静电纺丝聚己内酯纳米纤维支架支持小鼠诱导多能干细胞表达心肌细胞标志物

目的利用多能干细胞与仿生材料支架构建人工心肌,探讨仿生材料支架本身对多能干细胞心肌特异性分化的直接作用,为构建组织工程心肌提供理论支持。方法采用静电纺丝聚己内酯纳米纤维仿生支架,接种小鼠i PSCs(mi PSCs)细胞培养分化15 d,免疫荧光染色与Western blot法检测多能干细胞与心肌细胞特异性标志物。结果mi PSCs特异性表达多能干性标志物Oct4和Nanog,而且能够在聚己内酯纳米纤维支架上集落样增殖、分化;培养15 d后,mi PSCs在支架上分化出心肌特异性标志物c Tn T和MLC2a双重免疫荧光染色阳性的细胞;心肌细胞特异性结构蛋白c Tn T、α-MHC和MLC2的表达水平,支架组全面高于对照组。结论聚己内酯纳米纤维仿生支架支持mi PSCs生长与心肌细胞特异性分化。     

体外电刺激对维生素C诱导的多能干细胞向心肌细胞分化的影响

目的 探讨电刺激在体外对诱导性多能干细胞(iPSCs)向心肌细胞分化的作用.方法 复苏小鼠来源的iPSCs,悬滴培养法形成拟胚体,维生素C诱导其分化,诱导过程按是否给予电刺激分为电刺激组与非电刺激组.观察各组细胞生长情况,记录各组拟胚体出现跳动的时间和跳动拟胚体的数量,计算心肌细胞分化率.共聚焦显微镜成像结合免疫荧光细胞化学检测心肌特异性肌钙蛋白T(c-TnT)的表达.RT-PCR检测干细胞多能性标志因子Oct-4、心肌早期特异性转录因子GATA-4和心肌特异性肌球蛋白0重链(α-MHC)的基因表达.结果 电刺激组拟胚体较非电刺激组分化更快,更早出现搏动,心肌细胞分化率更高[(68.89 +5.09)％ vs(52.22±3.85)％,P＜0.05].两组搏动区域细胞均表达c-TnT,电刺激组细胞c-TnT表达更明显.在诱导过程中,Oct-4表达水平随诱导时间延长逐渐减少,电刺激组较非电刺激组递减更快(P＜0.05).两组均检测到心肌特异性标记分子GATA-4和α-MHC的表达.在诱导分化相同时间点,电刺激组GATA-4和α-MHC表达水平高于非电刺激组(P＜0.05).结论 模拟心脏电学微环境的电刺激有助于维生素C诱导的iPSCs在体外向具有心肌细胞表型特征的细胞分化.     

心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化(英文)CSCD

背景:骨形态发生蛋白、Wnt、Notch、FGF及Hedgehog等信号通路是否参与诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化还不清楚。目的:探讨心肌微环境中,不同刺激因素诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞及其分化的机制。方法:利用Transwell培养装置建立心肌微环境,骨髓间充质干细胞在此环境中培养并加入Wnt11、骨形态发生蛋白抑制剂诱导其向心肌细胞分化;应用RT-PCR、Western blot方法检测骨形态发生蛋白、Wnt、Notch、FGF和Hedgehog信号通路关键信号分子的表达。同时检测心肌特异性转录因子(Nkx2.5、GATA4、Mef2c)和成熟心肌细胞特异性基因(cTnI、ANP、α-MHC、β-MHC)的表达。结果与结论:骨髓间充质干细胞经过与大鼠心肌细胞共培养诱导后,Wnt、骨形态发生蛋白、Notch、Hedgehog信号通路关键信号分子的表达较未诱导的阴性对照组明显升高(P<0.01)。在骨髓间充质干细胞与大鼠心肌细胞共培养体系中加入骨形态发生蛋白信号通路的抑制剂Noggin,心肌特异性转录因子或结构蛋白的表达明显降低(P<0.01)。提示心肌细胞构成的微环境可以诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞;Wnt、骨形态发生蛋白、Notch、FGF、Hedgehog信号通路共同参与了诱导分化过程。     

