内皮素对人视网膜色素上皮细胞黏附的影响

目的 探讨内皮素-1(endothelin-1,ET-1)对人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)黏附作用的影响.方法 用RPE黏附实验和放射免疫测定法检测不同浓度ET-1对RPE黏附的影响和6-Keto-PGFal的浓度变化.结果 10-11～10-mol·L-1～ET-1对RPE细胞黏附力呈剂量依赖性增加,而RPE细胞黏附力随着ET-1浓度的进一步增加(10-9～10～mol·L-1)呈剂量依赖性下降(F=6.352,P＜0.01);黏附实验上清液中6-Keto-PGFα1含量随着ET-1浓度增加呈浓度依赖性增加(F=33.929,P＜0.01).结论 ET-1对RPE有促进黏附作用,ET-1刺激后6-Keto-PGFα1含量上升,与RPE细胞对ET-1作出的反应有关,并抑制ET-1作用.     

磁珠包裹的人视网膜色素上皮细胞受磁场牵拉后ET-1的表达

目的:探讨在体外RPE细胞受牵拉后内皮素(endothe-lin-1,ET-1)的表达。方法:用磁珠与RPE细胞粘和后,受磁场受力牵拉细胞的原理,用原位杂交、免疫组化和放射免疫测定法,检测牵拉对ET-1表达的影响。结果:在磁场中受力牵拉后,随着RPE受牵拉时间的延长,RPE形态发生改变,RPE细胞在各作用时间段后的24hET-1表达明显,在细胞上清液中,ET-1含量也明显上升,作用10,30min和2h培养24h和48h的细胞调理液的ET-1含量与对照组均有统计学显著性差异(P<0.05)。结论:RPE细胞受牵拉后,ET-1表达和分泌增强,提示视网膜脱离发生过程中,会刺激表达ET-1增强。     

机械牵拉对培养人视网膜色素上皮细胞内钙离子的影响

目的：观察培养人视网膜色素上皮细胞(retinal pigmerlt epithelial cells，RPEs)在受机械牵拉力时细胞内Ca^2 的变化。方法：将胶原包被的磁珠悬液加入培养人RPE细胞后孵育，附着磁珠的细胞放置在恒定磁场中，使用钙荧光指示剂fluo-3／AM和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察在机械牵拉作用的前后细胞内钙离子的变化情况。结果：RPE细胞荧光着色很强，遍布整个细胞，其中细胞核比细胞质更强。机械牵拉后荧光强度显著增强，加入氯化锰后迅速降低。EGTA预处理的细胞在受力后荧光强度增加不显著，加入氯化钙后明显增强。细胞松弛素D预处理的细胞在受力后荧光强度比正常组增高2倍以上。结论：机械牵拉能显著增加钙离子内流，并且增加细胞内的钙库释放。钙离子内流可能是RPE细胞损伤前的信号。     

猪视网膜色素上皮细胞中游离钙的观察

目的　观察体外培养的正常猪视网膜色素上皮 (RPE)细胞中游离钙。方法　培养猪RPE细胞后 ,用激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM)观察细胞中游离钙的分布特点 ,并通过校正求得游离钙的绝对值。结果　猪RPE细胞中游离钙的分布特点是细胞核较细胞浆中浓度高 ,通过校正求得细胞中游离钙平均值为 ( 2 2 0 .3 7± 2 7.3 5 )nmol/L。结论　用LSCM能直接观察培养的RPE细胞内游离钙的分布 ,并可求得胞内游离钙的平均绝对值     

地塞米松1 mg玻璃体注射对ET-1在实验性视网膜脱离表达的影响

目的观察1mg地塞米松(dexamethasone,DEX)玻璃体注射对ET1在实验性视网膜脱离中表达的影响。方法32只白色兔32眼,分为单纯模型组和模型加药组,每组分为4个时段,单纯模型组用50μm玻璃微管在下方6:00赤道部部位视网膜造孔并注射0.5mL生理盐水于视网膜下间隙。模型加药组在模型建立后,再注射1mgDEX于玻璃体中。术后0.5h、1h、3h、6h摘除眼球作组织学观察,以鼠抗MAPK抗体检测视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞表达变化,并以免疫组织化学和原位杂交的方法检测ET1的表达并抽出玻璃体,用放射免疫测定法检测ET1浓度。结果实验各组兔眼术后均发生视网膜脱离,视网膜脱离范围3:00～9:00。单纯模型组的视网膜在造模后0.5h,即有ERK表达,并进入RPE细胞核,而模型加药组则4个时间段未见ERK磷酸化进入RPE细胞核。经放射免疫测定,在单纯模型组,ET1从模型建立后3h开始检测出ET1浓度,并有逐渐上升趋势,而模型加药组,4个时间段均未测得ET1浓度;而免疫组化染色,2组4个时间段在视网膜均未检测出ET1表达;原位杂交也证实,在造模后3h,单纯模型组ET1mRNA主要表达在细胞核,6h在胞浆只有较弱的着色,而模型加药组4个时间段,在RPE层均未检测出ET1mRNA。结论1mgDEX玻璃体注射不但影响外源性ET1进入视网膜下,而且抑制RPE内源性ET1的表达。     

