EDC交联离子化胶原支架材料的生物学表征

目的:研究EDC交联对离子化胶原支架材料的理化性能的影响。方法:采用侧链修饰结合碳化二亚胺交联改性技术制备实验使用的离子化胶原材料:天然胶原、甲基化胶原、琥珀酰化胶原,通过扫描电境、差示扫描热计、傅里叶变换红外光谱仪和体外酶降解实验分析对胶原材料交联前后的结构与性能进行研究。结果:侧链修饰改变了胶原的表面电荷性质,碳化二亚胺交联提高了天然胶原、甲基化胶原的孔径、孔隙率(P<0.05)、变性温度、抗酶降解能力(P<0.05),改变了其化学结构;而对琥珀酰化胶原的孔径、孔隙率、化学结构无明显影响,且降低了其变性温度和抗酶降解能力(P<0.05)。结论:EDC交联可显著改善离子化胶原支架材料的物理化学性能,为其在牙周组织再生中的初步应用提供了实验基础。     

人牙周膜细胞在透明质酸朋交原支架上的黏附与生长

目的研究人牙周膜细胞（PDLC）在胶原、透明质酸及透明质酸／胶原支架上的黏附、生长情况,以初步探讨透明质酸／胶原支架应用于牙周组织工程的可行性。方法将体外培养的人牙周膜细胞接种到碳化二亚胺交联的胶原、透明质酸及透明质酸／胶原支架上;MTT法检测支架对人牙周膜细胞黏附、生长的影响：并用倒置相差显微镜和扫描电镜观察形态变化。结果MTT结果显示胶原、透明质酸及透明质酸／胶原支架上人PDLC的黏附、生长情况,在第1、2、4天组间比较差异具有统计学意义（P〈0．05）,第7天组间差异无统计学意义（P〉0．05）,且人牙周膜细胞数量透明质酸／胶原组均高于对照组;人牙周膜细胞在支架上生长良好。结论相对于胶原支架和透明质酸支架,透明质酸／胶原支架更有利于人牙周膜细胞的黏附,提示该材料具备成为牙周组织工程理想支架材料的潜力。     

胶原改性PLGA电纺纤维的制备及其细胞相容性研究

目的：制备胶原改性的聚羟基乙酸-聚乳酸共聚物（PLGA）电纺纳米纤维支架,检测其对真皮成纤维细胞生长和增殖的影响。方法：采用静电纺丝法制备PLGA电纺纤维,并且利用低温等离子体技术对电纺纤维进行改性,在其表面接枝Ⅰ型胶原蛋白。将体外培养的真皮成纤维细胞接种至材料表面,采用MTT法和扫描电镜研究成纤维细胞在改性前后材料表面的生长和增殖情况,评价改性后PLGA电纺纤维支架的细胞相容性。结果：MTT结果表明,真皮成纤维细胞在胶原接枝改性的PLGA电纺纤维表面的生长明显优于未经处理的纤维。电镜观察显示所制备的PLGA电纺纤维直径均一,呈相互连通的多孔网状结构,成纤维细胞在改性后的材料表面具有良好的生长形态。结论：经过等离子体改性-胶原接枝,PLGA电纺纤维的细胞相容性得到有效提高,在组织工程支架领域有良好的应用前景。     

人牙周膜细胞在透明质酸/胶原支架上的黏附与生长

目的研究人牙周膜细胞（PDLC）在胶原、透明质酸及透明质酸/胶原支架上的黏附、生长情况,以初步探讨透明质酸/胶原支架应用于牙周组织工程的可行性。方法将体外培养的人牙周膜细胞接种到碳化二亚胺交联的胶原、透明质酸及透明质酸/胶原支架上;MTT法检测支架对人牙周膜细胞黏附、生长的影响;并用倒置相差显微镜和扫描电镜观察形态变化。结果MTT结果显示胶原、透明质酸及透明质酸/胶原支架上人PDLC的黏附、生长情况,在第1、2、4天组间比较差异具有统计学意义（P<0.05）,第7天组间差异无统计学意义（P>0.05）,且人牙周膜细胞数量透明质酸/胶原组均高于对照组;人牙周膜细胞在支架上生长良好。结论相对于胶原支架和透明质酸支架,透明质酸/胶原支架更有利于人牙周膜细胞的黏附,提示该材料具备成为牙周组织工程理想支架材料的潜力。     

