信号通路抑制剂对PTEN基因不同表达状态子宫内膜癌细胞的作用

目的 比较相关信号通路抑制剂诱导PTEN基因不同表达状态子宫内膜癌细胞的增殖和凋亡情况.方法 以PTEN反义寡核昔酸及PTEN真核表达载体转染子宫内膜癌细胞(HEC-1A、Ishikawa)后,激光共聚焦显微镜观察PTEN蛋白的表达.表皮生长因子受体、丝裂原活化蛋白激酶及雷帕霉素靶蛋白信号通路抑制剂--RG-14620、SB203580(SB)及西罗莫司分别处理HEC-1A、HEC-1A-PTEN-null、Ishikawa、Ishikawa-PTEN细胞,荧光染色法、流式细胞仪、四甲基偶氮唑蓝比色法分别检测细胞凋亡时的形态学改变、细胞凋亡率、细胞周期分布、细胞存活率.结果 转染后,Ishikawa-PTEN细胞内PTEN蛋白表达增加,HEC-1A-FFEN-null细胞内PTEN蛋白表达受到抑制.RG-14620、SB及西罗莫司处理后,Ishikawa和HEC-1A-PTEN-null细胞荧光染色见核呈浓集周缩改变;细胞发生明显凋亡及G1期阻滞,尤以SB作用最为显著,Ishikawa+SB、HEC-1A-PTEN-null+SB的细胞凋亡率分别为(37.8±0.8)%、(31.6±0.8)%,G_1期细胞比例增加[分别为(87.5±1.9)%、(84.1±3.2)%];细胞增殖受到抑制,尤以SB处理后作用为显著,Ishikawa+SB、HEC-1A-PTEN-null+SB的细胞存活率仅为(49.0±1.7)%、(54.0±2.1)%.结论 PTEN基因缺失使相应信号通路抑制剂作用的子宫内膜癌细胞增殖明显受抑,细胞阻滞于G1期,细胞凋亡增加,对相关信号通路抑制剂的敏感性增加.     

沉默IGF-1R表达对子宫内膜癌化疗敏感性的影响及其相关机制研究

目的:将慢病毒载体表达的靶向IGF-1R的干扰片段转染子宫内膜癌细胞HEC-1B,探讨转染前后HEC-1B对顺铂化疗敏感性的改变及可能的潜在机制。方法:构建IGF-1R基因RNAi慢病毒载体,转染HEC-1B细胞并检测转染效率,Real-time PCR及Western blot检测转染前后IGF-1R基因及相关蛋白的表达情况,采用MTT及流式细胞仪分析转染前后细胞增殖率及凋亡的改变。结果:慢病毒载体的转染效率高达78%,转染特异IGF-1R siRNA使内源性IGF-1R mRNA降低85%(P<0.05),蛋白降低91.4%(P<0.05);Akt及Erk的磷酸化水平降低,分别是总Akt及Erk的(17.48±3.31)%与(11.55±3.27)%(P<0.05);转染前后的细胞暴露于不同浓度的顺铂作用48h,当顺铂浓度从10μmol/L增加到40μmol/L时,转染特异IGF-1R siRNA的细胞凋亡率从(22.21±4.63)%增加到(41.92±2.5)%(P<0.05);顺铂的IC50值从21.85μmol/L降到10.58μmol/L(P<0.05),同时伴随着cleaved caspase-9的表达增强(P<0.05)。结论:沉默IGF-1R的表达通过抑制下游信号通路的传导,增强子宫内膜癌对顺铂化疗敏感性。     

金雀黄素诱导人子宫内膜癌细胞HEC-1B凋亡及机制的研究

目的研究金雀黄素（Genistein，GEN）诱导人子宫内膜癌细胞株HEC-1B凋亡，探讨金雀黄素诱导HEC-1B细胞凋亡与抑癌基因PTEN之间的关系。方法应用流式细胞仪检测细胞凋亡，应用流式细胞仪检测抑癌基因PTEN蛋白的表达，两者之间的相关性。结果金雀黄素诱导HEC-1B细胞的凋亡，其作用随剂量增加而增强；金雀黄素可上调HEC-1B细胞抑癌基因PTEN蛋白的表达，其作用随剂量增加而增强。结论金雀黄素能够诱导HEC-1B细胞凋亡，其机制可能是通过上调HEC-1B细胞PTEN的表达而实现。     

