酵母双杂交技术筛选并回转验证在胞内与PML-C结构域相互作用的蛋白

目的 利用酵母双杂交技术在活细胞内筛选并回转验证与PML-C结构域相互作用的蛋白质.方法 通过诱饵质粒pGBKT7-PML-C,利用酵母双杂交系统从白血病细胞cDNA文库中筛选与PML-C结构域相互作用的蛋白质.结果 利用酵母双杂交技术筛选到43个能与PML-C结构域相互作用的克隆;经进一步的归类与酵母回转试验得到9个阳性克隆.结论 在细胞内PML-C结构域能与多种蛋白质有相互作用.中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)介导的急性早幼粒细胞白血病的发生可能与这些相互作用所致的生物学功能改变有关.     

应用酵母双杂交技术筛选与乙型肝炎病毒x抗原结合蛋白1结合的肝细胞蛋白编码基因

目的:构建乙型肝炎病毒x抗原结合蛋白1(XBP1)的真核表达载体并筛选人肝细胞中与XBP1相互作用的基因。方法:通过PCR扩增获得XBP1基因,构建真核表达载体pGBKT7-XBP1,转化酵母菌AH109并在其中进行表达。随后与预转化了人肝细胞文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-β-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行双重筛选获得阳性克隆。提取文库质粒pACT2-DNA并与pGBKT7-XBP1共同转化AH109酵母菌株,于铺有X-β-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行筛选以排除假阳性克隆。挑取真阳性克隆送测序,并进行生物信息学分析。结果:筛选出20种与XBP1相互作用的蛋白,其中包括金属硫蛋白,平滑肌细胞相关蛋白,去唾液酸糖蛋白受体,丙酮酸脱氢酶激酶1,甜菜碱甲基转移酶,视黄醇结合蛋白,补体因子B、人补体C9,转化生长因子β1,丝氨酸蛋白酶抑制剂;cAMP应答元件结合蛋白,拓扑异构酶IIβ等已知功能基因及1个未知功能序列。结论:筛选到多种XBP1相互作用的基因,包括与细胞内结构、细胞生长相关蛋白基因,参与细胞内代谢的蛋白基因,参与信号转导途径、免疫及其他相关蛋白基因,参与DNA的复制、转录、重组、修复的基因。     

酵母双杂交体系一种研究蛋白—蛋白相互作用的强有力方法

双杂交体系是研究蛋白－蛋白相互作用的一种有效方法。将相互作用的两个蛋白分别与转录因子的ＤＮＡ结合结构域和转录激活结构融合成两个杂交体，在酵母细胞内，通过报告基因的表达情况反反映两蛋白之间的相互作用。其主要特点是操作简单，可以研究蛋白间弱相互作用，通用筛库可直接得到与目的蛋白相互作用蛋白的ＤＮＡ序列，用双杂交体系筛库时最值得注意的是假阳性问题。     

应用酵母双杂交系统筛选E2F1相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交系统从人正常胃黏膜细胞的cDNA文库中筛选E2F1转录因子的相互作用蛋白。方法:以pGBKT7-E2F1为诱饵质粒筛选人正常胃黏膜细胞的cDNA文库,得到阳性克隆,反复验证,并对验证后的阳性克隆进行测序及同源性分析。结果:从人正常胃黏膜细胞的cDNA文库中筛选得到20个阳性克隆,经测序和同源性分析,筛除假阳性克隆,最终得到18个不同的候选基因序列。其中,17个为可知基因序列,它们分别是:组织蛋白酶B、SIVA1、干扰素调节因子7、鸟苷酸激酶1、ATP酶抑制因子1、核糖体蛋白SA、纤溶酶原激活物抑制剂1 mRNA结合蛋白、精氨琥珀酸合酶1、卵泡抑素类似物3、金属硫蛋白2A、内质网钙结合蛋白1、WNT1可诱导信号通路蛋白2、CDC42 效应蛋白1、可溶性半乳糖凝集素结合蛋白1、中胚层发育候选2、外切酶体成分7和含EGF腓骨蛋白样胞外基质蛋白 1,尚有一未知基因片段。结论:应用酵母双杂交系统成功筛选出18种E2F1相互作用蛋白,为进一步探讨E2F1影响胃癌细胞生物学行为的分子机制奠定了基础。     

酵母双杂交筛选与转录因子ZNF580相互作用的蛋白

目的: 寻找可能与锌指转录因子ZNF580存在相互作用的蛋白。方法: 以ZNF580基因开放阅读框作为模版,PCR扩增后连接入酵母表达质粒pGB。诱饵质粒pGB-ZNF580经测序验证后转化酵母菌株Y190,人胎脑cDNA文库亦转化到能稳定表达诱饵蛋白的Y190酵母菌株中,并铺到含有营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-His/-Leu)的培养皿上进行初步筛选。所得阳性克隆再进行β-半乳糖苷酶克隆转移滤纸实验进一步去除假阳性。随机挑取部分阳性克隆,逐一转化入含有诱饵质粒的Y190 酵母菌进行一对一验证。分离阳性克隆质粒测序,并应用生物信息学方法分析阳性克隆cDNA编码的蛋白。结果: 确定了14种与ZNF580可能存在相互作用的蛋白。结论: 初步探讨了ZNF580的功能及其可能参与的信号转导通路,为进一步研究转录因子ZNF580参与动脉粥样硬化的机制奠定了实验基础。     