RGD七肽固定对胶原粘附人牙周膜成纤维细胞粘附的影响

目的：将促粘附分子RGD七肽（GRGDSPC）固定于Ⅰ型胶原材料，研究其对人牙周膜成纤维细胞粘附性的影响。方法：实验分4组。A组：耦联组，采用化学交联剂sulfo—Lc—SPDP，使含RGD肽的GRGDSPC肽与胶原支架结合。B组：混合组，将GRGDSPC肽与I型胶原直接混合后涂层。C组：单纯胶原涂层组。D组：未涂层孔板组。采用贴壁法培养人牙周膜成纤维细胞，鉴定其细胞起源；检测细胞贴壁率，评估不同时间、不同浓度人牙周膜成纤维细胞粘附效果。结果：成功建立人牙周膜成纤维细胞的分离和体外培养方法；方差分析分组变量、浓度变量及时问变量对贴壁率的影响，结果显示A、B、c、D分组（P〈0．05）、GRGDSPC浓度分组（P〉0．05）及时间分组（P〈0．05），各因素间无交互作用；A组与B、C、D各组比较，有统计学差异（P〈0．05）。结论：耦联组GRGDSPC肽固定Ⅰ型胶原后细胞粘附率明显高于其它各组，且呈时间和肽浓度依赖性。     

胶原基纳米骨的遗传毒性及对体外培养细胞影响的研究

目的：体外研究胶原基纳米骨的遗传毒性,及对原代培养的人牙周膜成纤维样细胞、兔成骨细胞的影响。方法：采用Ames致突变试验、MTT法及碱性磷酸酶（ALP）检测法,测定不同浓度胶原基纳米骨（nHAC）的浸提液对鼠伤寒沙门菌的致突变比值的影响和对人牙周膜成纤维样细胞及兔成骨细胞的影响。结果：nHAC的浸提液各剂量组对鼠伤寒沙门菌的致突变比值均小于2,nHAC不会引起鼠伤寒沙门菌的回复突变数增加。不同时间点用不同浓度浸提液培养的人牙周膜成纤维样细胞正常增殖,浸提液不影响兔成骨细胞的功能表达。结论：胶原基纳米骨无遗传毒性,不影响人牙周膜成纤维样细胞的增殖活性和兔成骨细胞的成骨活性,是一种组织工程骨支架的良好材料。     

牙周膜成纤维细胞在三维静电纺丝纳米纤维支架上的培养

目的:研究人牙周膜成纤维细胞与静电纺丝聚乳酸/聚己内酯纳米纤维支架体外培养的生物相容性.方法:分离、培养人牙周膜成纤维细胞,接种在静电纺丝纳米纤维支架上,与常规培养条件下的细胞进行比较,观察生长形态、生长曲线、倍增时间及活性.结果:人牙周膜成纤维细胞生长情况与常规培养基本一致,2组间的倍增时间比较无统计学差异(P＞0.05),活细胞百分率与正常培养无明显统计学差异(P＞0.05).结论:人牙周膜成纤维细胞在三维静电纺丝纳米纤维上生长、增殖,该支架材料具有很好的生物相容性,可作为牙周膜组织工程候选支架材料.     

