基因捕获联合高通量测序技术在甲基丙二酸血症诊断中的应用

目的 探讨新一代基因测序平台(HiSeq2000)在甲基丙二酸血症(MMA)诊断中的价值.方法 1.采集已经临床确诊的9例MMA患儿外周血并提取DNA,将设计好的基因捕获探针与患儿DNA文库混合,然后利用基因捕获联合高通量测序分析技术对有机酸代谢相关的48个基因全部外显子区域进行测序.2.获得原始数据,去除接头和过滤低质量数据,对数据进行SNP、InDel等分析,并采用Sanger测序方法对异常位点进行测序验证.3.气相色谱-质谱联用分析技术对尿液标本的有机酸测定及其他辅助检查.结果 1.突变基因:7例存在MMACHC基因突变,7例患儿中共检测出7种突变,包括c.482G＞A、c.567_568insT、c.609G＞A、c.440_ 441del、c.80A＞G、c.315C＞G、c.90G＞A,其中c.440_441 del为未见报道突变;1例存在甲基丙二酰辅酶A变位酶(MUT)基因突变,均为内含子异常,分别是c.754-1G＞C、c.1677-1G＞A,其中c.754-1G＞C为未见报道突变;1例未检测到突变.2.临床症状:9例患儿均存在智力运动发育迟缓,伴抽搐3例,反复顽固性代谢性酸中毒、头痛及面瘫、反复性溶血各1例.脑电图异常9例,头颅磁共振异常8例,尿液中甲基丙二酸水平均升高(273.4 ～146 022.8倍),血同型半胱氨酸水平增高8例(27.13～ 396.84 μmol/L,正常＜20 μmol/L).3.Sanger测序验证:均符合新一代测序平台结果,无假阳性存在.结论 1.进一步证明c.609G＞A突变位点为中国MMA合并同型半胱氨酸血症患儿的热点突变位点.MMA基因突变类型较多,与临床症状无明显相关性.2.推测MMACHC基因c.440_441 del突变及MUT基因c.754-1G＞C突变为新发突变.3.基因捕获联合高通量基因测序技术一次性捕获突变基因数量大,获取疾病的遗传信息量广,具有高通量、高灵敏度、高效等特点,适合于MMA患儿检测,也可为其他儿科临床常见遗传性疾病的检测提供参考.     

婴儿期发病Lesch-Nyhan综合征4例临床表现及HPRT1基因突变分析并文献复习

目的　分析婴儿期发病Lesch-Nyhan综合征（LNS）患者临床特点以及相关基因突变情况。方法　对2017—2018年就诊于首都儿科研究所附属儿童医院的4例尿酸升高、运动发育迟缓、肌张力障碍伴或不伴有自残行为的婴儿患者进行全外显子基因检测,生物信息学分析筛选致病性变异,并对核心家系成员采用Sanger测序分析突变来源。总结整理Pubmed、知网和万方数据库报道过的婴儿期发病LNS中国患者的临床特点及基因突变情况。结果　4例均携带HPRT1基因致病性突变,符合LNS遗传诊断。突变分别为2个错义突变（c.49T＞A,p.Y17N和c.133A＞G,p.R45G）,1个无义突变（c.325C＞T,p.Q109*）和1个移码突变（c.419delG,p.G140Afs*26）,其中p.Y17N和p.G140Afs*26为未报道的新突变。回顾文献收集 11例婴儿期发病的中国LNS患者,HPRT1基因型与临床表型的相关性分析发现了智力迟缓、运动发育迟缓、高尿酸血症为核心表型,且出现比例为100%;和错义突变相比,截短性突变较早出现自我伤害表型。结论　该研究描述了婴儿期发病的中国LNS患者临床与基因信息,补充了HPRT1基因突变谱,对临床表现为高尿酸血症合并神经系统异常的儿童患者进行LNS基因筛查将有助于早期LNS诊断和治疗。     