HSV-1感染对人视网膜色素上皮细胞生长的影响

目的:建立单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus,HSV-1)感染人视网膜色素上皮细胞(Retinal pigmentepith elial,RPE)的体外模型,观察HSV-1感染对体外培养RPE细胞生长的影响。方法:以感染复数(MOI)为5的HSV-1(F株)感染体外培养的RPE细胞。用相差显微镜观察RPE细胞的形态变化;用MTT法、流式细胞术观察HSV-1感染对RPE细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响;用PCR和免疫荧光法验证HSV-1感染RPE细胞是否成功。结果:成功在体外建立了HSV-1感染RPE的细胞模型。HSV-1感染RPE细胞8h后出现病变,细胞形态开始变得细长和皱缩;感染24h后细胞病变更加明显,细胞间间隙增加,甚至可见多核巨细胞;感染48h后所有细胞均变圆,细胞开始出现脱落甚至死亡。MTT法显示HSV-1感染RPE后24h和48h能抑制细胞生长(P<0.01),细胞的抑制率分别为(16.37±3.28)%和(47.91±6.39)%;流式细胞仪检测发现HSV-1感染可影响RPE细胞的细胞周期,但对细胞凋亡无明显影响。结论:HSV-1能感染体外培养的RPE细胞,抑制RPE细胞的增殖,并影响RPE细胞的细胞周期。眼科学报2007;23:212-218.     

电场对人视网膜色素上皮细胞增生的影响

目的观察一定条件下电场对人视网膜色素上皮(human retinal pigment epitheli-um,hRPE)细胞增生的影响及相关机制。方法hRPE细胞置于电场强度为6V.cm-1的电场中连续作用12h。观察未受电场作用的正常对照组及电场作用12h的实验组细胞,显微摄像系统记录不同时间点细胞图像并计数细胞数,检测细胞密度和细胞的生长速度,观测指标包括:细胞密度,以每平方厘米细胞数表示;细胞生长速度,计算公式为:(Ni-N0)/N0×100%(Ni为12h细胞数;N0为0h细胞数);采用流式细胞仪测定细胞周期,计算细胞增生指数:(NS+NG2/M)/N(NS为S期细胞数;NG2/M为G2/M期细胞数;N为细胞总数);Western blotting检测细胞cyclinE蛋白的表达。结果对照组hRPE细胞在12h的观察期间内细胞密度缓慢上升,到12h时细胞密度由95×103cm-2增至130×103cm-2;而实验组在6V.cm-1电场作用下hRPE细胞数量逐渐上升,12h后细胞密度上升至150×103cm-2。实验组hRPE细胞生长速度为50.02%,较对照组(36.84%)明显升高(P<0.05);...     

人视网膜色素上皮细胞NF-kB的表达

目的探讨核因子闎(NF-кB)在体外培养的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞中的基础表达以及吡咯二硫代氨基甲酸乙酯(pyrollidi ne dithiocarbamate,PDTC)、IL-1β对NF-кB表达的影响. 方法体外培养的hRPE细胞经同步化后分2组分别加药(1)无PDTC组分别加入IL-1β、生理盐水(用于检测NF-кB在hRRE中的基础表达);(2)PDTC组分别加入IL-1β、生理盐水(用于检测NF-кB在PDTC预处理后hRPE中的表达).免疫荧光抗体染色、流式细胞计数法(flow cytometry, FCM)测定上述2组标本中hRPE的NF-кB的表达率. 结果 NF-кB在hRPE中的基础表达率为8.05 %,IL-1β作用后表达率升高到30.26%; hRPE细胞经PDTC预处理后,NF-кB的表达率下降为3.74%,加入IL-1(10 υg·L-1)作用后表达率为3.66%. 结论 IL-1β可以显著提高NF-кB在hRPE细胞中的表达;PDTC可以显著降低体外培养的hRPE中的NF-кB表达率,PDTC亦可显著抑制由IL-1β诱导的NF-кB的活化过程.     

