环介导等温扩增技术在疾控机构微生物检测中的应用

环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术,具有特异性强、灵敏度高、快速简便等优点.本文综述了近年来LAMP在微生物检测领域的具体应用实例和研究进展,并对其应用前景做了展望.     

环介导等温扩增技术在寄生虫检测中的应用研究

随着分子生物学技术的快速发展,以检测核酸为基础的分子生物学技术如PCR、再生式序列复制以及链置换扩增技术等广泛应用于医学和生物学等领域,在病原体的检测以及疾病诊断方面发挥着重     

环介导等温扩增技术在检测痰标本结核分枝杆菌中的应用

目的评价结核分枝杆菌环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测试剂盒的临床应用效果。方法选取肺结核患者183例（肺结核组）和非肺结核患者120例（对照组）。采用涂片抗酸染色、罗氏培养法和LAMP对痰标本进行检测,采用结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测试剂盒（TB- PCR）检测罗氏培养与LAMP结果不符的标本,分析LAMP与罗氏培养的检出率及两者的符合率。结果去除经鉴定为非结核分枝杆菌的10例标本,涂片抗酸染色、罗氏培养法和LAMP的阳性检出率分为64.1%（111/173）、64.7%（112/173）、78.6%（136/173）。LAMP与抗酸染色、罗氏培养阳性检出率的差异有统计学意义（P＜0.01）,抗酸染色与罗氏培养比较差异无统计学意义（P＞0.05）。以罗氏培养为金标准,LAMP检测的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为88.5%（108/122）、82.3%（149/181）、77.1%（108/140）、91.4%（149/163）,LAMP检测与罗氏培养的符合率为84.8%（257/303）。结论结核分枝杆菌环介导等温扩增技术的灵敏度和特异度高,具有简单易行、快速准确的特点,在肺结核患者的早期诊断中将发挥重要作用。     

环介导等温扩增技术的研究进展和微生物检测应用

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新型的核酸扩增技术。本文概述其反应原理、技术特点、相关技术、微生物检测应用及发展前景。     

环介导等温扩增技术及其应用

环介导等温扩增法（LAMP）是一种新的核酸扩增法.该方法在一定温度下一步即可完成扩增反应.由于其扩增效率极高、反应简单快速、高特异性和反应结果只需肉眼观察的特点,LAMP法已广泛应用于病毒、细菌等的定性定量检测和临床疾病的诊断.本文介绍了LAMP方法的原理及其在微生物分子检测方面的应用.     

环介导等温扩增技术在诊断结核病中的研究进展

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术是利用两对特殊设计的引物和链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下对目的片段进行特异、高效扩增的技术。LAMP技术具有简单、快速、特异、灵敏、经济等优点,因此在结核分枝杆菌的现场快速检测和基层应用中具有广阔前景。基于此,本文主要阐述了LAMP 技术的基本原理和特点、诊断结核病的主要分子标志物,以及利用不同的分子标志物和各种类型的新型技术在诊断肺结核、肺外结核、耐药性结核病中的应用。LAMP 技术在诊断结核病中已经得到了广泛的应用,且具有较高的灵敏性和特异性,但该技术仍存在部分缺陷。本文综述了近年来LAMP 技术在结核病中的应用进展,并对其发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为结核病的快速诊断提供合理的研究方向。     

寄生虫病环介导等温扩增技术研究进展

<正>寄生虫病在人类传染病中有着非常重要的影响。及时有效的寄生虫病诊断是疾病防治的首要环节。寄生虫病检测手段有病原学、免疫学和分子生物学等。病原学检查是常用的确诊方法,但易导致漏诊或误诊。免疫学检测在敏感性、特异性方面比病原学法有所提高,但却存在交叉反应、不能区分现症患者或既往感染等问题。分子生物学方法在寄生虫病检测中敏感性和特异性比前两者更高,同时也存在着一些不足,如操作繁琐、仪器昂贵、扩增耗时     