抑瘤素M促进小鼠诱导多能干细胞向心肌分化

目的以小鼠诱导多能干细胞(mi PSCs)为模型探讨抑瘤素M(OSM)在心肌细胞分化中的作用。方法用拟胚体分化法,在分化前中期(0~6 d)加入OSM培养分化15 d,实时荧光定量PCR、Western blot与免疫荧光染色法检测心肌细胞特异性标志物。结果 OSM诱导mi PSCs分化为心肌细胞的最佳浓度为20 pmol/L,此时心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达为对照组的7倍(P0.05);诱导组心肌细胞特异性基因和蛋白全面高于对照组(P0.05);心肌特异性标志物cTnT染色显阳性,且与对照组相比,诱导组cTnT阳性细胞比率明显增高(P0.05)。结论抑瘤素M促进了mi PSCs向心肌细胞的高效分化,为干细胞的心肌分化提供了一种有效的分化策略。     

人胎盘来源的干细胞提取及其向心肌细胞分化的实验研究

目的： 从人胎盘组织中提取干细胞，并诱导其向心肌细胞分化。 方法： 采用组织块培养法和形态学特征从胎盘组织中分离干细胞，悬滴培养法诱导其向心肌细胞分化，并应用RT-PCR技术检测跳动心肌细胞中Anf、β-MHC的表达情况。 结果： 从胎盘组织中分离大量成纤维细胞样干细胞，可体外扩增，并可被诱导分化成心肌细胞，RT-PCR结果显示Anf、β-MHC基因在该“跳动”心肌细胞中表达。 结论： 人胎盘组织是人类干细胞的一个丰富来源。该来源的干细胞具有向心肌细胞分化的能力。     

细胞内钙信号对锌指转录因子及胚心标志基因的调控

目的：探讨心肌细胞内游离钙离子浓度（［Ca2+］i）变化对锌指转录因子及胚心标志基因的影响。 方法: 以原代培养的乳鼠心肌细胞为模型，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及雷尼丁(RY)剌激心肌细胞跨膜钙内流及细胞内钙释放; Fura-2/AM比率荧光成像系统分析细胞内钙信号；免疫印迹(Western blotting)检测心肌细胞钙调神经磷酸酶(CaN)、活化T细胞核因子（NFAT3）、锌指转录因子（GATA4）、α-actin蛋白表达，RT-PCR 检测心肌球蛋白重链（β-MHC）mRNA表达。 结果: AngⅡ及RY均可使心肌细胞内［Ca2+］i增加，与对照组相比差异显著（P<0.01）。AngⅡ、RY刺激1、3 d，心肌细胞CaN、NFAT3、GATA4、α-actin蛋白表达及β-MHC mRNA表达明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)。 结论: 细胞内钙信号的变化可能通过影响CaN及ERK信号通路，增加心肌细胞胚心标志基因的表达,在心肌细胞肥大的病理过程中起重要作用。     

钠离子通道阻断剂抑制骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：研究发现人和动物的多种间充质干细胞均存在河豚毒素敏感性钠离子通道,但钠离子通道是否会影响间充质干细胞向心肌细胞分化尚无共识。 目的：观察钠离子通道特异性阻断剂河豚毒素对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。 方法：利用Percoll’s密度梯度离心法结合差速贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,用主动脉逆行生物酶灌流法分离大鼠成体心肌细胞。将DAPI标记的大鼠骨髓间充质干细胞与成体心肌细胞混合培养,应用0,10,100 μmol/L的河豚毒素进行干预,1周后观察骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化情况。 结果与结论：免疫荧光细胞化学染色显示,大鼠骨髓间充质干细胞和成体心肌细胞混合培养1周后,骨髓间充质干细胞显著表达心肌特异性蛋白结蛋白和肌球蛋白,而10,100 μmol/L的河豚毒素均可完全抑制结蛋白和肌球蛋白在骨髓间充质干细胞中的表达。提示钠离子通道是骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的必要条件。     

