细胞因子midkine基因的克隆及其转化甲醇酵母Pichia pastoris

目的 克隆细胞因子midldne（MK）基因，并转化甲醇酵母Pichia pastoris。方法 利用RT—PCR方法从人胃癌MGC803细胞总RNA中扩增MK cDNA，构建分泌表达载体pPic9k—MK，然后转入宿主菌GS115中，提取GS115的基因组DNA，用PCR法扩增鉴定阳性克隆。结果 成功构建了分泌表达载体pPic9k—MK，并转入GS115中，筛选到抗4．0mg／ml G418的重组菌株，鉴定出5个阳性克隆。结论 MK基因可以转入甲醇酵母Pichia pastoris中，为今后在Pichia pastoris中表达有活性的MK蛋白，并进一步研究其生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

人毛乳头细胞HSPC016基因在毕赤酵母中的表达和鉴定

目的构建人毛乳头细胞HSPC016基因的真核表达载体,诱导其表达并对目的蛋白基本生物学特性进行鉴定.方法用PCR从pET-28a( )/HSPC016中扩增出195 bp目的基因,克隆至酵母表达载体pPIC9K质粒,经酶切鉴定后转化毕赤酵母菌GS115,G418-YPD平板筛选高拷贝转化子,甲醇诱导表达后进行Western blot检测和目的蛋白N-端氨基酸测序鉴定.结果用PCR成功扩增出目的基因;pPIC9K/HSPC016转化GS115用G418-YPD平板筛选高拷贝转化子,甲醇诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定:目的蛋白相对分子量约为7.2×103,与理论预测值相吻合;UVP扫描表明目的蛋白表达率约18%;Western blot检测具有良好的免疫反应性;N-端氨基酸测序结果与预期序列完全一致.结论HSPC016基因能通过酵母表达载体pPIC9K及宿主菌GS115进行高效、正确地表达,为研究HSPC016基因在真核细胞水平表达的生物学意义奠定了基础.     

EGF-IL-18在毕赤酵母中的表达

目的：在甲醇营养型毕赤酵母表达系统中分泌表达人表皮生长因子受体干扰基序和白细胞介素-18（EGF-IL-18）融合蛋白。方法：PCR扩增EGF-IL-18基因,克隆到表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后用电转化导入毕赤酵母GS115,筛选重组子,经摇瓶培养,用甲醇诱导表达EGF-IL-18融合蛋白。结果：序列分析表明,克隆到pPIC9K载体中的EGF-IL-18基因与设计相符,SDS-PAGE电泳分析显示表达产物EGF-IL-18以可溶性分子存在于酵母培养基中,Western印记表明表达产物EGF-IL-18具有良好的抗原性。结论：重组蛋白EGF-IL-18在毕赤酵母GS115中成功分泌表达。     

纳豆激酶基因重组质粒在大肠杆菌与毕赤酵母中的稳定性

利用PCR方法以纳豆杆菌染色体DNA为模板扩增纳豆激酶基因片段,分别克隆到原核表达载体pBV220与真核表达截体pPICZaA上,转化大肠杆菌HB101与毕赤酵母GS115,筛选重组子,通过限制性内切酶,PCR分析及序列测定,测定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因,对重组大肠杆菌与毕赤酵母中外源基因的稳定性进行研究比较,结果表明外源基因的插入对宿主菌的生长没有太大影响,重组质粒在E.coli HB101中具有良好的分离稳定性,而结构稳定性较差,而外源基因在毕赤酵母（GS115中很稳定。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因在毕赤酵母中的构建及其表达

目的在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT-6基因。方法以重组质粒pET23a-ESAT-6为模板,亚克隆目的片段ESAT-6至酵母菌分泌表达载体pPICZaA,重组质粒经线性化后电转化转染至毕赤酵母菌GS115菌株,经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达,取细胞裂解上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法分析。结果成功构建了pPICZaA-ESAT-6毕赤酵母表达重组质粒。经甲醇诱导,在酵母细胞内表达分子质量单位为18kDa的蛋白。蛋白质印迹（Western blot）显示,18kDa蛋白被活动性肺结核病人血清抗体识别。结论在毕赤酵母菌中成功表达了带有信号肽ESAT-6基因,为进一步研究新型单位疫苗打下坚实的基础。     

汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

目的：研究汉坦病毒G2膜蛋白基因在甲醇营养型巴斯德毕赤酵母中的克隆表达。方法：采用RT-PCR扩增G2基因，转化感受态大肠杆菌DH5α，DNA序列分析后，SnaBI、NotI两次酶切下G2，再连接到经同样酶切的pPIC9K表达载体上，构建表达载体pPIC9K-G2，SalI线形化后电转化导入毕赤酵母宿主菌GS115，G418筛选转化子，1％甲醇诱导、摇瓶培养。结果：序列分析表明，克隆序列与设计相符，12％SDS-PAGE显示重组蛋白为50KD，Western-Blot证实其生物学活性。结论：成功地在巴斯德毕赤酵母GS115中表达了汉坦病毒G2膜蛋白基因。     

肿瘤相关抗原17-1A在毕赤酵母中的表达与鉴定

目的利用Pichia pastoris酵母表达系统表达糖基化的肿瘤相关抗原17-1A,为进一步设计肿瘤蛋白疫苗提供研究基础。方法通过RT-PCR从小鼠肾组织中扩增17-1A的cDNA,将其定向克隆到pPICZαA质粒上,获得重组质粒pPICZαA-17-1A,测序正确后,重组质粒电转化到Pichia pastoris酵母菌株GS115中,在甲醇诱导下,利用其AOX I基因的α信号肽,分泌表达17-1A抗原糖蛋白,并对获得的蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果构建了pPICZαA-17-1A重组质粒,通过电转化将目的基因整合人酵母基因组中,重组毕赤酵母表达能够表达17-1A抗原并检测到抗原发生了糖基化。结论能够通过毕赤酵母表达系统稳定表达糖基化的肿瘤相关抗原17-1A。     

SARS冠状病毒N蛋白在酵母中的表达纯化及抗原性分析

目的研究人SARS冠状病毒核壳N蛋白在Pichia pastoris酵母中的表达,获得具有生物学活性的重组N蛋白,并鉴定表达蛋白的抗原性,为下一步的研究奠定基础.方法合成引物扩增SARS冠状病毒N基因,插入含AOX1启动子的Pichiapastoris酵母表达载体中,转化酵母宿主菌KM71H、X-33、GS115,筛选阳性转化子,摇瓶培养,用甲醇诱导表达.表达产物经镍离子柱亲和层析纯化后,以抗SARS冠状病毒N蛋白的小鼠单抗、兔多抗及SRAS病人阳性血清鉴定其抗原性.结果SDS-PAGE和免疫学分析显示,酵母转化子仅在KM71H、X-33中有Mr约70 000的诱导蛋白,表达产物具有良好的抗原性和特异性.结论在酵母表达系统中,初步实现了SARS冠状病毒核壳N蛋白的有效表达.     

恶性疟原虫3D7株主要裂殖子表面抗原C—末端基因的全合成及其表达

目的：在毕赤酵母表达系统中获得大量构象正确的3D7／MSP1－42重组蛋白进行疫苗有效性试验。方法：采用不对称PCR法拼接合成了3D7／mps1-42基因（1202bp),用电穿孔法将合成基因导入毕赤酵母并进行诱导表达,用免疫印迹法检测表达产物。结果：按毕赤酵母密码子使用频率重新设计并全合成了3D7/msp1-42基因序列,该合成基因在毕赤酵母系统（Pichia pastoris)中得到高水平分泌表达,产生全长重组蛋白。识别构象表位的特异性单克隆抗体能与该重组蛋白反应。结论：重新设计的基因能在毕赤酵母中高水平分泌表达,并产生构象正确的重组蛋白,从而解决了该天然基因在毕赤酵母中不表达的问题。     

