用。　方法　设计合成针对HBV -pre -c/c基因的反义硫代寡核苷酸 5‘ -CAT GCCCCAAAGCCAC -3’。构建HBV -c区反义RNA真核表达质粒 (PCEP4-ac) ,并以半乳糖 -多聚赖氨酸 (Gal15 -PLL)作肝靶向载体。将 2 0只HBV转基因小鼠分为反义寡核苷酸、反义RNA真核质粒表达、生理盐水组。靶向反义硫代寡核苷酸以每只体重 15 0ug剂量 ,反义RNA真核质粒每只 10 0ug剂量 ,尾静脉注射给药 ,对照组用同样体积生理盐水同样方法给药。　结果　注射asODN和PCEP4-aC后 7d血清HBsAg已有所下降 (P <0 .0 5 ) ;14d时显著下降 (P <0 .0 1) ,且血清HBV -DNA转阴率分别为 66.7% ( 4 /6)和 62 .5 % ( 5 /8) ,而生理盐水组无明显变化。　结论　反义硫代寡核苷酸和反义RNA真核表达质粒均能在乙肝转基因小鼠体内抑制HBV复制和表达 ,且两者在抑制作用上无明显差异性。     

反义寡核苷酸抗肝炎病毒的研究

反义寡核苷酸指合成的20个碱基左右的一小段核苷酸,按照Watson-Crick碱基配对原则,与特定的靶序列杂交,从而抑制基因表达。研究表明,反义寡核苷酸具有明显抗肿瘤、抗病毒及抗炎作用,已被作为一类新型药物进行开发研究。本文简要综述了反义寡核苷酸抗HBV及抗HCV的作用。     

C-myc反义寡核苷酸对人胆管癌细胞增殖和侵袭力的影响

目的 探讨C-myc反义寡核苷酸(ASODN)对人胆管癌QBC939细胞增殖和侵袭力的影响.方法 合成C-mycASODN,并将其转染QBC939细胞;四甲基噻唑蓝(MTT)实验检测C-myc ASODN抑制QBC939细胞增殖的影响;Transwell法检测C-myc ASODN抑制QBC939细胞侵袭力的影响.结果 ASODN组细胞的存活率低于空白对照组(P<0.05);ASODN组较空白对照组的细胞穿透数目下降(P<0.01);空载体组细胞的存活率及细胞穿透数目较空白对照组差异无统计学意义(P>0.05).结论 C-myc ASODN能抑制QBC939细胞的增殖和侵袭力.     

反义寡核苷酸作用后肝癌细胞端粒酶活性的变化及差异蛋白的表达

目的利用针对端粒酶RNA的反义寡核苷酸(ASODN)和正义寡核苷酸(NODN)作用于人肝癌细胞SMMC-7721,比较ASODN和NODN作用后癌细胞端粒酶活性及相关蛋白的变化。方法利用实时荧光定量端粒重复序列扩增法(FQ-TRAP法),检测ASODN和NODN作用后肿瘤细胞端粒酶活性变化;蛋白质芯片-飞行时间质谱仪,检测ASODN和NODN作用后特异蛋白质的变化。对照组为未加任何处理因素的SMMC-7721细胞。结果FQ-TRAP法检测CT值,A-SODN组为35.2±2.3,NODN组为26.1±3.5,对照组为18.2±0.7。蛋白质芯片-飞行时间质谱仪检测发现,ASODN组有19个差异蛋白分子高表达,13个差异蛋白分子低表达。NODN组有20个差异蛋白分子高表达,12个差异蛋白分子低表达。所有差异蛋白的分子量分布在3 000 D~10 000 D之间。结论ASODN和NODN均能抑制肝癌细胞端粒酶活性,两者作用SMMC-7721细胞后所表达的差异蛋白十分相似。     

