氟对小鼠成纤维细胞和成骨细胞c-fos表达的影响

目的 观察氟对小鼠成纤维细胞(FB)和成骨细胞(OB)c-fos mRNA和蛋白表达的影响,探讨c-fos表达改变在FB成骨功能方面的作用.方法 将小鼠FB和OB分为对照组和6个染氟组,染氟(F-)质量浓度分别为0、0.0001、0.0010、0.1000、1.0000、10.0000、20.0000 mg/L,培养时间为2、4、24、48、72 h.应用酶联免疫吸附法(ELISA)和RT-PCR法分别检测各时间段培养细胞上清液c-fos蛋白和染氟48 h细胞中c-fos mRNA的表达.结果 ELISA结果表明,各染氟组FB在各时间段c-fos蛋白水平均较相应对照组明显升高(P<0.01);OB c-fos蛋白水平在氟作用48 h的0.0001、0.0010 mg/L组(0.73±0.04、0.64±0.14)、氟作用72 h的0.0001mg/L组(0.70±0.17)较对照组(0.32±0.04、0.27±0.05)明显升高(P<0.01).RT-PCR结果表明,染氟48 h各剂量组FB c-fos mRNA表达(1.06±0.16、1.06±0.12、1.12±0.16、1.04±0.15、1.04±0.10、1.15±0.29)呈上升趋势,但与对照组(0.95±0.11)比较,差异无统计学意义(P>0.05);OB在染氟20.0000 mg/L组c-fos mRNA表达(1.40±0.17)较对照组(1.06±0.06)明显升高(P<0.01).结论 氟对FB和OB c-fos mRNA和蛋白表达具有明显的刺激增强作用,可能在促进FB成骨表型表达和成骨活动增强方面发挥重要作用.     

结肠癌细胞微小核糖核酸-200c表达和上皮间质转化与吉非替尼敏感性关系

目的 探讨微小核糖核酸(miRNA)-200c及上皮间质转化(EMT)与结肠癌细胞对吉非替尼治疗敏感性的关系.方法 细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测吉非替尼对4种人结肠癌细胞系HT29、SW620、HCT116、SW480的生长抑制作用;以实时定量PCR法检测4种结肠癌细胞中miRNA-200c,上皮标志物(E-钙黏蛋白),间质标志物[波形蛋白、具锌指E盒结构的同源异性盒1(ZEB 1)]mRNA水平表达,Western印迹检测E-钙黏蛋白、波形蛋白、ZEB 1蛋白水平表达.外源性上调或下调miRNA-200c表达,观察EMT相关基因表达变化及细胞对吉非替尼敏感性的变化.结果 HT29细胞对吉非替尼最为敏感[半数抑制浓度(IC50)=(7.70±0.31) μmol/I],其miRNA-200c与E-钙黏蛋白表达量均为最高,波形蛋白及ZEB 1表达水平极低;HCT116及SW480细胞系对吉非替尼为中度敏感[IC50=(11.88±0.97),(16.63士0.45)μmol/L],其miRNA-200c、E-钙黏蛋白呈中等程度表达;SW620细胞系对吉非替尼最不敏感[IC50=(26.43±3.68) μmol/L],miRNA-200c与E-钙黏蛋白表达量最低,波形蛋白及ZEB 1表达量均显著高于其他3种细胞系.外源性上调miRNA-200c表达后,SW620细胞中E-钙黏蛋白表达上调,ZEB 1及波形蛋白表达下调,同时细胞对吉非替尼的敏感性亦显著提高;相反,外源性下调miRNA-200c表达后,HT29细胞中E-钙黏蛋白表达下调,ZEB 1及波形蛋白表达上调,同时细胞对吉非替尼的敏感性显著降低.结论 miRNA-200c可能通过调控EMT,上调E-钙黏蛋白表达,进而影响结肠癌细胞对吉非替尼的敏感性.     