隐睾及隐睾合并其他泌尿生殖系统畸形的外显子测序分析

目的对隐睾及隐睾合并其他泌尿生殖系统畸形的不同表型患儿进行外显子测序,以探索不同临床表型的分子病因。方法提取19例隐睾及隐睾合并其他泌尿生殖系统畸形患儿外周血基因组DNA进行外显子测序,并对测序结果进行生物信息学分析,其中3例行全基因外显子测序,16例行常见基因外显子测序,再采用Sanger测序对获得候选致病突变的患儿及其父母的外周血样本进行突变位点验证。结果本研究纳入的19例患儿中,6例外显子测序结果经生物信息学分析后发现存在异常结果,并提示有3个基因可能与相关表型发病有关:①AR基因发生3处错义突变(c.1600C>A;p.Pro534Thr)、(c.2599G>A;p.Val867Met)和(c.528C>A;p.Ser176Arg);②NR5A1基因发生移码突变(c.442delG;p.Glu148Serfs*148)和错义突变(c.43G>A;p.Val15Met);③ATRX基因发生剪切位点突变(c.4317+13T>C)。其中c.2599G>A和c.43G>A为已知突变,其余4处未见相关研究报道,为新发突变。Sanger测序结果表明6处突变均得以验证,5例患儿母亲存在对应位点突变、患儿父亲未见异常,1例患儿父母均未见异常。结论AR基因错义突变、NR5A1移码和错义突变及ATRX的剪切位点突变可能是隐睾及隐睾合并其他泌尿生殖系统畸形发病的危险因素。     

新生儿枫糖尿病一例及其基因突变分析

目的 分析1例汉族经典型枫糖尿病新生儿的临床特点及其相关基因的致病性突变.方法 患儿男,生后8d因喂养困难于2013年4月转来上海交通大学附属儿童医院,收集患儿的临床资料及影像学检查等明确诊断后,提取患儿及其父母的外周血白细胞DNA检测BCKDHA、BCKDHB、DBT和DLD基因,确定患儿的基因突变位点,并进行生物信息学分析.结果 患儿表现为生后喂养困难、抽搐、代谢性酸中毒、尿有枫糖味等,CT示广泛脑白质低密度改变,串联质谱及尿气相色谱-质谱均符合枫糖尿病的诊断.基因测序结果在BCKDHB基因上发现2个错义突变:c.580 C＞T(p.Leu194Phe)和c.597 T＞G(p.Ser199Arg),均为杂合子,且为国际上未报道过的新突变.经Sanger测序发现其父亲携带了错义突变p.Leu194Phe,其母亲携带了错义突变p.Ser199Arg,符合家系共分离规律.PolyPhen蛋白功能预测发现此2个错义突变为有害的,很可能影响其蛋白功能.结论 BCKDHB基因c.580 C ＞T(p.Leu194Phe)和c.597 T＞G(p.Ser199Arg)复合杂合突变是该患儿的致病性突变,是该枫糖尿病患儿临床表现的基因分子基础,且为国际上未报道过的新突变.     

Schimke免疫-骨发育不良儿童基因分析

目的 对2例临床疑似Schimke免疫-骨发育不良(Schimke immuno-osseous dysplasia,SIOD)患儿进行SMARCAL1基因分析,寻找致病突变,进而了解中国人SMARCAL1基因突变类型以及基因诊断的意义.方法 对2008-2014年于北京协和医院就诊的2例临床表现为脊柱骨骺发育不良、身材矮小不对称,进行性加重的肾病综合征,细胞免疫功能缺陷的疑似SIOD患儿,在获得知情同意后,取患儿及其父母新鲜抗凝外周血,常规提取DNA,设计引物后对SMARCAL1全部16个外显子及外显子内含子交界处进行PCR扩增,经凝胶电泳分离PCR产物,纯化,测序.并对发现的错义变异进行SIFT软件验证以及50名正常人测序验证.结果 (1)2例患儿共检测到4种基因变异:两种错义变异:c.1129G＞C,p.Glu377Gln及c.1933C＞T,p.Arg645Cys.两种剪切突变:c.1334 +1G＞A及c.2142-1 G＞A.(2)c.1129G＞C,p.Glu377Gln为已报道的致病突变,检验50名正常人中,15名携带此变异,证实其为单核苷酸多态性,而非致病突变.(3)c.1334+ 1G ＞A及c.2142-1 G＞A为本研究发现的两种新突变.结论 (1)通过SMARCAL1基因分析,共检测到3种致病突变,发现新突变2种.(2)错义变异c.1129G＞C,p.Glu377Gln至少在中国人种中为单核苷酸多态性,而非致病突变.     