贫血小板血浆和根面脱矿对人牙周膜成纤维细胞在病变牙根面附着和增殖的影响

目的：观察贫血小板血浆和根面脱矿单独及联合应用对人牙周膜成纤维细胞在病变牙根面的附着及增殖的影响,探讨PPP和根面脱矿处理在促牙周组织再生中的可能作用。方法：实验分4组,经PPP、EDTA和两者联合处理的病变根片的3组作为实验组,未处理的病变根片作对照组。分别通过细胞计数法、四唑盐比色法[MTT]和扫描电镜检测人牙周膜成纤维细胞在不同处理病变牙根表面的附着、增殖和形态。结果：与未处理组相比,PPP组及根面脱矿组均能促进人牙周膜成纤维细胞对病变根面的附着（P〈0.05）,二者联合处理促细胞附着效果明显增强（P〈0.01）;未处理组中人牙周膜成纤维细胞体外培养48h与培养24h相比,细胞在病变根片上的无增殖（P〈0.05）;单独PPP或脱矿处理组中人牙周膜成纤维细胞体外培养48h与培养24h相比,细胞在病变根片上的附着及增殖增加,但无统计学意义,PPP和根面脱矿联合处理组中细胞在病变根片上的附着及增殖明显增加（P〈0.05）。结论：PPP能牢固地附着于病变根面,PPP和根面脱矿单独和联合处理病变根片能明显加强人牙周膜成纤维细胞的附着和增殖,而PPP和根面脱矿联合处理还有显著的促细胞增值效应。     

富血小板血浆对牙周膜成纤维细胞在病变牙根表面胶原形成的影响

目的：研究不同浓度的富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）对牙周膜成纤维细胞（peridontal fibro—blasts,PDLFs）在脱矿的病变牙根表面形成胶原的影响。以进一步探讨富血小板血浆在促牙周组织再生中的作用。方法：采用组织块培养法培养原代人牙周膜成纤维细胞,取5～8代细胞用于实验。富血小板血浆的制备采用二步密度梯度离心法,获取PRP待用,取因重度牙周病拔除的病牙,制取牙根片,收集的根片经高压处理后留存待用。观察富血小板血浆对牙周膜成纤维细胞在脱矿的病变牙根表面胶原的形成,用天狼星红组织特染的方法进一步观察病变根片表面胶原形成的情况。结果：MTT结果和天狼星红特异性染色结果：实验组与对照组均有阳性染色,用Histogram功能来分析统计胶原所占面积的百分数,取其平均值,实验组与对照组差异有显著性（P〈0．05）。结论：浓度为20％PRP为促进PDLFs在脱矿处理的病变牙根表面附着的最佳浓度,并能促进其在处理的脱矿的病变牙根表面胶原的形成。推测PRP和根面脱矿处理在牙周再生中起重要作用。     

人牙周膜成纤维细胞在无血清培养液中的生长特性

目的：探讨人牙周膜成纤维细胞在无血清培养液中的生长特性。方法：用倒置显微镜和MTT法观察人牙周膜成纤维细胞在无血清培养液中的生长和增殖变化。结果：人牙周膜成纤维细胞在无血清培养条件下可以生长的增殖，但与含血清培养液相比，其增殖速率变缓，分化明显。结论：无血清培养液可应用于人牙周膜成纤维细胞的体外培养和实验研究中。     

聚己内酯静电纺丝支架与人牙周膜干细胞的生物相容性

目的：观察荧光标记的人牙周膜干细胞在聚己内酯静电纺丝支架上的生长情况,评价聚己内酯静电纺丝支架与人牙周膜干细胞的生物相容性.方法：采用有限稀释法,体外分离培养人牙周膜干细胞.用荧光染料对牙周膜干细胞进行标记,检测细胞增殖情况,评价荧光标记对细胞生长特性的影响.制备聚己内酯静电纺丝支架,与牙周膜干细胞直接接触共培养7d,激光共聚焦显微镜观察细胞在支架材料上的黏附和增殖情况,扫描电镜观察细胞在支架材料上的生长状态.结果：成功分离培养人牙周膜干细胞;荧光染料标记后细胞发红色荧光,标记对细胞形态和生长特性无显著影响.激光共聚焦显微镜观察,可见牙周膜干细胞能够在聚己内酯静电纺丝支架上黏附增殖,局部细胞生长融合.扫描电镜观察,可见牙周膜干细胞在聚己内酯静电纺丝支架上黏附牢固,可进入支架内部复层生长.结论：荧光标记的牙周膜干细胞在聚己内酯静电纺丝支架上生长良好,聚己内酯静电纺丝支架与牙周膜干细胞具有良好的生物相容性,有望作为牙周组织工程的载体材料.     