丁酸钠诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

背景：组蛋白乙酰化是诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的机制之一。 目的：观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对体外培养的骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响,并分析其诱导分化的机制。 方法：分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行鉴定。取第2代骨髓间充质干细胞,应用1 mmol/L丁酸钠诱导其向心肌样细胞分化。 结果与结论：实验分离培养的骨髓间充质干细胞高表达CD90,CD29;低表达CD45,CD31。加入丁酸钠后细胞增殖能力及组蛋白去乙酰化酶活性明显降低,但未发生明显凋亡现象,表明丁酸钠具有低毒性的特征。real-time PCR检测显示,经丁酸钠诱导后细胞GATA-4,MEF-2c,β-MHC等心肌细胞早期标志基因表达率明显增高(P < 0.05)。Western blot检测发现,经丁酸钠诱导后细胞心肌细胞特异性蛋白连接蛋白43和肌钙蛋白T的表达明显增高。免疫荧光测得的肌钙蛋白T表达结果与Western blot一致。说明丁酸钠能够有效诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,其机制可能与抑制组蛋白去乙酰化酶活性,增强组蛋白的乙酰化有关。     

缬沙坦诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的 探讨缬沙坦诱导人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）向心肌样细胞分化的潜能。方法 hUCMSCs经缬沙坦诱导后培养1～3 周, 应用心肌肌钙蛋白T（cTnT）和GATA结合蛋白4重组蛋白（GATA4）抗体进行免疫细胞化学和免疫荧光染色,鉴定分化后的细胞。通过RT-PCR检测心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因、心肌相关转录因子和心肌细胞发育相关基因的mRNA表达,进行hUCMSCs的心肌分化潜能和缬沙坦诱导能力的分析。结果 人脐带间充质干细胞形态为均一的纤维状细胞,呈漩涡状排列。缬沙坦诱导后明显变小呈短梭形且不规则排列。免疫细胞化学和免疫荧光结果显示,诱导组细胞有心肌特异蛋白cTnI和心肌相关转录因子GATA4蛋白表达,对照组较少。RT-PCR结果显示,人脐带间充质干细胞自发的、持续性表达心肌相关转录因子Tbx5、GATA4和Nkx2.5的mRNA,经缬沙坦诱导1周时其mRNA表达水平略有上升,随后逐渐下降。cTnI的mRNA在诱导第3周时出现,未见心肌发育相关基因心房利钠肽（ANP）和β-心肌肌球蛋白重链（β-MHC）的mRNA表达。 结论 人脐带间充质干细胞具有心肌分化潜能但无法自发分化;缬沙坦具有诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的能力。     

骨形态蛋白2体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

目的 应用骨形态蛋白2(BMP-2)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化,探索MSCs向心肌细胞分化的诱导方法.方法 取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养MSCs,应用BMP-2定向诱导,相差显微镜观察细胞形态学变化,应用免疫细胞化学、激光扫描共焦显微镜技术检测结蛋白(desmin)、α-横纹肌肌动蛋白(α-sareomeric actin)、心肌特异性肌钙蛋白(C-TnT)的表达,透射电镜鉴定.在诱导后7d、21d和28d 3个时间点以半定量RT-PCR方法检测细胞心肌早期转录因子(GATA4)和心肌特异性α-肌凝蛋白重链(α-MHC)的表达.结果 BMP-2诱导后的MSCs细胞伸出伪足,排列方向渐趋一致.MSCs体外经BMP-2诱导后分化的细胞结蛋白、α-横纹肌肌动蛋白、C-TnT均表达阳性,结蛋白、α-横级肌肌动蛋白阳性率较高,分别为37.28%和63.94%,而C-TnT阳性率较低为34.66%.透射电镜下可见到平行排列的肌丝,大量的粗面内质网和线粒体,富含糖原和核糖体.RT-PCR结果显示,GATA4于诱导后7d弱表达,21d表达增强,28d表达减弱.α-MHC在诱导后7d不表达,21d弱表达,28d表达明显.结论骨髓间充质干细胞在BMP-2诱导下可定向分化为心肌样细胞,是自体心肌细胞的一种良好供体来源.     