荧光定量环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫方法的研究

目的建立一种简便、快速和高灵敏度的恶性疟原虫的荧光定量环介导等温扩增检测方法。方法针对恶性疟原虫环子孢子蛋白（CSP）种属特异性基因保守区域8个位点设计3对引物,同时使用PCR法扩增恶性疟原虫219bp保守序列,经克隆后转化入工程菌株JM109感受态细胞中并提取重组质粒作为模板。以探索建立恶性疟原虫荧光定量环介导等温扩增检测技术,并对其试验重复性、灵敏度、特异性及适用性子以评估。结果在重组质粒浓度为1．06×10^4∽10^9拷贝／反应的范围内,标准曲线循环阈值与模板浓度有良好线性关系（相关系数0．9995）,CT值变异系数为6．29％,无非特异性扩增,初步临床试验结果表明,试验的灵敏度为90．00％,特异度为93．33％,准确性为91．67％,试验可在30min内完成。结论荧光定量环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫简便、快速、敏感,具有广阔的应用前景。     

环介导等温扩增技术检测间日疟原虫方法的建立及应用分析

目的建立一种快速、简便的检测间日疟原虫的环介导等温扩增方法(LAMP)并与常规PCR方法作比较。方法根据间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因序列合成2对特异性LAMP引物,优化Mg2+浓度、dNTPs浓度、BstDNA聚合酶添加量、反应温度、时间以及设计引物缺省试验。评估优化后的LAMP反应的特异性和灵敏性。检测133份患者血样,以显微镜检方法为金标准,比较LAMP和多重PCR法检测间日疟原虫的敏感性和特异性。结果 LAMP法检测重组质粒DNA(Pv-rDNA)的灵敏度达到10-10,为传统PCR方法的100倍。镜检确诊的68例间日疟、43例恶性疟和22例非疟疾患者中,LAMP法和多重PCR检测间日疟原虫的敏感性为98.53%和97.06%,两法基本相当(χ2=0.34,P>0.05);特异性为86.15%和100%,LAMP法低于多重PCR法,差异有统计学意义(χ2=9.67,P<0.05)。LAMP法的阳性预测值和阴性预测值分别为88.16%和98.25%,多重PCR的阳性预测值和阴性预测值分别为100%和97.01%。结论 LAMP法检测间日疟原虫具有快速简便、敏感性高、设备要求低的特点,具有较好的应用前景。     

环介导等温扩增技术对结核分枝杆菌检测的临床应用价值

目的评估环介导等温扩增技术(LAMP)对肺结核的诊断价值。方法回顾性分析2017年4月至2018年9月郑州大学第一附属医院进行LAMP检测的413例患者,其中LAMP检测标本情况为肺泡灌洗液266例、痰标本147例。根据临床诊断情况将患者分为肺结核病组和非肺结核病组。将患者抗结核治疗前的LAMP结果与最终临床诊断及痰涂片结果进行比较,评价其敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比及阴性似然比。应用χ~2检验对肺结核患者肺泡灌洗液及痰标本的阳性率差异进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果 413例中119例(28.8%)为临床诊断的肺结核病患者,其中65例LAMP阳性,LAMP的综合敏感度为54.6%(65/119)。294例(71.2%)为非肺结核病患者,其中276例LAMP检测结果为阴性,特异度为93.9%(276/294),阳性预测值为78.3%(65/83),阴性预测值为83.6%(276/330),阳性似然比为11.42,阴性似然比为0.32。LAMP在痰涂片阳性标本中的敏感度为95.2%,在痰涂片阴性标本中的敏感度为45.9%,特异度为93.9%。在临床诊断肺结核患者中肺泡灌洗液标本和痰标本中LAMP的阳性率分别为63.2%(48/76)和39.5%(17/43)(χ~2=6.183,P<0.05)。结论 LAMP检测痰标本和肺泡灌洗液标本中的结核分枝杆菌用于结核病诊断具有良好的特异度。在临床诊断的肺结核患者中,LAMP对肺泡灌洗液标本检出的阳性率高于痰标本。     

环介导等温扩增法鉴定检测冬虫夏草

目的 建立冬虫夏草的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法,实现对冬虫夏草的快速检测。方法 针对冬虫夏草的CS2 serine protease (csp2)基因设计LAMP内外引物对;利用CTAB法提取冬虫夏草DNA;优化扩增反应条件;采用包括冬虫夏草在内的6种不同虫草进行LAMP扩增,并对阳性产物酶切鉴定以检测其特异性,通过对模板DNA的10倍梯度稀释检测其灵敏度;紫外灯下观察凝胶电泳或加入荧光染料SYBR Green I的扩增产物。结果 设计的LAMP引物可以特异地针对冬虫夏草的csp2基因进行LAMP扩增,产物可被限制性内切酶Taq1酶切,且有较高的灵敏度,检出限达6 pg/mL。结论 LAMP法可以实现对冬虫夏草的快速鉴定检测,在中药鉴定中有着广阔的应用前景。     