PML-RARα反义核酸增强NB4细胞对硒化壳聚糖诱导分化作用敏感性的探讨

[目的]研究PML-RARα反义核酸(antisense oligodexynucleotide,ASODN)对硒化壳聚糖诱导的NB4细胞分化敏感性的影响. [方法]人工合成PML-RARαASODN经阳离子脂质体包裹后瞬时转染NB4细胞,采用RT-PCR检测转染后PML-RARα基因表达情况,通过镜下观察细胞形态改变,NBT法观察细胞功能变化及流式法检测细胞膜CD11抗原表达来观测细胞分化. [结果]经PML-RARαASODN处理的NB4细胞PML-RARα基因表达明显下调,PML-RARα基因的反义核酸和硒化壳聚槠均能提高细胞NBT还原率,升高CD11b抗原,二者合用,则NBT还原率和CD11b抗原表达进一步增强.[结论]阳离子脂质体转染PML-RARαASODN具有促进硒化壳聚糖诱导NB4细胞分化作用的敏感性.     

SELDI技术检测反义寡核苷酸作用前后肝癌细胞培养液的差异蛋白

目的利用针对人端粒酶RNA(hTR)的反义寡核苷酸(ASODN)和正义寡核苷酸(NODN)作用于人肝癌细胞SMMC-7721,比较ASODN和NODN作用后细胞培养液蛋白的变化。方法利用SELDI技术检测差异蛋白的表达变化。对照组为未加任何处理因素的SMMC-7721细胞。结果SELDI技术检测发现,ASODN作用组有40个差异蛋白分子低表达,3个差异蛋白分子高表达。NODN作用组有37个差异蛋白分子低表达,6个差异蛋白分子高表达。所有差异蛋白分子量均小于10 000 Da。ASODN作用组中有3个低表达蛋白在NODN作用组高表达,分子量分别为3 011.99 Da、3 048.28 Da和3 248.75 Da。结论ASODN和NODN作用SMMC-7721细胞后细胞培养液中所表达的差异蛋白十分相似。     

VEGF-C反义寡核苷酸和姜黄素联合化疗对卵巢癌细胞SKOV3生长、粘附、侵袭能力的抑制作用

目的探讨VEGF-C反义寡核苷酸(VEGF-C ASODN)和姜黄素联合化疗对人卵巢癌细胞SKOV3生长粘附侵袭能力的抑制作用。方法 MTT法检测VEGF-C ASODN和姜黄素联合化疗对卵巢癌细胞的增殖抑制效应;MTT法检测卵巢癌细胞与细胞外基质粘附能力,体外侵袭实验检测卵巢癌细胞侵袭人工基底膜的能力。结果 VEGF-C ASODN和姜黄素联合化疗对卵巢癌细胞有明显的增殖抑制作用,使卵巢癌细胞对细胞外基质粘附率明显降低,穿透重组基质膜数目明显下降。结论 VEGF-C ASODN和姜黄素联合化疗能明显抑制卵巢癌细胞体外实验中的生长粘附侵袭能力,可望为卵巢癌提供一种有效的联合化疗方法。     

乙肝患者血清学标志物与HBV DNA关系研究

随着对乙型肝炎病毒 (HBV)本质认识的深入及分子生物学的进展 ,目前对HBV的检测除了三对抗原抗体系统及DNA多聚酶外 ,聚合酶链反应 (PCR)为检测HBV提供了一种新的方法。从基因水平测得的HBVDNA ,与HBV血清学标志物 (HBV -M)有何关系 ,是值得研究的问题。本文对 10 0 0例各型肝炎患者血清的HBVDNA、HBV -M (HB -sAg、抗 -HBs、HBeAg、抗 -HBe、抗 -HBc、抗 -HBcIgM)进行了对比研究 ,现将结果报告如下 :1　材料和方法1.1　资料　HBVDNA检测采用PCR法 ,试剂由上海科华公司提供。仪器 :DNA扩增仪 ,ThinkerSeriesⅡ…     