阻断丝裂原活化蛋白激酶信号通路对子宫内膜癌生长抑制作用的研究

目的:研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPK/ERK)信号通路抑制剂(PD98059)对ER阳性表达的Ishikawa和ER低表达的HEC-1A人子宫内膜癌细胞系的裸鼠体内抗增殖作用,探讨阻断MAPK/ERK信号传导通路治疗子宫内膜癌的可行性。方法:体外培养人子宫内膜癌Ishikawa、HEC-1A细胞,将对数生长期的两种细胞分别接种于裸鼠背部皮下,建立子宫内膜癌裸鼠移植瘤模型。将两种细胞系成瘤阳性裸鼠随机分为对照组和实验组,每组6只,分别腹腔注射生理盐水和PD98059,每周2次,共3周,观察各组裸鼠移植瘤的生长情况,建立移植瘤生长曲线,计算抑瘤率。实验结束时取肿瘤组织切片HE染色,原位末端标记(TUNEL)法检测组织细胞的凋亡,Western blot检测各组织中ERK1/2的活化。结果:(1)PD98059能有效抑制人子宫内膜癌Ishikawa、HEC-1A细胞裸鼠皮下移植瘤的生长;(2)HE染色可见实验组瘤细胞核浆比相对较小,血管密度降低;TUNEL染色可见两种细胞移植瘤中实验组细胞凋亡率较对照组明显增加;(3)Western blot检测结果:PD98059能有效降低裸鼠移植瘤组织中p-ERK表达。结论:PD98059通过阻断MAPK/ERK信号传导通路增加Ishikawa和HEC-1A细胞裸鼠移植瘤组织中细胞凋亡,抑制肿瘤生长,抗肿瘤效果明显,可成为治疗子宫内膜癌的有效方法。     

HBXIP真核表达载体及转基因人子宫内膜癌细胞系的构建研究

目的构建携带肝炎BX-相互作用蛋白(HBXIP)基因的重组pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP质粒,将其转染人子宫内膜癌HEC-1A,建立稳定表达HBXIP蛋白的细胞株,并检测HBXIP在人子宫内膜癌HEC-1A细胞中的表达。方法实验于2014—2015年于中国医科大学附属第一医院中心实验室进行。聚合酶链反应(PCR)逆转录c DNA扩增HBXIP基因全长,亚克隆到真核表达载体pc DNA3.1-myc-his A内,构建出重组真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP,酶切及DNA测序证实重组质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP正确插入HBXIP的核苷酸序列。证实HBXIP基因成功插入空载体pc DNA3.1-myc-his A,脂质体法将pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP转染HEC-1A细胞,并用Western blot免疫印迹法检测在人子宫内膜癌细胞HEC-1A中HBXIP蛋白表达。结果 (1)HBXIP总RNA在提取进程中没有发生明显的降解,说明获得的RNA和m RNA完整。PCR扩增后的产物在约276 bp处出现明显的特异性条带,与理论预计的c DNA片段长度一致。(2)HBXIP基因真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP成功构建,重组质粒经pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP酶切和测序鉴定,表明均含有大小正确的HBXIP基因片段。(3)Western blot免疫印迹法检测在人子宫内膜癌HEC-1A细胞中HBXIP蛋白表达。pc DNA3.1-myc-his A组与pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP组HBXIP蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论 HBXIP基因片段被成功插入真核表达载体质粒pc DNA3.1-myc-his A的多克隆位点,成功构建了HBXIP基因的重组真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP。构建的HBXIP基因重组真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP转染HEC-1A细胞后,可在HEC-1A细胞中稳定表达,为进一步研究HBXIP基因奠定了基础。     

二甲双胍对人子宫内膜癌细胞迁徙能力的影响

目的：体外检测二甲双胍对人子宫内膜癌（Ec）细胞迁徙能力的影响,并探讨其可能的作用机制。方法：培养Ishikawa和HEC-1A人子宫内膜癌细胞系,用不同浓度的二甲双胍干预EC细胞。采用划痕试验检测细胞迁徙能力;流式细胞术检测细胞周期和凋亡;Western blot法检测Akt、p-Akt及PTEN的表达。结果：二甲双胍显著抑制Ishika—wa和HEC-1A细胞的迁徙能力（P均〈0．05）。流式细胞术检测显示,二甲双胍使G0／G1期细胞比例显著升高,同时有凋亡诱导作用;Westernblot法检测显示,二甲双胍能下调P—Akt的表达（P均〈0．05）。结论：二甲双胍显著抑制EC细胞的迁徙能力,其作用机制可能与下调p-Akt的表达有关。     