肝细胞生长因子对人视网膜色素上皮细胞表型的影响

目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞形态及细胞表面抗原的影响.方法 体外培养人RPE细胞,分别采用0.4%小牛血清和重组人HGF因子刺激人RPE细胞,应用相差显微镜观察细胞形态变化;免疫组织化学方法 检测细胞表面抗原细胞角蛋白、波形蛋白、成纤维细胞特异性蛋白-1(Fsp-1)的表达变化;采集经HGF(20 ng/mL)刺激后0、12、24、48 h的RPE细胞应用RT-PCR方法 观察Fsp-1mRNA的表达变化.结果 体外培养的人RPE细胞,在含0.4%小牛血清培养液中呈多角形,贴壁生长融合后呈铺路石样;细胞角蛋白的表达阳性率为89.7%,波形蛋白阳性率为100%,Fsp-1阳性率为45.3%.HGF(20 ng/mL)刺激24 h后,细胞呈长梭形,具有成纤维细胞形态特征;细胞角蛋白阳性率为50.1%(χ2=38.1,P＜0.01),Fsp-1阳性率为91.2%(χ2=48.62,P＜0.01),而波形蛋白表达无明显变化.HGF作用后,Fsp-1mRNA表达升高(F=13.761,P=0.002). 结论 HGF促进人RPE细胞向成纤维细胞的表型转化,提示HGF在RPE细胞上皮-间质转化过程中起重要作用.     

金雀异黄素对培养人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的观察金雀异黄素对培养人视网膜色素上皮(hRPE)细胞增生的影响.方法通过MTT比色法和核仁嗜银蛋白染色分析,观察金雀异黄素对hRPE增生的影响.结果不同浓度的金雀异黄素可以抑制hRPE增生,在25～100mg·L-1的范围内呈剂量效应关系,抑制率为12.0%～64.6%(P＜0.05);并随时间的延长,抑制效应增强.嗜银蛋白染色结果50mg·L-1金雀异黄素作用12h即有胞核内AgNORs的减少,平均数为2.7(P=0.034),25mg·L-1金雀异黄素作用24h后,其胞核内AgNORs的数量平均为3.9(P=0.023).并随剂量的增加和时间的延长,胞核内AgNORs的数量减少.结论不同浓度的金雀异黄素作用于培养hRPE细胞,抑制hRPE细胞的增生,有剂量和时间效应关系,随剂量增加和时间延长,抑制作用越明显.提示金雀异黄素可以为增生性玻璃体视网膜病变的机理和防治研究提供新的思路.     

金雀异黄素对高糖诱导的人RPE细胞损伤的保护作用

目的 探讨金雀异黄素(genistein,Gen)对高糖诱导的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的保护作用.方法 培养人RPE细胞,分别以Gen 0 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1的药物浓度作用高糖(33 mmol·L-1)培养的RPE细胞48 h,噻唑蓝比色法检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期;激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;黄嘌呤氧化酶法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性.结果 高糖组细胞活力(0.308±0.022)明显低于正常对照组(0.424±0.014)(P＜0.01);高糖 Gen组细胞活力较高糖组升高(P＜0.05),且随Gen浓度增大,细胞活力增加更明显.与正常对照组比较,高糖组细胞增殖受到抑制,被阻滞于S期和G2期;与高糖组比较,Gen可减轻高糖对细胞增殖的抑制作用.与正常对照组比较,高糖组细胞内ROS的产生明显增多;Gen以浓度依赖方式抑制高糖组RPE细胞内ROS的产生.与正常对照组(31.04±0.02)比较,高糖组SOD活性(12.32±0.02)显著降低(P＜0.01);与高糖组比较,高糖 Gen组SOD活性随Gen浓度的增加而升高(均P＜0.05).结论 Gen可保护和修复高糖诱导的人RPE细胞的损伤,其作用可能与抗氧化、增强SOD活性有关.     

Endothelin-1 distribution and basolateral secretion in the retinal pigment epithelium

Endothelins are a family of conserved vasoactive peptides that are widely expressed in different biological systems including the eye. In the cell culture model of retinal pigment epithelium, ARPE-19, the synthesis and secretion of endothelin-1 (ET-1) is regulated by cholinergics and TNF-alpha. In the present study we investigated the expression of ET-1 in RPE in situ, in rat and human eyes. Additionally, we have employed the human retinal pigment epithelial (ARPE-19) cells to delineate the apical and basolateral ET-1 expression and secretion by confocal microscopy and radioimmunoassay, respectively. Our results suggest a possible conservation of ET-1 expression predominantly in the mammalian RPE underlining its importance at this site. Additionally, our results suggest that constitutive ET-1 secretion is predominantly towards the basolateral side in cultured RPE possibly allowing ET-1 to activate its receptors located in the choroidal blood vessels and regulate retinal and choroidal blood flow.     