胰岛素在高糖环境诱发牙周膜细胞凋亡过程中的调节作用

目的:探讨胰岛素在高糖环境下牙周膜细胞凋亡过程中的调节作用。方法:本实验采用含有不同葡萄糖浓度的培养基培养人牙周膜细胞,并采用胰岛素作治疗对照,作用24小时后,立即使用流式细胞仪对各组凋亡细胞进行计数,最后进行统计学分析。结果:葡萄糖浓度增至15mmol/L时,牙周膜细胞凋亡比例无显著增加(3.47±0.78 VS 3.03±0.40,P>0.05),当葡萄糖浓度增至25mmol/L和35mmol/L时,牙周膜细胞凋亡比例显著增加(5.07±0.611 VS 3.03±0.40,P<0.01;7.13±0.72 VS 3.03±0.40,P<0.01),加入胰岛素后,牙周膜细胞凋亡比例显著下降(7.13±0.72 VS 5.23±0.85,P<0.01),但仍然高于正常糖浓度组(5.23±0.85 VS3.03±0.40,P<0.01)。结论:胰岛素能够部分抑制高糖环境诱发的牙周膜细胞凋亡。     

生长因子缓释微球的制备及对人牙周膜成纤维细胞作用的研究

目的：制备重组人胰岛素样生长因子缓释明胶微球（rhIGF-Ⅰ-GMs）,观察其一般性质、体外释药特性、对人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）的增殖及Ⅰ型胶原合成的影响。方法：改良乳化冷凝聚合法制备rhIGF-Ⅰ-GMs,扫描电镜（SME）观察其一般性质;ELISA法测定rhIGF-Ⅰ的含量,计算微球包封率和载药率及绘制微球体外释药曲线。体外培养HPDLFs,四唑盐比色法（MTT）和羟脯氨酸试剂盒消化法动态观察rhIGF-Ⅰ和rhIGF-Ⅰ-GMs梯度含量分别对HPDLFs增殖及Ⅰ型胶原合成的影响。结果：微球表面光滑圆整,球体均匀度好,平均粒径为（12.51±3.53）μm,冻干粉剂为白色粉末状,再分散性良好,微球载药量和包封率分别为920ng/g和92.0%,体外7d内药物缓释72.5%;rhIGF-Ⅰ和rhIGF-Ⅰ-GMs均明显促进HPDLFs增殖及Ⅰ型胶原分泌（P〈0.05）;rhIGF-Ⅰ-GMs较单独应用rhIGF-Ⅰ的效果更加显著（P〈0.01）,呈浓度及时间依赖性。结论：rhIGF-Ⅰ-GMs及其冻干粉剂制备良好;rhIGF-Ⅰ-GMs通过对rhIGF-Ⅰ的缓释作用促进HPDLFs增殖及Ⅰ型胶原分泌的效果明显优于单独使用rhIGF-Ⅰ。     

兔脂肪源干细胞与牙周膜成纤维细胞共培养的实验研究

目的:研究脂肪源干细胞能否与牙周膜成纤维细胞直接共培养,在共培养状态下,脂肪源干细胞能否促进牙周膜成纤维细胞胶原特异基因的表达。方法:分别从新西兰白兔皮下脂肪和牙周膜组织中分离出脂肪源干细胞和牙周膜成纤维细胞,体外常规培养;将两种细胞等量混合共培养,利用光镜和F-actin染色标记细胞骨架的方法观察共培养细胞的形态变化,并与单纯培养的细胞比较;利用DAPI染色标示细胞核细胞计数法检测共培养细胞的增殖情况;利用定量PCR法检测特异基因I型胶原在单纯培养和共培养细胞中的表达。结果:脂肪源干细胞和牙周膜成纤维细胞能直接共培养;共培养细胞形态近似牙周膜成纤维细胞;共培养对细胞增殖无明显影响;脂肪源干细胞可提高牙周膜成纤维细胞I型胶原基因的表达。结论:脂肪源干细胞可与牙周膜成纤维细胞共培养,并促进牙周膜成纤维细胞的胶原分泌。     