雌激素受体亚型α对子宫内膜癌细胞HEC-1B侵袭能力调控的研究

目的：特异性下调子宫内膜癌细胞中的ERα基因，探讨E胁亚型表达在子宫内膜癌侵袭中的作用。方法：将ERa的小干扰RNA（siRNA-small interfering RNA）转染子宫内膜癌细胞HEC-1B，通过RT-PCR和Western blot证实ERα基因的有效阻断。通过transwell小室法检测下调ERa基因表达前后HEC-1B细胞的侵袭能力；应用RT-PCR检测转染前后细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA表达水平的变化；Western blot及明胶酶谱分别检测细胞分泌TIMP-1、TIMP-2、MMP-2和MMP-9蛋白的水平。结果：（1）将ERα-siRNA转染HEC-1B细胞后，转染效率大于90％，ERα mRNA及蛋白的表达水平均明显下调（分别为72％，67％）；（2）下调ERα基因表达后，肿瘤细胞的侵袭能力下降（P〈0．05）；在mRNA水平和蛋白水平均可检测到ERα-siRNA组细胞的MMP-2、MMP-9表达下降（P〈0．05），TIMP-1、TIMP-2表达增加（P〈0．05）。结论：使用ERα-siRNA能够有效地阻断ERa基因表达；子宫内膜癌细胞中，17β-雌二醇对MMPs／TIMPs具有调节作用，这种作用可通过ERα介导；ERα表达水平影响子宫内膜癌细胞的侵袭能力。     

CDCA5促进子宫内膜癌细胞增殖和迁移的作用及机制

目的:探讨CDCA5在促进子宫内膜癌细胞增殖和迁移上的作用及相关机制。方法:生物信息学预测和分析CDCA5与CCNB1在子宫内膜癌中可能存在的相关性。慢病毒敲低CDCA5表达后检测CCNB1表达水平的变化情况，以及检测子宫内膜癌细胞增殖、迁移能力。使用特异性ERK抑制剂后检测磷酸化ERK1/2及CDCA5表达水平，以及验证ERK抑制剂对子宫内膜癌细胞增殖、迁移能力的影响。过表达CDCA5后检测子宫内膜癌细胞功能及相关蛋白表达的变化。结果:生物信息学分析结果显示，CDCA5和CCNB1在子宫内膜癌中高表达且两者之间存在相关性。敲降CDCA5表达显著降低子宫内膜癌中CCNB1表达，抑制细胞增殖和迁移。特异性MAPK通路抑制剂能有效抑制子宫内膜癌细胞中CDCA5和磷酸化ERK1/2蛋白表达并抑制细胞增殖和迁移能力。过表达CDCA5能促进ERK1/2蛋白磷酸化并增强子宫内膜癌细胞的增殖和迁移能力。结论:CDCA5可能成为子宫内膜癌的潜在治疗靶点，其可能通过上调CCNB1表达，激活ERK信号通路促进子宫内膜癌的发生发展，抑制和干扰CDCA5或其通路关键因子，可能为子宫内膜癌的临床诊断和治疗提供更...     

基质细胞衍生因子1α对子宫内膜癌细胞信号传导通路的激活作用

目的探讨基质细胞衍生因子1α（SDF-1α）对子宫内膜癌细胞系HEC-1A和Ishikawa磷脂酰肌醇3激酶，蛋白激酶B(PI-3K／Akt)及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导通路的激活作用。方法应用蛋白免疫印迹杂交技术，检测SDF-1α作用于HEC-1A和Ishikawa细胞后Akt及ERK的活化情况。结果20ng/ml SDF-1α作用于HEC-1A细胞15min时，ERK1/2活化最明显，且持续至少达2h，随着SDF-1α浓度的增加，ERK1/2活化逐渐增强；SDF-1α作用HEC-1A细胞后Akt的活化水平无明显改变。20ng/ml SDF-1α作用于Ishikawa细胞15min时，Akt活化最明显，且持续至少达2h，随着SDF-1α浓度的增加，Akt活化逐渐增强；SDF-1α作用Ishikawa细胞后ERK1/2的活化水平无明显改变。结论SDF-1α作用于雌激素受体阴性的HEC-1A细胞和雌激素受体阳性Ishikawa细胞，激活的信号传导通路不同。     