应用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Pkmyt1相互作用的候选分子

目的蛋白激酶Pkmyt1负调控小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的进程,但具体调控机制还不清楚。因此,利用酵母双杂交系统从人卵巢c DNA文库中筛选与Pkmyt1相互作用的候选蛋白,为研究Pkmyt1调控小鼠受精卵早期发育提供新线索。方法以小鼠卵巢组织c DNA为模板,构建p GBKT7-Pkmyt1诱饵质粒,转化酵母感受态细胞后,分别接种于SD/-Trp(SDO)、SD/-Trp/X-α-Gal(SDO/X)和SD/-Trp/X-α-Gal/Ab A plates(SDO/X/A)培养板,检测其对酵母的毒性和自身激活能力,Western blotting法检测p GBKT7-Pkmyt1在酵母细胞中的表达。将人卵巢c DNA文库与含有p GBKT7-Pkmyt1的酵母感受态细胞融合,PCR筛选出阳性克隆,提取质粒,测序鉴定,再次检测其对酵母自激活能力,利用生物信息学分析筛选蛋白与胚胎发育的关系。结果酶切鉴定和Blast分析表明p GBKT7-Pkmyt1质粒构建成功。将该质粒转入Y2H golden中,在SDO板上克隆均匀生长,在SDO/X/A平皿上无克隆生长,Western blotting检测Pkmyt1在酵母细胞中有表达。PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段。通过初步筛选得到182种能够与Pkmyt1相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证有46个与Pkmyt1之间存在相互作用的蛋白。结论通过筛选发现46个蛋白可能通过与Pkmyt1相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育。     

应用酵母双杂交技术筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白

目的: 应用酵母双杂交技术筛选小鼠巨噬细胞中与核因子κB受体激活因子(RANK)蛋白上新基序IVVY相互作用的蛋白,以探寻RANKL/RANK系统中介导破骨细胞形成的RANK下游新信号转导蛋白。方法: 应用GAL4酵母双杂交系统3,构建仅包含编码新基序⁵³⁵IVVY⁵³⁸ 的一小段RANK的cDNA片段为诱饵质粒pGBKT7-IVVY,并与巨噬细胞cDNA文库质粒pGADT7-library共转化AH109酵母,筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白,通过回复性杂交实验验证其可靠性,并对阳性克隆进行测序和基因同源性分析。结果: 筛选出4个可能与IVVY基序有相互作用的蛋白,包括Ring1和YY1结合蛋白(RYBP)、ATP结合盒、E2F转录因子和热休克蛋白8,其中表达RYBP的阳性克隆出现频率高、速度快。结论: 应用酵母双杂交技术成功地筛选出4个可能与IVVY基序相互作用的候选蛋白,其中RYBP可能性最大。     

PTA1酵母双杂交载体的构建

血小板／Ｔ细胞活化抗原１（ｐｌａｔｅｌｅｔａｎｄＴｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎｌ,ＰＴＡ１）是一种表达于活化Ｔ细胞、ＮＫ细胞及血小板表面的白细胞分化抗原和粘附分子,于１９９７年将其基因克隆成功〔１〕,又被称为ＤＮＡＸ辅助分子１（ＤＮＡＸａｃｃｅｓｓｏｒｙｍｏｌｅｃｕｌｅ１,ＤＮＡＭ１）〔２〕。ＰＴＡ１参与血小板的活化和混合淋巴细胞反应中杀伤性Ｔ细胞的诱导。序列分析表明,ＰＴＡ１是一种穿膜糖蛋白,全长３１８ａａ。其中胞膜外区２３２ａａ,包括信号肽和２个Ｉｇ样结构域,穿膜区２５ａａ…     

酵母双杂交系统筛选CLN8P相互作用蛋白

目的：应用酵母双杂交系统筛选CLN8P相互作用蛋白质,通过对相互作用蛋白质的筛选及研究,探讨CLN8的功能,为NCL8和NCLs疾病群的发病机制研究提供线索,并为疾病的蛋白质相互作用网络提供资料。方法 应用酵母双杂交技术,以pLexA-CLN8为诱饵质粒筛选人胎脑cDNA文库,得到Leu+LacZ+阳性克隆,进一步进行验证,并对验证后的阳性克隆的外源性片断进行测序及同源性分析。结果 从人胎脑cDNA文库中筛选得到60个Leu+LacZ+阳性克隆;将获得的具有外源性片段的文库质粒与诱饵质粒一对一重新转入酵母体内对相互作用进行验证,共获得阳性克隆22个;对验证后阳性克隆测序并进行同源性分析,共获得不同的候选基因序列10个。结论 应用酵母双杂交系统,共筛选得到10个不同的基因,其编码蛋白与CLN8P有相互作用,可能与NCLs 发病机制相关。     