SRD5A2基因新型复合杂合突变致类固醇5-α还原酶2型缺乏症的遗传变异分析

该文报道1例类固醇5-α还原酶2型缺乏症患儿的临床特征及SRD5A2基因突变特点。患儿男性,2月龄,生后即出现尿道下裂及阴茎短小。提取患儿及父母外周血DNA,通过高通量测序技术对患儿DNA样本进行内分泌疾病相关基因的捕获测序,并对家系DNA样本进行Sanger测序验证。结果显示患儿SRD5A2基因存在c.680G > A（p.R227Q）和c.608G > A（p.G203D）复合杂合突变,其中c.680G > A来源于其父亲,为已知致病性突变,c.608G > A来源于其母亲,为新发现的突变。该研究为患儿病因诊断及该家系的遗传咨询提供了分子依据,并扩展了SRD5A2基因突变谱。     

CITED2基因突变与先天性心脏病关系研究

目的 研究CITED2基因突变与先天性心脏病（CHD）的关系。方法 2013年1月至2015年1月山东大学齐鲁儿童医院收集368例散发型CHD患儿和200名健康儿童血液样本进行DNA抽提, PCR扩增CITED2外显子区, Sanger测序后, 进行GeneBank对比和氨基酸序列分析。结果 发现4例杂合突变。病例1室间隔缺损患儿为c.399C＞T同义突变（p.His133His）; 病例2室间隔缺损患儿为SGJ区c.574A＞G的错义突变（p.Ser192Gly）; 病例3房间隔缺损患儿为已知 SNP位点（rs191856368）; 病例4动脉导管未闭患儿为新发现的错义突变（p.Ser96Phe）。这些突变在对照组中均未检测到。结论 CITED2基因Ser192Gly和p.Ser96Phe突变可能与CHD发生有关。     

疑似儿童神经元蜡样脂褐质沉积症5例诊断分析

目的 探讨儿童神经元蜡样脂褐质沉积症（NCL）的诊断方式,特别是基因诊断的意义。方法　回顾性分析2013年1月至2017年1月在首都医科大学宣武医院就诊的5例临床疑诊NCL的患儿资料,其中男3例、女2例,有2例为兄妹关系。患儿发病年龄3岁4个月至8岁11个月,来院首诊年龄3岁6个月至14岁。对脑影像表现异常的4例患儿及其父母、兄弟提取外周血DNA,检测相关基因。结果　4例确诊为NCL,1例为儿童癔症。基因检测：例1 TPP1基因 c.887-17A＞G为剪切变异; c.646G＞A为错义变异。例2 TPP1基因 c.1015_1016 del为移码变异; c.640C＞T为无义变异。例3 CLN6基因核苷酸改变为c.158T＞C（p.L53P）及c.889C＞T（p.P297S）。3例父母均只携带其中1个杂合变异,例3受检者哥哥未携带突变。例4 CLN3基因 c.1160_1169 delCAGCCTACGTinsGC杂合突变,母亲未检测到该突变,缺失父亲样本;CLN3基因外显子E3-E8杂合缺失,为真实缺失,母源。随访15～60个月,无死亡病例。 结论　对于怀疑NCL的患儿应及时检查头颅磁共振成像、脑电图及基因检测,导致NCL 的基因突变TPP1（c.887-17A＞G,c.1015_1016 del）,CLN3（c.1160_1169 delCAGCCTACGTinsGC）,CLN6［（c.158T＞C（p.L53P）,c.889C＞T（p.P297S）］位点均为首次报告,基因型对于NCL的分型、判断预后十分重要。     

第二代测序技术诊断新生儿营养不良型大疱表皮松解症1例及其家系分析

目的分析营养不良型大疱表皮松解症新生儿的基因异常。方法应用目标区序列捕获和第二代测序技术检测1例营养不良型大疱表皮松解症的新生儿的COL7A1基因。采用Sanger测序验证患儿的突变位点,并对其父母、外祖母的样本进行突变位点的序列分析。结果二代测序结果显示患儿COL7A1基因第86个外显子上发现1个杂合突变点c.6781CT,引起该基因第2 261位氨基酸由精氨酸变为终止密码子(p.R2261X)。Sanger测序结果显示其母亲和外祖母携带相同突变。结论通过二代测序技术可以准确检测出营养不良型大疱表皮松解症COL7A1基因的突变,具有一定的临床应用价值。     