环介导等温扩增在检测肺炎支原体中的临床应用

目的 探讨一步法可视化环介导等温扩增(LAMP)在检测肺炎支原体中的临床应用价值。方法 用一步法可视化LAMP、聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)同时检测108份儿童支原体肺炎临床标本。 随机选取临床儿科住院患儿108例标本,包括以PCR法诊断肺炎支原体感染患儿73例和临床排除支原体肺炎的其他慢、急性呼吸道感染者35例,于入院的第1天分别采用LAMP、PCR和ELISA法检测同一患者咽拭子标本和血清标本,并分别计算Kappa统计量,评价LAMP 法与PCR法、LAMP 法与ELISA法的一致性。入院第5天重新采集40例患者的样本,用3种方法比较入院第1和5天的检测结果。结果 一步法可视化LAMP方法的敏感度为100%,特异度为94.3%;ELISA法的敏感度为65.8%,特异度为82.9%。一步法可视化LAMP方法与PCR法的Kappa值为0.956;与ELISA法比较,Kappa值为0.38。一步法可视化LAMP方法在第1天就检出阳性的标本例数比ELISA法高。结论 一步法可视化LAMP技术有高敏感度和特异度,在感染早期就可以检测出肺炎支原体。LAMP法与PCR法具有可比性,可用于肺炎支原体的检测。     

环介导等温扩增技术在寄生虫分子诊断、检测中的应用

环介导等温扩增技术应用4条不同的引物特异地识别目标基因上的6段区域,在一个恒温的环境中进行链置换反应,是一种简单、快速、特异、敏感并且低成本的对已知基因的检测方法.本文就环介导等温扩增技术的原理及其在寄生虫分子诊断和检测中的应用作一综述.     

利用环介导等温扩增技术检测西尼罗病毒

目的 建立一种早期快速检测西尼罗病毒的方法。方法 以人工合成西尼罗病毒基因(1 021~1 240,NY99)作为模板,利用环介导等温扩增技术(LAMP)原理,设计合成3套6对引物,特异性识别人工合成西尼罗病毒基因的8个位点,在恒温63℃ 60 min条件下扩增,80℃ 2 min终止反应,通过realtime PCR仪实时监测反应过程,最终产物经凝胶电泳观察。同时将该方法的灵敏度及特异性与常规PCR进行比较。结果 LAMP反应在20 min内即可完成,最终产物经电泳观察可见大小片段不等的呈梯度扩增条带, 而同为黄病毒属的登革热病毒、流行性乙型脑炎病毒及阴性对照等均无扩增。灵敏性是常规PCR的10倍,可以检测到9.23 copies/μl的病毒。结论 该方法具有灵敏、特异、快速、简便、成本低等优点,适合基层和现场检测使用,对西尼罗病的早期诊断和流行病学筛查具有重要意义。     

环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌的研究

用环介导等温扩增技术(LAMP)快速、灵敏地检测铜绿假单胞菌.利用铜绿假单胞菌gbca基因,特异性设计3对LAMP引物,在反应体系中添加羟基萘酚蓝(HNB)荧光染料,通过反应前后颜色的变化肉眼观察结果,并用琼脂糖凝胶电泳加以验证.对临床标本利用LAMP和PCR法平行检测,验证该法灵敏度、特异性.针对铜绿假单胞菌DNA特异性引物的LAMP法可以扩增,其他无扩增产物.本实验建立的LAMP法具备简便、快速、特异性强和灵敏度高的特点,适于实际应用.     

改良环介导等温扩增技术在疟原虫耐药基因SNP检测中的价值及可行性

目的 探讨改良环介导等温扩增技术(LAMP)对常见药物抗性基因SNP的检测价值及可能性.方法 采集非洲赤道几内亚马拉博地区医院提供的500例当地疟疾患者的外周血液样本,以巢式PCR为金标准,比较改良环介导等温扩增技术与其在恶性疟原虫耐药基因SNP检测中的反应效率、敏感性及特异性.结果 对照金标准巢式PCR方法,对500例患者进行检测,两种方法的检测符合率为96.4%,差异无统计学意义(P>0.05).检测效率比较显示,通过与金标准进行比较,改良LAMP的初反应时间较快,在10 min内即起跳并迅速达到阳性反应阈值,而巢式PCR扩增效率相对较低,明显落后于改良LAMP(q浑浊度=6.492,P<0.001;q反应速率=0.931,P=0.079);敏感性比较显示,改良LAMP扩增的阳性反应阈值较巢式PCR出现得早,并且随着时间推移,反应扩增量逐渐增加,在反应的20 min内,改良LAMP反应起跳时间较早(q浑浊度=20.171,P<0.001;q反应速率=0.326,P=0.674);特异性比较显示,改良LAMP对四种疟原虫均有较好的特异性,无论是起跳时间、扩增产物速率均优于巢式PCR(q浑浊度=18.619,P<0.001;q反应速率=1.927,P=0.073).结论 改良环介导等温扩增技术具有较好的反应速率、特异性及敏感性,操作简便、诊断效率高,值得推广.     