毕赤酵母表达杀菌/渗透性增强蛋白N端片段

目的 探讨在毕赤酵母中进行杀菌／渗透性增强蛋白N端片段的分泌表达。方法从质粒pUCm-BPI上PCR扩增得到编码BPI氨基端196个氨基酸的基因片段(BPl588)。将该基因克隆到酵母表达载体Ppic9K上，使其准确融合于α交配因子分泌信号之后，电击转化毕赤酵母宿主菌GS115／His-。对酵母重组子的基因组DNA作PCR和总RNA作RT-PCR．分析。筛选出的转化子用甲醇作诱导物在29℃进行诱导后，分泌到培养基中的表达产物用于革兰氏阴性细菌E.coli JM109的抑菌实验。结果BP1588基因已整合到毕赤酵母染色体基因组中，并有转录产物mRNA的存在，表达产物能够抑制革兰氏阴性细菌的生长。结论利用毕赤酵母进行杀菌／渗透性增强蛋白N端片段的分泌表达是可行的。     

人CTLA-4胞外区cDNA毕赤酵母表达载体的构建及高拷贝稳定整合菌株的筛选

目的 构建人CTLA－4胞外区蛋白毕赤酵母分泌型表达载体，获得高拷贝稳定整合菌株，为大量获得人CTLA－4胞外区蛋白，进行功能研究及其临床应用奠定基础。方法 从活化人外周血淋巴细胞总RNA中，扩增人CTLA－4基因胞外区cDNA片段，将目的基因插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游，再插入高拷贝载体pPIC9K，得到pPIC9K-CTLA4,SaL I线性化后电转GS115；G418梯度筛选转化菌。PCR，Suthern blotting鉴定目的基因整合及拷贝数。结果 成功构建了人CTLA－4胞外区cDNA毕赤酵母表达载体，获得了高拷贝稳定整合菌株。结论 为表达人CTLA－4胞外区蛋白及其功能研究和临床应用奠定了基础。     

人α-防御素5在毕赤酵母中分泌表达的研究

目的 探索人α-防御素5成熟肽(mHD5)在酵母中高效分泌表达的可行性.方法 PCR扩增获得酵母菌偏好的mHD5密码子序列,应用基因重组方法构建表达质粒,电击转化酵母菌株GS115,应用G418浓度梯度、表型和PCR技术筛选高拷贝转化株.经摇瓶发酵和甲醇诱导,Tricine-SDS-PAGE分析重组mHD5(rmHD5)表达量,并采用Western blot鉴定.选用琼脂扩散法检测rmHD5的抑菌活性.结果 构建了pPIC9K-mHD5酵母表达质粒.筛选得到3株His /Mut 表型,且耐受8 mg/ml G418的多拷贝转化酵母菌株,成功获得表达量约120 mg/L的发酵上清.rmHD3对大肠杆菌(EC25922)和金黄色葡萄球菌(SA25923)2种标准菌株均具有明显的抑菌活性.结论 防御素基因可以在毕赤酵母中实现分泌型离表达,此策略可能是抗菌肽工业化开发的有效途径之一.     

SP-A1在甲醇酵母中的分泌表达及产物的鉴定

目的：研究人肺表面活性物质相关蛋白A1(SP-A1)在甲醇酵母Pichia pastoris(P．pastoris)中的分泌表达、产物的分离纯化及免疫活性测定。方法：将人SP-A1基因克隆至P.pastoris的分泌表达质粒pPIC9K上，获得重组表达质粒pPIC9K／SP-A，转化P.pastoris GS115、KM71。通过G418筛选获得高拷贝转化子(HIS4Mut^ )，在摇瓶中培养、甲醇诱导表达SP-A1，纯化目的蛋白，并免疫小鼠，ELISA法和western blotting分析SP-A1的免疫活性。结果：SDS-PAGE结果显示，在P.pastoris中经甲醇诱导，SP-A1获得表达，其表达量在上清中为200mg／L。经过纯化可获得纯度达95％以上的蛋白质。ELISA法和western blotting结果表明，目的蛋白可被多克隆抗体识别。可刺激小鼠产生抗体。结论：人组织特异性蛋白SP-A1可在P.pastoris中表达，表达产物具有免疫原性。     