Omenn综合征临床表型及分子诊断

目的探讨Omenn综合征的临床特点及其致病基因。方法回顾分析2例Omenn综合征患儿的临床资料和基因检测结果。结果男女患儿各1例,分别为6个月、8个月;均有反复感染、皮疹病史;免疫球蛋白水平均降低,CD8~+T淋巴细胞降低,CD19~+B淋巴细胞严重降低,自然杀伤细胞数量升高。利用高通量测序方法对2例患儿及其家庭成员进行免疫缺陷相关基因检测,并利用Sanger测序法验证,例1的RAG1基因外显子2存在c.1211GA(p.R404Q)纯合突变,分别遗传自其父母,患儿叔叔亦为携带者。例2的RAG2存在母源c.830AG(p.Y277C)突变以及父源c.104GC(p.G35A)突变,2个突变位点均未见报道,生物信息学预测2个突变均为可能致病性异常。结论 Omenn综合征患者发病年龄较早,免疫功能低下。基因检测有利于早期诊断及遗传咨询。确认了2个可引起Omenn综合征的新突变。     

基于快速和常规全外显子组分析技术对遗传性疾病的诊断程序比较

目的 探索可被临床医生直接应用的全外显子测序（WES）数据分析平台及方法。方法 选择复旦大学附属儿科医院（我院）临床诊断不明疾病的核心家系3例（例1~3）和仅先证者2例（例4和5）行WES分析,采用WuXi NextCODE临床测序数据分析系统（简称NextCODE平台）进行快速数据分析,并与我院分子诊断中心已建立的高通量数据分析流程（简称常规数据分析流程）进行参与人员及耗时的比较。结果 例1~3基于表型相关候选基因联合遗传模式的分析方法,分别检测到FGFR2基因杂合突变、GBE1基因复合杂合突变及TBX1基因杂合突变;例4和5通过表型相关候选基因分析,分别检测到IL10RA基因纯合突变和复合杂合突变。NextCODE平台自动完成3/7个步骤,从输入表型至生成报告,WES数据分析用时30 min以内。常规数据分析流程自动完成1/7个步骤,6个人工完成步骤需要多个专业人员进行数据的筛选及解读,从输入表型至生成报告,熟练的专业人员用时2~8 h。结论 5例临床诊断不明病例通过WES明确了诊断;NextCODE是直接为临床医生所用、简单快速的WES数据分析平台,有助于协助临床医生直接利用高通量测序数据,准确锁定致病突变,提高诊断效率。     

PKHD1突变致儿童门脉高压4例病例报告

目的 通过二代测序探讨儿童不明原因门脉高压的遗传病因,以提高临床认识。 方法 2012至2016年3月在复旦大学附属金山医院收治的4例不明原因的儿童门脉高压病例,均进行全外显子测序或肝病基因Panel的高通量测序,对临床表现进行回顾性分析。 结果 4例患儿中,男1例,女3例,发病年龄3.3~6.4岁。主要临床表现为上消化道出血3例,脾肿大4例,肝肿大2例;肝内胆管扩张1例;转氨酶轻度升高2例。4例患儿影像学上均有肾脏病变,肝脏合成功能和肾功能均正常。二代基因测序及Sanger验证,4例患儿均在PKHD1基因上发现复合杂合突变,其中无义突变和经典剪切位点突变各1个,缺失突变（移码突变）和错义突变（少见位点）各3个。例1外显子32 上第4 481位碱基A缺损造成移码突变和外显子51的前1位内含子区碱基G突变为A影响剪切位点;例2外显子24上第2 507位碱基T突变为C,导致第836位上的缬氨酸变为丙氨酸,外显子58上第9 568位碱基C突变为T,导致编码第3 190位谷氨酰胺的密码子变成终止密码子。例3外显子12上第847位碱基T突变为C,导致第283位上的苯丙氨酸转变为亮氨酸,外显子58上第9 455位密码子A缺失导致移码突变。例4外显子61上第10 315位碱基G突变为T,导致第3 429位上的天冬氨酸转变为酪氨酸,外显子27上第3 028至3 039位碱基缺失,并插入AGGT导致移码突变。最终4例患儿均确诊为常染色体隐性遗传性多囊肾病。 结论 PKHD1基因突变引起的常染色体隐性遗传性多囊肾病是我国儿童门脉高压的重要病因,二代基因测序是确诊的有效手段。     