SLP-2 mRNA在子宫内膜癌中的表达及其意义

目的探讨SLP-2mRNA在子宫内膜癌中的表达,及其在子宫内膜癌发生、发展中的作用。方法采用半定量RT-PCR技术检测32例子宫内膜癌组织和28例正常子宫内膜组织中SLP-2mRNA的表达情况;并用表达SLP-2基因的正义和反义质粒,分别转染子宫内膜癌细胞系HEC-1B细胞,RT-PCR技术检测转染前、后HEC-1B细胞中SLP-2mRNA的表达情况,观察转染前、后细胞的形态变化;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞生长情况,并绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果子宫内膜癌组织中SLP-2mRNA的表达水平为1.6±0.7,正常子宫内膜组织为0.7±0.3,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。表达SLP-2基因的正义和反义质粒成功转入HEC-1B细胞中,正义质粒转染后SLP-2mRNA表达水平增加约2.4倍,细胞生长变快,其中G1期减少12.5%,S期增高8.0%;反义质粒转染后SLP-2mRNA表达水平减少50%,细胞生长变慢,其中G1期增高10.5%,S期减少9.8%。结论子宫内膜癌中SLP-2mRNA的高表达与子宫内膜癌发生、发展有一定关系。     

长链非编码RNA与子宫内膜癌关系的研究进展

子宫内膜癌是妇科常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年增长。长链非编码RNA(lncRNA)是非编码RNA家族的成员之一,近年研究发现其在子宫内膜癌的病理过程中发挥重要的调控作用,成为研究热点。lncRNA可作为促进基因,通过人类第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PTEN/PI3K/AKT/mTOR)、Wnt/β连环蛋白(Wnt/β-Catenin)、细胞外信号调节激酶/腺苷酸活化蛋白激酶(ERK/AMPK)等多种信号通路调控子宫内膜癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡过程,亦可通过PTEN/PI3K/AKT/mTOR途径抑制子宫内膜癌过程。在lncRNA调控子宫内膜癌的过程中,形成的lncRNA-miRNA轴可作为未来干预治疗的新方向。lncRNA还可影响化疗药的耐药性,并对子宫内膜癌的诊断和预后有重要价值。综述近年lncRNA和子宫内膜癌的研究,为lncRNA对于子宫内膜癌的诊断、预后或治疗靶点提供理论依据。     

Stromal cell-derived factor 1alpha stimulates human endometrial carcinoma cell growth through the activation of both extracellular signal-regulated kinase 1/2 and Akt

OBJECTIVE: The aim of study was to investigate the proliferative effects of stromal cell-derived factor-1alpha (SDF-1alpha) on endometrial carcinomas cell lines with different estrogen receptors (ER) and PTEN protein profiles. METHODS: MTT assays was used to detect the proliferation of HEC-1A and Ishikawa cells, and Western blotted analysis was used to detect activation of Akt and ERK1/2 in both cell lines after exposure to various concentrations of SDF-1alpha, MAPK-specific inhibitor PD98059 or PI3K-specific inhibitor LY294002. RESULTS: Low concentrations of SDF-1alpha (50 ng/ml) induced proliferation in both cell lines. ERK1/2 was significantly activated for more than 2 h by SDF-1alpha at 20 ng/ml in HEC-1A cells, but not in Ishikawa cells. In contrast, Akt was significantly activated for over 2 h in Ishikawa cells but remained unchanged in HEC-1A cells. High concentrations of SDF-1alpha activated Akt and ERK1/2 pathways in both cell lines in a dose-dependent manner, which was primarily inhibited by LY294002 for pAkt and by PD98059 for pERK 1/2. CONCLUSIONS: SDF-1alpha could stimulate the cell proliferation of endometrial carcinoma with different expression status of ER and PTEN in vitro, likely through the activation of both Akt and ERK1/2 signaling pathways.     

钙激活性中电导钾离子通道在子宫内膜癌组织中的表达及其在细胞增殖中的作用

目的 探讨子宫内膜癌组织中钙激活性中电导钾离子通道(IKCal)的表达变化及其在子宫内膜癌细胞增殖中的作用.方法 应用蛋白印迹(western blot)法、RT-PCR技术来研究13份正常子宫内膜及25份子宫内膜癌组织中IKCal mRNA和蛋白的表达;利用IKCal的阻断剂--克霉唑(clotrimazole),使用小分子干扰RNA(siRNA)的RNA干扰技术和氚胸腺嘧啶核苷掺入试验等观察子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖的变化.结果 子宫内膜癌组织中IKCal mRNA的阳性表达率及表达水平(分别为84%、0.89±0.52)明显高于正常子宫内膜组织(分别为8%、0.14±0.12,P均＜0.01).子宫内膜癌组织中IKCal蛋白的阳性表达率及表达水平(分别为80%、1.18±0.41)也明显高于正常子宫内膜组织(分别为15%、0.71±0.26,P均＜0.01).子宫内膜癌组织中IKCal mRNA和蛋白的表达水平与手术病理分期无关(P＞0.05),但与病理分级有关(P＜0.05).克霉唑呈剂量和时间依赖性方式阻滞HEC-1A细胞的增殖.与转染阴性对照siRNA的细胞比较,转染IKCal siRNA的HEC-1A细胞IKCal蛋白的表达水平降低,为转染阴性对照siRNA的细胞的(48.27±9.07)%.与转染阴性对照siRNA的HEC-1A细胞比较,转染IKCal siRNA能减少细胞的增殖(P＜0.05).结论 IKCal的异常表达与子宫内膜癌的发展密切相关,降低其表达可减少子宫内膜癌细胞的增殖.     