高糖对体外培养的人视网膜色素上皮细胞HSP47表达的影响

目的 探讨高浓度葡萄糖对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞热休克蛋白47(HSP47)表达的影响.方法 RPE细胞分别在5.56 mmol/L葡萄糖(对照组)以及25 mmol/L葡萄糖(高糖组)的培养条件下,通过RT-PCR检测HSP47 mRNA的表达,使用Western blot检测其蛋白水平.结果 高糖条件下,HSP47 mRNA表达水平显著增加(P＜0.05),蛋白水平亦显著增加(P＜0.05).结论 HSP47作为一种胶原特异的分子伴侣,在高糖条件下RPE细胞内表达的增加可能是导致增生型糖尿病视网膜病变(PDR)发展的重要因素之一.     

姜黄素纳米粒对人视网膜色素上皮细胞的示踪研究

目的:探讨脱氧胆酸基接枝的壳聚糖衍生物负载姜黄素纳米粒的合成方法及该药物纳米粒对人视网膜色素上皮(hRPE)细胞的作用。方法:合成姜黄素/壳聚糖-脱氧胆酸纳米粒并分析其性能。将负载荧光染料异硫氰酸荧光素的壳聚糖-脱氧胆酸及姜黄素/壳聚糖-脱氧胆酸作用于hRPE细胞24h后,于倒置荧光显微镜下观察避光培养1、3、5d后二者与hRPE细胞的相互关系。结果:通过将姜黄素与壳聚糖-脱氧胆酸混合制成负载药的壳聚糖衍生物纳米粒为淡黄色;药物从纳米粒中的释放在96h后达到平衡,累积释放药物量为31.6%。异硫氰酸/壳聚糖-脱氧胆酸与hRPE细胞作用1d后,壳聚糖-脱氧胆酸纳米粒大部分仍位于近细胞膜的部位;作用3d后,纳米粒逐渐向细胞核会聚,且大部分位于细胞核周围;作用5d后,可看到壳聚糖-脱氧胆酸纳米粒已进入细胞核,且纳米粒可能在细胞内溶酶体的作用下有部分降解。姜黄素/壳聚糖-脱氧胆酸纳米粒和hRPE细胞作用的关系与壳聚糖-脱氧胆酸大致相同。结论:通过壳聚糖-脱氧胆酸包载的姜黄素纳米粒能持续释放出姜黄素,具有较持久的缓释功能。     

水蛭提取液体外对人视网膜色素上皮细胞PAR-1表达的影响

目的:研究水蛭提取液对人视网膜色素上皮(retinal pigment epichelial,RPE)细胞PAR-1表达的影响。方法:水蛭提取液体外单独或与凝血酶共同作用于人RPE细胞后,用免疫荧光法测定PAR-1的荧光表达。结果:PAR-1的免疫荧光光密度值比较:(1)凝血酶组与正常对照组比较,PAR-1的IOD值下降(1608±675,4036±1134,P<0.01)。(2)单加水蛭提取液组与正常对照组比较,PAR-1的IOD值升高(9998±2374,4036±1134,P<0.01)。(3)凝血酶和水蛭提取液同时加药组与凝血酶组比较,PAR-1的IOD值显著升高(19664±5436,1608±675,P<0.01)。表明水蛭提取液能竞争性抑制凝血酶对PAR-1的活化作用。结论:水蛭提取液能抑制凝血酶诱导的人RPE细胞膜上的PAR-1的活化,阻断PAR-1介导的细胞信号传导。     

IL-1β和TNF-α对培养的人视网膜色素上皮细胞波形蛋白表达的影响

目的　观察IL 1β和TNF α对培养的人视网膜色素上皮 (RPE)细胞波形蛋白表达的影响。 方法　采用免疫组织化学和彩色图像分析技术检测IL 1β和 /或TNF α( 2 0ng/mL)对RPE细胞波形蛋白表达的影响。 结果　波形蛋白表达的灰度值分别为 :IL 1β TNF α处理组 76 9± 8 1,IL 1β处理组 78 4± 8 1,TNF α处理组 90 2± 6 7。与对照组 110 2±10 7比较均有显著性差异 (P <0 0 1)。结论　IL 1β和 /或TNF α可上调波形蛋白的表达 ,在增生性玻璃体视网膜病变(PVR)中可能参与RPE细胞增殖过程中中间丝的改变。