远端肾小管酸中毒患儿基因型及临床表型的相关性分析

目的对确诊的6例原发性远端肾小管酸中毒(dRTA)的病例行基因型及临床表型的相关性分析。方法对2017年11月至2019年8月确诊于华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院的6例dRTA患儿行病史资料采集及相关辅助检查,评估其生长发育情况,留取静脉全血进行Trio全外显子高通量测序,经全谱遗传病精准诊断云平台系统分析筛选和数据分析,对可疑突变进行Sanger测序验证,后应用蛋白预测软件进行蛋白功能预测。结果6例患儿的临床症状、体征和辅助检查均符合dRTA的诊断,均表现为生长发育落后,1例患儿出现X型腿,1例患儿出现骨质疏松。辅助检查均提示低钾血症、代谢性酸中毒、碱性尿,3例患儿出现肾脏钙质沉着,2例患儿出现肾脏结石,所有患儿的父母亲均无临床表型。1例患儿为SLC4A1基因纯合突变[c.2102(exon17)G>A,p.G701D],为既往报道的常染色体隐性遗传高频突变位点,该患儿同时合并dRTA及溶血性贫血;3例为SLC4A1基因杂合突变,均为De novo突变[c.1766(exon14)G>A,p.R589H,c.1765(exon14)C>T,p.R589C],为既往报道的常染色体显性遗传高频突变位点,确诊年龄与肾脏影像学异常存在相关性。1例为ATP6V1B1基因复合杂合突变[c.806(exon9)C>T,p.P269L;c.1153(exon12)C>A,p.P385T],均为未见文献报道的新突变位点。1例为ATP6V0A4基因纯合无义突变[c.1899C>A,p.Y633X,208],为未见文献报道的新突变位点。结论SLC4A1、ATP6V1B1、ATP6V0A4是目前已明确的dRTA的主要致病基因,其突变特点及遗传方式与临床表型相关。基因检测可以对可疑的dRTA患者行早期分子诊断,有助于临床表型的筛查及个体化治疗。     

先天性甲状腺功能减低症35例甲状腺过氧化物酶基因突变检测

目的 检测35例先天性甲状腺功能减低症(CH)患儿甲状腺过氧化物酶(TPO)基因突变.方法 抽取35例先天性甲状腺功能减低症患儿外周血并提取DNA,用PCR扩增患儿TPO基因所有17个外显子、外显子-内含子交界区以及3'端和5'端非翻译区,用DNA测序技术和限制性内切酶检测基因突变,并对发现突变的CH患儿父母进行对照分析.结果 5例CH患儿存在TPO基因突变:1例为c.961A＞G和c.2422delT突变复合杂合子,1例为c.2268insT和c.1477G＞A突变复合杂合子,3例为c.2268insT突变纯合子.其中c.961 A＞G[p.Thr321 Ala]为未见文献报道的突变.结论 在35例先天性甲状腺功能减低症检测到4种TPO基因突变.

Abstract：

Objective To identify thyroid peroxidase (TPO) gene mutations in 35 patients with congenital hypothyroidism. Method Genomic DNA was isolated from peripheral blood samples of 35 patients with congenital hypothyroidism. All of the 17 exons and flanking introns of TPO gene were amplified by PCR, then the PCR products were sequenced bi-directionally and were analyzed by restriction endonucleases. Result One patient had compound heterozygous mutations c. 961A ＞ G/c. 2422delT, one was c. 2268insT/c. 1477G ＞ A, and three was homozygous mutation c. 2268insT. The TPO gene mutation c.961A ＞ G [p. Thr321Ala] was one novel mutation. Conclusion High frequency mutation in TPO gene was detected in patients with congenital hypothyroidism.     