PRP对纳米HA/PLGA复合支架上鼠骨骼肌卫星细胞增殖和成骨活性的影响

目的:研究富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite,nHA)/聚乳酸乙醇酸(poly lactic acid-co-glycolic acid,PLGA)(nHA/PLGA)支架上SD大鼠骨骼肌卫星细胞(muscle satellite cells,MSCs)黏附、增殖和成骨活性的影响。方法:将体外培养、扩增的鼠MSCs与同一供体来源的PRP混合,滴加到nHA/PLGA支架上,形成MSCs/PRP/nHA/PLGA复合物(实验组),继续在体外培养,以MSCs/nHA/PLGA复合物作为对照组。通过扫描电镜观察MSCs在支架上黏附、生长和增殖情况;水溶性四氮唑法(WST-1)法测定MSCs增殖情况;碘化丙啶(PI)与钙黄绿素-AM(Calcein-AM)检测MSCs的荧光活性;组织化学方法检测培养液中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和骨钙素(osteocalcin,OC)含量;RT-PCR检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)mRNA的表达。结果:扫描电镜观察显示,实验组大量MSCs黏附在支架表面及其洞壁上,并大量增殖和分泌骨基质,而对照组复合材料表面细胞附着较少;WST-1测定实验组吸光度值明显大于对照组(P<0.05);PI荧光染色二组的死细胞数量均较少;实验组ALP活性和OC含量均较对照组增高明显(P<0.05);RT-PCR结果显示OPN在实验组中表达明显增强。结论:PRP促进了nHA/PLGA支架上鼠MSCs黏附、增殖和成骨分化。     

在即刻种植术中应用两种不同方法处理骨缺损效果的比较

目的:比较珊瑚羟基磷灰石(CHA)复合富血小板血浆(PRP)或覆盖生物膜在即刻种植术中对骨再生效果的影响。方法:8只成年实验用犬,拔除双侧第2、3、4下颌前磨牙,同期植入种植体,制备种植体颈部的环状骨缺损,每侧植入3颗种植体,将种植体随机分为3组:A组,植入珊瑚羟基磷灰石和富血小板血浆的混合物;B组植入珊瑚羟基磷灰石,并覆盖可吸收胶原膜;C组作为对照组,不植入任何材料。术后3个月处死动物,先后进行大体观察、组织形态学观察、及生物力学测定,比较组间差异。结果:A组新生骨质较优,骨量多,B组骨缺损区无软组织长入,两者间骨结合率差异无统计学意义(P>0.05)。C组骨再生效果较差,与A、B两组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。3组标本生物力学测试结果差异均有统计学意义。结论:两种处理方法对种植体周的骨再生均有积极作用,富血小板血浆在促进骨组织生长方面优势明显,生物膜在阻挡软组织长入方面效果较优。     

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目的探讨雷洛昔芬对体外分离培养的人牙周膜成纤维细胞的增殖及分化能力的影响。方法本研究于2012年10月至2013年6月在福建医科大学附属口腔医院进行。采用组织块法体外分离培养人牙周膜成纤维细胞,分别给予不同浓度的雷洛昔芬进行培养,以17β-雌二醇（10 nmol/L）为阳性对照,单纯DMEM培养液为空白对照。观察雷洛昔芬对人牙周膜成纤维细胞增殖及分化能力的影响。结果与空白对照组相比,17β-雌二醇及不同浓度雷洛昔芬（1~1000 nmol/L）可显著刺激人牙周膜成纤维细胞的增殖（P〈0.01）,雷洛昔芬最大促增殖浓度为10 nmol/L。17β-雌二醇及浓度为1~100 nmol/L的雷洛昔芬可显著提高人牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶的表达（P〈0.01）,但1000 nmol/L雷洛昔芬对细胞碱性磷酸酶的表达无明显促进作用（P〉0.05）。17β-雌二醇及不同浓度雷洛昔芬（10及100 nmol/L）可显著提高人牙周膜成纤维细胞体外矿化能力,与空白对照组相比差异有显著性（P〈0.05）。100 nmol/L雷洛昔芬对细胞体外矿化能力的作用最明显。结论雷洛昔芬可提高体外培养的人牙周膜成纤维细胞的增殖、分化及矿化能力。