人包皮成纤维细胞来源的多能性干细胞的建立

目的 探讨人包皮成纤维细胞重编程为诱导多能性干细胞(iPSCs)的方法.方法 利用反转录病毒携带绿色荧光蛋白(GFP)作为指示,转导到人包皮成纤维细胞中,确定最佳的病毒感染剂量,应用经典的Yamanaka方法,联合小分子物质组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸盐( VPA)诱导人包皮成纤维细胞为多能性干细胞.通过碱性磷酸酶(AKP)染色及免疫荧光细胞化学方法,检测人胚胎干细胞多能性标记物在所建立的诱导多能性干细胞(iPSCs)中的表达,RT-PCR检测拟胚体(EB)三胚层特异基因的表达.结果 以GFP作为指示,建立了高效的反转录病毒感染体系,将人包皮成纤维细胞重编程为iPSCs;所建立的iPSCsAKP染色阳性,表达人胚胎干细胞多能性标记物OCT4、TRA-1-60和TRA-1-81,体外诱导分化后具有三胚层特异基因的表达;小分子物质VPA的添加并未显著提高重编程效率.结论 在GFP所指示的最佳病毒感染剂量下,联合小分子物质VPA成功建立了人包皮成纤维细胞来源的iPSCs.     

Polyethylene glycol-mediated fusion between primary mouse mesenchymal stem cells and mouse fibroblasts generates hybrid cells with increased proliferation and altered differentiation

Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) can differentiate into different cell lineages with the appropriate stimulation in vitro. Transplantation of MSCs in human and other animal models was found to repair tissues through the fusion of transplanted MSCs with indigenous cells. We have generated mouseamouse hybrid cell lines in vitro by polyethylene glycol-mediated fusion of primary mouse MSCs with mouse fibroblasts to investigate the characteristics of hybrid cells, including their potentials for proliferation and differentiation. Similar to the parental MSCs, hybrid cells are positive for the cell-surface markers CD29, CD44, CD49e, and Sca-1, and negative for Gr-1, CD11b, CD13, CD18, CD31, CD43, CD45, CD49d, CD90.2, CD445R/B220, and CD117 markers. The hybrid cells also produce a high level of tissue nonspecific alkaline phosphatase compared to the parental cells. Conditioned medium of hybrid cells contain biologically active factors that are capable of stimulating proliferation of other cells. Although the parental MSCs can differentiate into adipogenic and osteogenic lineages, hybrid cells held disparate differentiation capacity. Hybrid cell lines in general have increased proliferative capacity than the primary MSCs. Our study demonstrates that proliferative hybrid cell lines can be generated in vitro by induced fusion of both immortal and primary somatic cells with primary MSCs.     

人胚胎干细胞体外培养并分化为心肌细胞

目的 :体外培养并鉴定人胚胎干细胞 (EG细胞 ) ,在不添加细胞因子的条件下 ,观察细胞集落分化情况。方法 :取 4～ 6周人胚胎生殖嵴、肠背系膜和中肾嵴 ,进行组织块培养 ,利用组织化学和免疫组织化学技术对培养的细胞进行鉴定。结果 :培养 7～ 8小时 ,在组织块周围出现成纤维细胞 ;5～ 7天后 ,在成纤维细胞上出现EG细胞集落 ,集落内细胞表达阶段特异性胚胎表面抗原SSEA 1和SSEA 3,并表达碱性磷酸酶 (ALP)活性 ;培养 1 8天后 ,有6个集落分化为有节律跳动的心肌细胞 ,这些细胞集落在继续培养 1 5天后 ,仍能有节律收缩。此时集落内细胞ALP表达呈阴性 ,但仍有少量细胞表达SSEA 1和SSEA 3。结论 :体外培养人胚生殖嵴、肠背系膜和中肾嵴组织块 ,以内源性的成纤维细胞作为饲养层 ,可以分离得到EG细胞集落 ,一些EG细胞集落可以自发地分化成心肌细胞。     