RNA干扰技术沉默IGF-1R效应对子宫内膜癌细胞增生及裸鼠成瘤的抑制作用

目的研究靶向胰岛素样生长因子受体-1(IGF-1R)的小干扰RNA(siRNA)对子宫内膜癌生长的抑制作用。方法采用实时定量PCR(real-time PCR)和蛋白印迹法(Western-blot)测定RNA干扰后IGF-1R的表达水平;采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期改变;裸鼠成瘤实验测定IGF-1R基因表达下调后子宫内膜癌细胞在体内致瘤能力的改变。结果靶向IGF-1R基因的siRNA可以有效抑制IGF-1R基因的表达,使IGF-1R mRNA表达减少85.0%,蛋白表达减少91.4%;流式细胞术检测到转染后细胞凋亡率明显升高,发生G2/M期阻滞;裸鼠体内成瘤能力降低。结论 siRNA介导的IGF-1R基因下调能明显抑制子宫内膜癌的体内外生长。     

雌激素通过FTO基因调控子宫内膜癌细胞的增殖活性

目的:探讨雌激素对子宫内膜癌细胞系ishikawa细胞中肥胖相关基因FTO表达的调控机制以及对增殖的影响。方法:RT-PCR及细胞免疫荧光法检测不同浓度雌激素处理后ishikawa细胞中FTO表达水平的变化,PCR方法检测雌激素是否通过PI3K/AKT和MAPK信号通路对FTO进行调控,应用siRNA干扰法和MTT分析法检测FTO基因对细胞增殖的影响。结果:(1)不同浓度雌激素均可上调ishkawa细胞中FTO mRNA的表达,以10-9mol/L作用最明显,与对照组的差异有统计学意义(P<0.05);(2)E2+LY294002、E2+U0126组FTO mRNA表达水平比单独加雌激素组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),E2+LY294002+U0126联合加通路抑制剂组比E2+LY294002、E2+U0126单独加通路抑制剂组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);(3)siFTO干扰组FTO mRNA表达水平比阴性对照组明显降低,干扰效率达40%(P<0.05),FTO被干扰后,细胞的增殖活性受到明显的抑制,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:雌激素通过受PI3K/AKT和MAPK信号通路调控的FTO基因调控细胞的增殖活性。     

AKT involvement in cisplatin chemoresistance of human uterine cancer cells

OBJECTIVE: The aim of this study was to investigate the possible involvement of Akt activity and specific isoforms (Akt1, Akt2, and Akt3) in the resistance of human uterine cancer cells to cisplatin. METHODS: Two different endometrial (HEC-1-A and KLE) and one cervical (HeLa) cancer cell lines all known as wild-type PTEN (tumor suppressor phosphatase tensin homologue, a lipid phosphatase involved in the negative regulation of Akt activity) were used for these studies. RESULTS: Basal levels of Akt1, Akt2, and Akt3 mRNAs were determined by real-time quantitative RT-PCR studies and Western blot analyses were carried out to determine protein abundance of each isoforms. Akt1 mRNA and protein were present in all cell lines studied. Akt2 and Akt3 mRNAs and proteins were strongly expressed in KLE cells. Surprisingly, Akt phosphorylation was found in KLE expressing high levels of wild-type PTEN protein. KLE cells remained resistant to PI 3-K inhibitor, indicating that Akt phosphorylation might be, in part, independent of PI 3-K in this cell line. Cisplatin induced apoptosis in HeLa and HEC-1-A cells, but KLE cells expressing Akt2 and Akt3 remained more resistant to cisplatin. Knockout of Akt isoforms using specific siRNA technology increased the sensitivity of KLE cells toward cisplatin and caused a significant induction of cell death. CONCLUSION: Taken together, these results suggest that specific Akt isoforms such as Akt2 and Akt3 might be involved in chemoresistance to cisplatin and that these isoforms could be putative targets for gene therapy in uterine cancers.