环介导等温扩增技术检测炭疽芽孢杆菌的研究

目的 建立环介导等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification, LAMP)检测炭疽芽孢杆菌。方法 应用Primer Explorer V5软件设计针对炭疽杆菌的保守区引物,建立LAMP检测方法,检测其特异度和灵敏度,并与荧光定量PCR法进行比较。采用荧光定量PCR法、LAMP和细菌培养鉴定,对45份炭疽疫情标本进行检测。结果 LAMP、荧光定量PCR法和细菌培养鉴定的检测结果差异无统计学意义(χ²=3.202,P=0.229)。LAMP扩增产物通过紫外凝胶成像系统显示,炭疽芽孢杆菌强毒株和弱毒株均呈现特异性梯状条带,而其他菌株如痢疾志贺菌、肠炎沙门杆菌和金黄色葡萄球菌等菌株电泳均无条带,扩增结果为阴性。LAMP与荧光定量PCR法检测炭疽芽孢杆菌的检测限均为4.0×10²CFU/ml。结论 LAMP使用恒温水浴箱进行等温扩增,反应结束后可在可见光或紫外灯下肉眼观察结果。LAMP灵敏特异,简单快速,无需特殊仪器,可广泛用于基层实验室甚至疫情现场。     

环介导等温扩增技术检测福氏志贺菌的实验研究

目的：了解并建立福氏志贺菌的快速、特异的环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测方法,探讨快速、简便、有效的消化道传播性病原体的临床诊断、饮水检测和环境卫生监测等检测手段。方法对福氏志贺菌进行细菌培养,然后使用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）和LAMP技术设计4条特异性引物,以及使用克隆等分子生物学方法进行DNA提取,然后对PCR方法与LAMP方法进行对比分析。结果LAMP扩增具有非常高的特异性,几乎不会产生非特异性扩增;与PCR方法相比,LAMP检测限更低,仅为5个拷贝;LAMP在等温条件下扩增,不会因温度改变而造成时间的损失,在1h内可将靶序列扩增至109～1010倍,并且不需要模板的热变性。结论 LAMP技术具有特异敏感简单的特点,不需要特殊的仪器,在65℃时1 h即可完成反应,同时检测结果可直接通过肉眼或加入荧光染料即可判断。     

环介导等温扩增技术的研究进展

<正>随着检验医学的发展,一些分子生物学技术,如PCR[1]、链置换扩增(strand displacement amplifica-tion,SDA)[2]、依赖核酸序列扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)及再生式序列复制反应(self-sustained sequence replication reaction,3SR)[3]、等,在医学检验与诊断方面发挥了重要的作用。     

基于环介导等温扩增技术快速鉴定宽体金线蛭

[目的] 建立中药材宽体金线蛭的环介导等温扩增（LAMP）检测技术,实现对宽体金线蛭及其常见混伪品的快速检测。[方法] 针对宽体金线蛭线粒体细胞色素氧化酶I（COI）的基因序列设计LAMP引物。在64℃恒温条件下,用设计的LAMP引物组对水蛭进行LAMP扩增。[结果] LAMP反应结束后,宽体金线蛭均扩增出梯状条带,对照组无条带产生。加入0.2 μL荧光染料10 000×SYBR Green Ⅰ后,宽体金线蛭反应液在自然光下呈绿色（阳性）,对照组呈橙色（阴性）。将加入了0.2μL 10 000×SYBR Green Ⅰ的扩增产物置于紫外灯下观察,结果宽体金线蛭在紫外光下呈绿色荧光（阳性）,对照组无绿色荧光产生（阴性）。[结论] 利用LAMP技术可实现宽体金线蛭及其常见混伪品的快速鉴别,为水蛭中药材的现场鉴别提供技术支撑。