Reprogramming induced pluripotent stem cells in the absence of c-Myc for differentiation into hepatocyte-like cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) with four reprogramming factors (Oct-4/Sox2/Klf-4/c-Myc) have been shown to differentiate into hepatic lineages. However, it was unclear whether obviation of the c-Myc oncogene in iPSCs affected hepatic differentiation or inhibited in?vivo tumor formation. In this study, we demonstrated that iPSCs without c-Myc had the capacity to differentiate into hepatocyte-like cells (iPSC-Heps) with biological functions. As detected using planar-radionuclide imaging and Hoechst labeling assays, these iPSCs and iPSC-Heps tended to mobilize to the injured liver area in thioacetamide (TAA)-treated mice. Intravenous transplantation of both iPSCs and iPSC-Heps but not mouse embryonic fibroblasts (MEFs) reduced the hepatic necrotic area, improved liver functions, and rescued TAA-treated mice from lethal acute hepatic failure (AHF). In addition, microarray-based bioinformatics and quantitative RT-PCR showed high expression of antioxidant genes in iPSCs and iPSC-Heps compared to MEFs. In vivo and in?vitro studies of NAC pretreatment confirmed that iPSCs and iPSC-Heps potentially suppressed ROS production and activated antioxidant enzymes in TAA-injured livers. Six months after transplantation in TAA-treated mice, tumor formation was not seen in non-c-Myc iPSC grafts. Therefore, reprogramming adult somatic cells without c-Myc may prevent oxidative stress-induced damage and provide a safer alternative for hepatic regeneration in AHF.     

促红细胞生成素对小鼠诱导多能干细胞源性神经干细胞向功能性神经元样细胞分化的影响

目的:探讨促红细胞生成素体外对小鼠诱导多能干细胞(iPSCs)来源的神经干细胞神经分化的影响。方法:神经干细胞培养基培养诱导iPSCs分化为神经干细胞,设4个浓度加入含促红细胞生成素的培养基,免疫细胞化学荧光鉴定神经元标志物微管相关蛋白2(MAP-2)、神经干细胞标志物巢蛋白的表达。FM 1-43染色技术观察FM 1-43染色颗粒消失的情况。结果:iPSCs在条件培养液的诱导下形成神经干细胞克隆,15 U/ml促红细胞生成素处理后神经干细胞克隆球向神经元方向分化,呈MAP-2阳性细胞。新分化的神经元有大量FM 1-43绿色阳性颗粒。结论:iPSCs体外诱导可获得神经干细胞,促红细胞生成素浓度为15 U/ml时可促进iPSCs源性神经干细胞向功能性的神经元方向分化。     