RNA干扰技术防治病毒性肝炎的研究

RNA干扰技术作为继反义和核酶之后新的强有力的快速基因阻断技术,迅速在基因功能、抗肿瘤和抗病毒的研究领域中掀起热潮。应用RNA干扰技术进行高效抗HCV和HBV的实验研究,以及体内诱导干扰Fas基因表达对小鼠肝损伤的治疗保护作用,显示了该技术在清除慢性感染状态的肝炎病毒和防治肝炎中具有巨大的应用潜力。     

阳离子脂质体介导双靶区反义锁核酸抗病毒疗效研究

目的 探讨HBV S、C双靶区反义锁核酸(LNA)的抗病毒疗效.方法 设计合成互补于HBV S、C基因翻译起始区的反义LNA与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用时间分辨免疫荧光分析法定量检测小鼠血清HBsAg;荧光PCR定量检测血清HBV DNA含量;RT-PCR检测肝组织HBV C-mRNA的表达;免疫组化法检测肝细胞HBsAg、HBcAg的表达;自动生化分析仪检测血清白蛋白(Alb)、ALT、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)等指标;小鼠肝脏、肾脏进行常规病理切片并HE染色,观察反义LNA对小鼠脏器的影响.结果 血清HBsAg的表达,注射后第1、3、5天,单靶区S组的抑制率分别为23.3%、37.9%和48.7%;单靶区C组分别为21.2%、32.6%和40.7%;双靶区SC组分别为30.6%、61.2%和72.8%.血清HBV DNA,注射后第1天开始下降,双靶区SC组的DNA下降最明显,其第1、3、5天分别下降了18.5%、36.1%和52.9%.5 d后,单靶区S组、单靶区C组和双靶区SC组小鼠肝细胞HBsAg、HBcAg的表达显著低于对照组.小鼠肝肾功能及组织学未见异常.结论 HBV S、C双靶区反义LNA对HBV转基因鼠抗病毒有显著作用,且抑制作用优于单靶区反义LNA.     

RNA干扰技术防治病毒性肝炎的研究

RNA干扰技术作为继反义和核酶之后新的强有力的快速基因阻断技术，迅速在基因功能、抗肿瘤和抗病毒的研究领域中掀起热潮。应用RNA干扰技术进行高效抗HCV和HBV的实验研究，以及体内诱导干扰Fas基因表达对小鼠肝损伤的治疗保护作用，显示了该技术在清除慢性感染状态的肝炎病毒和防治肝炎中具有巨大的应用潜力。     

乙型肝炎病毒转录后调节元件功能及作用机制

乙型肝炎病毒(HBV)转录体上存在与相应的细胞核蛋白结合的特殊序列,参与转录体稳定性和核浆转运等转录后调节过程。更为重要的是,细胞因子介导非细胞损伤抗HBV的主要作用环节也是在转录后水平。因此,对HBV转录后调节机制的研究不仅能加深对HBV生活周期的认识,而且还将为抗HBV治疗提供新的设计思路。     

反义寡核苷酸体外抗乙型肝炎病毒研究

目的 探讨反义寡核苷酸的体外抗病毒作用,为基因水平上防治乙型肝炎病毒（HBV）感染及HBV相关肝细胞癌的基因治疗提供实验依据。方法 用PCR方法分别合成了互补于HBV X基因的翻译起始区、DR2区、ENⅡ区的反义寡核苷酸（AsON)及无关序列,其中针对ENⅡ设计的AsON,目前尚未见互补于该区段反义寡核苷酸的报道。以HBV DNA转染的HepG2．2．15细胞为靶细胞,ELISA法检测AsON作用前后细胞上清中的HBsAg和HBeAg分泌情况。结果 当AsON的最佳作用浓度为10μmol/L时,3种反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg抑制率分别为;57％、60％、52％和56％、45％、56％,AsON对HBV抗原的凶制作用具双峰现象。无关序列无明显抑制作用（＜12％）。利用锥虫蓝染色、四甲基偶氮唑盐比色试验观察到当AsON作用浓度为40μmol/L时,对细胞代谢无毒副作用。结论反义寡核苷酸封闭HBV X基因区的关键区段,可有效抑制HBV抗原的分泌。     