全外显子组序列分析新生儿FGFR2基因相关疾病1例

目的通过对1例新生儿期特殊面容、神经系统结构畸形患儿进行全外显子组序列检测分析,旨在为该患儿寻找潜在的致病原因。方法纳入1例在复旦大学附属儿科医院(我院)新生儿病房住院期间未能明确诊断的多发畸形患儿,主要临床表型为前额突出、腭弓高、耳位低、枕部较平,双侧脑室扩大、透明隔部分缺如、胼胝体发育异常,采用Sure Selct Human All Exon捕获试剂盒和Illumina Hi Seq2000测序平台,行全外显子组序列检测。数据分析采用复旦大学附属儿科医院转化中心所建立的高通量测序数据分析流程。采用Sanger测序进行验证。结果患儿全外显子组序列检测数据,共检测到79 064个变异,经过质量控制筛选、变异频率筛选、变异分类筛选,剩余645个变异。在进一步分析中,645个变异中有159个其所在基因在OMIM数据库及HGMD数据库与疾病相关。从3个已经报道的突变位点中锁定致病突变为FGFR2基因(NM_000141)c.C1040G,p.S347C。Sanger测序在家系内验证该位点为新发(de novo)突变。结论采用全外显子组序列检测,明确诊断FGFR2相关疾病1例。并且结合我院已经建立的高通量测序数据分析和临床诊断流程,为新生儿多发畸形寻找潜在的致病基因提供了快速、高效的方法。     

先天性全身脂肪营养不良一家系临床及基因变异分析

目的 探讨先天性全身脂肪营养不良症(CGL)的临床特征及基因变异特点.方法 回顾分析1对BSCL2基因变异致CGL双胎患儿的临床资料及其家系基因检测结果.结果 患儿均为男性,4月龄,均表现为全身脂肪组织消失,肝脾肿大,全身少量色素沉着.实验室检查示高三酰甘油血症.提取双胎中哥哥及父母的外周血,进行全外显子组基因测序并经...     

DACT1错义突变与先天性心脏病易感性的相关性研究

目的 筛选与先天性心脏病(CHD)相关的DACT1基因的错义突变,并研究其生物学功能。方法 研究对象为中国山东地区汉族人群,病例组为2008年8月至2011年1月散发CHD的连续就诊患儿,排除综合征型和有心脏病家族史患者;对照组为同时期收集的排除CHD以及有心脏病家族史的健康儿童。①提取两组外周静脉血WBC的基因组DNA,靶向DACT1基因的编码区进行测序,将测序结果中的单核苷酸变异(SNV)与数据库dbSNP(version137)和千人基因组比对,病例组与对照组的SNV比对,筛选出病例特异性的新发现或稀有DACT1突变位点,通过Sanger法验证。②构建野生型和各突变型DACT1的表达质粒,在HEK293T细胞中通过蛋白质免疫印迹实验观察DACT1和DVL2蛋白表达水平。③通过双荧光素酶报告基因实验观察突变后DACT1对经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路(PCP)调控作用的变化。结果 病例组404例,年龄(2.9±2.7)岁;对照组213名,年龄(7.1±3.7)岁。病例组和对照组的男女比例分别为1.2:1和1:1,均为汉族儿童。在3例CHD中筛选到4个DACT1基因编码区的新发现或稀有的错义突变c.1486C>T (p.S441L)、c.1598C>A (p.S478R)、c.1659G>C (p.E499Q)和c.1891T>A (p.M576K),经Sanger测序验证均为杂合突变。DACT1^S478R和DACT1^E499Q在不同物种中保守性很高。DACT1^S441L SIFT评价为有害突变;DACT1^E499Q PolyPhen-2评价为可能有害(0.978),DACT1^S478R和DACT1^M576K SIFT和PolyPhen-2预测为无有害性。4种突变型对DACT1蛋白的表达水平均无明显影响。与野生型DACT1相比较,突变型DACT1^E499Q对DVL2蛋白的下调作用减弱(P<0.05),对经典Wnt信号通路以及PCP信号通路的抑制作用也减弱(P <0.01)。结论 DACT1^E499Q错义突变可能通过减弱对Wnt信号通路活性的抑制来促进CHD的发生。