利用酵母双杂交技术筛选与NMDA受体亚型NR2D相互作用的蛋白质

目的利用酵母双杂交技术,寻找可能与谷氨酸受体亚型NR2D存在相互作用的蛋白,为探讨NR2D蛋白在神经系统退行性改变中的作用提供依据。方法应用Clontech GAL4酵母双杂交系统,构建包含NR2D细胞内C末端的c DNA片段为诱饵质粒,筛选人脑c DNA文库;随机挑取部分阳性克隆,通过回复性杂交实验验证其可靠性,分离阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果筛选出6种与NR2D可能存在相互作用的蛋白,包括神经细胞膜糖蛋白(Glycoprotein M6B,GPM6B)、精脒/精胺N1-乙酰基转移酶1(Spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1,SAT1)、乳酸脱氢酶B(Lactate dehydrogenase B,LDHB)、α-突触核蛋白(α-synuclein,SNCA)、淀粉样蛋白β前体蛋白结合家族B成员1和2(Amyloid beta(A4)precursor protein-binding,family B,member1(Fe65),APBB1;Amyloid beta(A4)precursor protein-binding,family B,member 2,APBB2。结论初步探讨了NR2D蛋白的功能及与其可能发生互作的蛋白,为进一步研究谷氨酸的兴奋性毒性参与神经系统退行性改变的机制奠定了实验基础。     

Phage display based cloning of proteins interacting with the cytoplasmic tail of membrane immunoglobulins

The reduced quantity and quality of serum immunoglobulins (sIgs) in mutant mice expressing truncated cytoplasmic tails of IgE and IgG1 indicate an active role for the cytoplasmic domains of mIgG1 and mIgE. We used phage display technology to identify candidate proteins able to interact with the cytoplasmic tail of mIgE. Using a murine cDNA B cell library displayed on the surface of phage as prey and the 28 amino acid long cytoplasmic tail of IgE as bait, we isolated phage encoding the murine hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1). Surface plasmon resonance analysis measurements confirmed affinity of HPK1 to the mIgE cytoplasmic tail and revealed association to other immunoglobulin isotypes as well. Immunoprecipitation experiments, using lysates from two B cell lines expressing nitrophenyl (NP) specific mIgE molecules showed co-precipitation of IgE and HPK1. The interaction of HPK1 with the cytoplasmic domains of membrane immunoglobulins indicate an active role of the tails as part of an isotype specific signal transduction, independent from the Igalpha/Igbeta heterodimers, and may represent a missing link to upstream regulatory elements of HPK1 activation.     

Screening of APP interaction proteins by DUALmembrane yeast two-hybrid system

Alzheimer’s disease (AD) is one of the most common forms of neurodegenerative disease. There is a growing interest in the amyloid precursor protein (APP) over the years due to its involvement in AD. Besides its role in pathological mechanisms of AD, APP participates in many signaling pathways as well. APP functions through protein-protein interactions, and in this report staufen 1 (STAU1) is demonstrated to have interaction with APP, using yeast two-hybrid screening and co-immunoprecipitation in mammalian system. STAU1 belongs to the double-stranded RNA binding protein family and can mediate mRNA degradation in mammalian system, implicating that APP may be involved in the regulation of mRNA as well.     

可卡因苯丙胺调节转录肽相互作用蛋白的筛选

目的寻找可卡因苯丙胺调节转录肽(CART)受体或与其相互作用的蛋白。方法建立大鼠脑cDNA文库,以CART为诱饵,应用细菌双杂交方法筛选与CART相互作用的蛋白。结果成功构建大鼠脑pTRG-cDNA文库及诱饵质粒pBT-CART41-102。文库容量为3.37×106,重组率98.5%。筛选约5.01×106个共转化克隆,证实为阳性克隆93个,全部DNA测序。经生物信息学方法分析得到stathm in等6个可能与CART相互作用的蛋白,并得到可能与CART相互作用的未知新蛋白,它们与22个已知膜蛋白或受体有短的极相似片段。结论CART可能与stathmin等6个已知蛋白相互作用,并可能与一些未知蛋白相互作用,这些未知蛋白与22个膜蛋白或受体有短的相似保守结构。     

Identification of cellular membrane proteins interacting with hepatitis B surface antigen using yeast split-ubiquitin system

Hepatitis B surface antigen (HBsAg) is the major component of the envelope of hepatitis B virus (HBV). As a resident membrane protein in the endoplasmic reticulum, it plays a key role in the viral morphogenesis. Little is known about cellular proteins that interact with HBsAg and thereby contributing to HBV morphogenesis. Using the yeast split-ubiquitin system, a number of cellular membrane proteins have been isolated in this study. These include a resident protein of endoplasmic reticulum (thioredoxin-related transmembrane protein 2), an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis and HIV-mediated downregulation of CD4, and a co-receptor of coxsakie B virus. The significance of our findings is suggested by the identification of cellular membrane proteins interacting with other virus proteins. Further functional analysis of these HBsAg- interacting cellular membrane proteins should shed new insights on their role in HBV morphogenesis.