成人脂肪间充质干细胞的定向成骨诱导

背景：脂肪分离可获得大量的间充质干细胞并成功向骨、软骨、脂肪、心肌等多个方向诱导分化。 目的：建立成人脂肪间充质干细胞体外分离培养、成骨分化方法,并探讨脂肪间充质干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景。 方法：通过胶原酶消化法从成人脂肪中分离间充质干细胞,进行体外培养,流式细胞仪检测细胞表面标记物,CCK8检测细胞活性,成骨诱导液诱导干细胞向骨细胞分化,BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶,茜素红染色检测钙结节形成,RT-PCR检测碱性磷酸酶,骨桥蛋白表达变化。 结果与结论：利用脂肪抽吸液成功培养出脂肪间充质干细胞,且能稳定传代,增殖能力旺盛;流式细胞仪检测证实有特定的间充质干细胞表面标记物表达;成骨诱导脂肪间充质干细胞后呈典型的成骨细胞形态;碱性磷酸酶染色阳性,茜素红染色后可见钙结节形成,成骨诱导培养0,3,7,14,21,28 d,RT-PCR定量检测结果证实碱性磷酸酶、骨桥蛋白阳性表达。说明用酶消化法可以从人脂肪中分离得到脂肪间充质干细胞;脂肪间充质干细胞可向骨细胞诱导分化,阳性表达骨桥蛋白,碱性磷酸酶,是一种优良的骨组织工程的种子细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

成人骨髓间充质干细胞体外培养、鉴定与成骨诱导

背景：骨髓间充质干细胞具有自我增殖和多向分化潜能,然而间充质干细胞在骨髓中含量极少,体外纯化、扩增与成骨诱导是进行骨组织工程研究的关键。 目的：拟建立一套简便可靠的成人骨髓间充质干细胞体外培养及鉴定体系,并定向诱导其向成骨细胞分化。 方法：抽取髂前上棘处骨髓,采用密度梯度离心法与贴壁筛选法相结合,对骨髓间充质干细胞分离、纯化、培养并扩增。将地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素Ｃ配制成骨诱导液,将细胞分为成骨诱导组和空白对照组进行观察。 结果与结论：成人骨髓间充质干细胞呈典型的长梭形、纺锤状。8-11 d细胞进入快速增殖期,生长曲线呈S型,CD44、CD90均呈阳性表达,而CD34、CD45呈阴性表达。碱性磷酸酶活性随培养时间而增高,并在第12天达到高峰,成骨诱导组各时间点碱性磷酸酶活性均高于空白对照组。说明实验建立的成人骨髓间充质干细胞体外培养、鉴定及诱导成骨细胞分化体系可以获得纯度较高、成骨分化能力较好的间充质干细胞。     

Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells

We previously reported a technique for generating retinal pigment epithelia (RPE) and putative photoreceptors from embryonic stem (ES) cells. Here we tested whether our procedure can promote retinal differentiation of mouse and human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Treating iPSCs with Wnt and Nodal antagonists in suspension culture induced expression of markers of retinal progenitor cells and generated RPE cells. Subsequently, treatment with retinoic acid and taurine generated cells positive for photoreceptor markers in all but one human cell lines. We propose that iPSCs can be induced to differentiate into retinal cells which have a possibility to be used as patient-specific donor cells for transplantation therapies.     

In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins

Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a potential source of hepatocytes for liver transplantation to treat end-stage liver disease. In vitro differentiation of human iPSCs into hepatic cells has been achieved using a multistage differentiation protocol, but whether these cells are functional and capable of engrafting and regenerating diseased liver tissue is not clear. We show that human iPSC-derived hepatic cells at various differentiation stages can engraft the liver in a mouse transplantation model. Using the same differentiation and transplantation protocols, we also assessed the ability of human iPSCs derived from each of the three developmental germ layer tissues (that is, ectoderm, mesoderm, and endoderm) to regenerate mouse liver. These iPSC lines, with similar but distinct global DNA methylation patterns, differentiated into multistage hepatic cells with an efficiency similar to that of human embryonic stem cells. Human hepatic cells at various differentiation stages derived from iPSC lines of different origins successfully repopulated the liver tissue of mice with liver cirrhosis. They also secreted human-specific liver proteins into mouse blood at concentrations comparable to that of proteins secreted by human primary hepatocytes. Our results demonstrate the engraftment and liver regenerative capabilities of human iPSC-derived multistage hepatic cells in vivo and suggest that human iPSCs of distinct origins and regardless of their parental epigenetic memory can efficiently differentiate along the hepatic lineage.