Neuritin在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

目的：构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统,为进一步探讨Neuritin的生物学功能及作用机制奠定基础。方法和结果：在巳克隆Neuritin cDNA的基础上,PCR扩增出Neuritin ORF与载体pPIC9k重组,然后利用电击转化将重组质粒pPIC9k—Neuritin导入GSll5酵母菌株。筛选出阳性克隆经PCR及测序正确后,用甲醇诱导Neuritin分泌表达;表达产物经SDS—PAGE及Western—blot鉴定。结论：成功构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统。     

重组融合蛋白rTMP-GH在巴斯德毕赤酵母中表达的研究

目的 实现TPO模拟肽(thrombopoietin mimetic peptide,TMP)与人生长激素(human growth hormone,hGH)的重组融合蛋白rTMP-GH在巴氏毕赤酵母中的高效表达.方法 以含有rTMP-GH核苷酸序列的原核质粒为模板,PCR方法获得rTMP-GH的编码序列,并亚克降至载体pPIC9K中,将所构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒转化酵母宿主细胞GS115,MD/MM平板及G418抗性筛选高表达株,然后进行试管补料分批表达,Western blot对表达产物进行鉴定,通过巨核细胞集落形成能力对其,圭物学活性进行初步检测.结果 成功构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒,筛选到高表达rTMP-GH重组融合蛋白的巴氏毕赤酵母细胞株,初步证实所表达产物具有刺激巨核细胞集落形成的能力.结论 成功实现了rTMP-GH融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的高效表达.     

SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的：构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法： 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1＋SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9＋SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果： 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论： SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.     

HPV16L1重组蛋白在甲醇营养型酵母菌中的诱导表达及鉴定

目的 ＨＰＶ１６Ｌ１重组蛋白的表达为研制ＨＰＶ１６Ｌ１预防性蛋白疫苗及诊断试剂盒打下基础。方法 ｐＰＬＣ３．５－ＨＰＶ;１６Ｌ１／ＧＳ１１５阳笥菌株,经０．５％甲醇诱导,运用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测Ｌ１蛋白;用鼠抗ＨＰＶ１６Ｌ１单克隆抗体,经Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测蛋白的特异笥;在透射电下观察类病毒颗粒（ＶＬＰｓ）结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测结果表明,在５５ＫＤ处有诱导蛋白带的出现;经Ｗ     

IL-18在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:探索人IL-18成熟蛋白(mhIL-18)在毕赤酵母中的高效表达. 方法:采用SOEing及不对称PCR方法扩增出mhIL-18基因并构建融合型表达载体pPIC9-IL-18-Intein,转化入毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,运用SDS-PAGE和Western Blot分析重组蛋白的表达,并经亲和层析后用MTT法检测表达的mhIL-18生物活性. 结果:成功构建载体并转化入毕赤酵母,经甲醇诱导,重组的GS115可分泌mhIL-18,其表达在96 h时达高峰,分泌量可达100 mg/L. 亲和层析后的mhIL-18纯度可达95%,并具有显著的IL-18的生物学活性. 结论:在毕赤酵母中成功表达具有显著生物学活性的mhIL-18.     

人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定

目的在毕赤酵母中高效分泌表达人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白.方法利用PCR技术获得HSA和PTH(1-34)基因,以柔性连接肽相连插入到表达载体pPIC9,重组质粒线性化后,用化学法转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷型培养板和PCR鉴定筛选得到转化子.在启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白HSA-PTH(1-34).PCR法和电泳鉴定表达验证阳性转化子,并观测不同时间点的表达量.Western blot验证其免疫活性,在兔肾皮质细胞膜中测定腺苷酸环化酶的激活产生cAMP的量来检测融合蛋白的生物学活性.结果PCR鉴定重组转化子验证了融合基因的成功整合,用甲醇诱导表达,蛋白电泳分析表明融合基因得到高效表达,HSA-PTH(1-34)同时具有HSA和PTH(1-34)的抗原性,且能激活兔肾皮质细胞中的腺苷酸环化酶产生cAMP,但活性低于PTH(1-34).结论在毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白.