抗白蛋白抗体与HBsAg/抗-HBe的关系

乙型肝炎病毒(HBV)感染肝细胞的确切机理尚未充分了解。一般认为与多聚人血清白蛋白(PHSA)的桥联作用有关,而关于自身抗白蛋白抗体(AAA)与 HBV 复制的关系迄今未见报道。作者研究了 AAA与 HBeAg/抗-HBe 系统的关系,认为 AAA可能具有某种保护作用。共检测了70例各型急慢性 HBV 感染者的109份血清,HBV 检测采用 RIA 法;AAA检测采用沉淀反应法。结果54份 HBeAg 阳性血清中,48.1%测得 AAA;而43份抗-HBe     

HBV感染基因封闭治疗中的两个研究热点

由于目前抗乙型肝炎病毒(HBV)感染的治疗效果并不令人满意,近年来一些学者提出了基因封闭治疗HBV感染的思路并进行了深入的研究。基因封闭涉及多个方面,其中反义技术和抑制性转录后调节序列结合蛋白是其中的两个主要部分,由于两者的高效性、高特异性和较强的可行性,使之成为现阶段基因封闭治疗研究中的两个热点。     

靶向Survivin反义寡核苷酸逆转MCF-7乳腺癌细胞三苯氧胺耐药的研究

目的探讨Survivin基因在乳腺癌细胞获得性三苯氧胺(TAM)耐药性形成中的作用以及靶向Survivin mRNA逆转乳腺癌细胞TAM耐药性的可行性。方法建立TAM耐药细胞株(TAM-R),用靶向Survivin mRNA的反义寡核苷酸(ASODN)联合10~(-5)M TAM分别作用于MCF-7细胞和MCF-7/TAM-R细胞72 h后,采用MTT法、平板克隆形成实验、流式细胞仪、原位杂交法检测细胞活性、克隆形成率、凋亡率及Survivin mRNA表达的变化。结果 MCF-7/TAM-R组的Survivin mRNA表达明显高于MCF-7组;ASODN联合应用TAM能够逆转MCF-7/TAM-R细胞对TAM的耐药性,其细胞活性、克隆形成率以及凋亡抑制程度明显强于TAM组(P0.05);靶向Survivin的反义寡核苷酸能够抑制Survivin mRNA的表达。结论 MCF-7细胞可能通过上调Survivin基因来对抗长期TAM刺激所诱导的细胞凋亡,从而促进TAM耐药性的形成,靶向Survivin mRNA的反义寡核苷酸能够逆转MCF-7细胞对TAM的耐药。     

乙型肝炎血清学标志临床意义的再认识

随着检测技术的发展,对乙型肝炎血清学标志(HBVM)临床意义的认识正在逐渐深入和不断更新。高度敏感和特异的聚合酶链反应(PCR)用于检测血清和其它临床标本中HBVDNA,使对HBVM临床意义有了新的认识。人群中存在HBsAg阴性的HBV携带者,相当数量HBsAg阴性的慢性肝病患者为HBV感染所致;抗-HBs出现后仍可有HBV复制;单项抗-HBc阳性者中确有部分为HBV低水平携带;单用HBeAg和抗-HBe作为HBV复制和传染性指标是不可靠的。     

名词解释

δ抗原(因子)和抗δ抗体意大利学者Rizzetto于1977年首先报道在HBsAg携带者的肝脏和血清中发现一种新的抗原抗体系统。由于当时认为它又是一组HBV的免疫标志,故按希腊字母排行第四称Delta(δ)抗原抗体系统。后来证明δ抗原(因子)并非HBV DNA的产物,也不是HBV的一个组成部分。它是一种有缺陷的RNA病毒。它不能单独寄生于肝细胞,