微小RNA-760在H9c2细胞中的表达及对凋亡的影响

目的探讨微小RNA-760(miR-760)在缺血再灌注(H/R)后H9c2细胞中的表达及对凋亡的影响。方法采用H9c2细胞制备H/R模型,通过转染调控H9c2细胞的miR-760表达,并通过系统随机化法分为对照组、模型组(H/R组)、阴性对照组(H/R+miR NC组)和H/R+miR-760 mimics组,以RT-PCR检测H9c2细胞中miR-760的表达,CCK-8检测miR-760对H9c2细胞活力的影响,流式细胞术检测miR-760对H9c2细胞凋亡的影响,Western blot检测miR-760对心肌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3表达的影响。结果 miR-760在H/R组H9c2细胞中的相对表达量较对照组显著降低(P<0.001),而H/R+miR-760 mimics组H9c2细胞的miR-760表达量较H/R组明显上调(P<0.01)。与对照组比较,H/R组H9c2细胞活力显著降低(P<0.001);与H/R组比较,H/R+miR-760 mimics组H9c2细胞的活力显著增加(P<0.01)。与对照组比较,H/R组H9c2细胞的凋亡率显著增加(P<0.001);与H/R组比较,H/R+miR-760 mimics组H9c2细胞的凋亡率显著降低(P<0.01)。与对照组比较,H/R组H9c2细胞的Bcl-2表达量显著下调,Bax和cleaved caspase-3表达量显著上调(均为P<0.001);与H/R组比较,H/R+miR-760 mimics组的Bcl-2表达量显著上调,Bax和cleaved caspase-3表达量显著下调(均为P<0.001)。结论 miR-760在H/R后H9c2细胞中表达下调,上调miR-760的表达能够抑制H9c2细胞凋亡,其机制可能与上调Bcl-2、下调Bax和cleaved caspase-3的表达有关。     

MicroRNA-196a抑制序列对人胰腺癌PANC1细胞株HOXB8基因表达的影响

目的 观察microRNA-196a(miR-196a)抑制序列转染胰腺癌细胞株PANC1后对其HOXB8基因表达的影响.方法 将PANC1细胞分为对照组、miR-196a抑制序列组和siRNA对照组.采用脂质体法将miR-196a抑制序列及对照siRNA分别转染PANCI细胞.应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染细胞miR-196a及其下游靶基因HOXB8 mRNA和蛋白的表达.结果 转染miR-196a抑制序列后,PANC1细胞miR-196a表达量较siRNA对照组显著减少(0.050±0.054比0.839±0.025,t=3.12,P＜0.05);HOXB8 mRNA表达量较siRNA对照组增高1.57倍(2.20 ±0.07比1.29±0.10,t=3.86,P＜0.05);HOXB8蛋白表达量也显著增强(0.90±0.03比0.40±0.10,t=3.11,P＜0.05).结论 miR-196a可以下调HOXB8基因的表达.     

miR-200c对人胃癌细胞增殖能力的影响及其机制探讨

目的 观察miR-200c对人胃癌细胞增殖能力的影响,并探讨其是否通过靶向调控DNA甲基化转移酶(DNMT3B)表达发挥作用.方法 采用MTT法检测miR-200c对人胃癌MGC-803细胞生长增殖能力的影响;构建DNMT3B 3'UTR-荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告载体系统观察miR-200c对DNMT3B 3'UTR-荧光素酶活性的影响;将miR-200cmimics转染胃癌细胞MGC-803,采用Western blot检测DNMT3B表达水平.结果 MTT结果显示,在转染miR-200c mimics 24、48、72 h后,细胞增殖活性OD值分别为0.31±0.01、0.47±0.01、0.53 ±0.02,与对照组的0.44±0.03、0.62±0.01、0.87 ±0.01比较,P均＜0.05;荧光素报告载体系统证实,DNMT3B是miR-200c直接调控的靶基因.Western blot结果显示,miR-200c可抑制DNMT3B蛋白的表达.结论 miR-200c通过靶向调控DNMT3B的表达而抑制胃癌细胞生长增殖能力.     

缺氧诱导因子-1α及其靶基因在人肝癌HepG2细胞中的表达和意义

缺氧诱导因子-1（HIF-1）存在于大多数实体肿瘤中，是肿瘤细胞维持氧平衡的重要的转录调节子。HIF-1包含α和β两个亚基（HIF-1α和HIF-1β），其中HIF-1α是主要的功能亚基，对HIF-1的转录活性起关键作用。缺氧条件下，HIF-1α被运输到核内，与HIF—1β形成二聚体，通过与靶基因上的缺氧反应元件（HRE）结合而促进靶基因转录，其蛋白质产物发挥多种生物学功能，如参与肿瘤血管的形成与发展，肿瘤细胞能量代谢，肿瘤细胞增殖与存活等。     

氟对成纤维细胞和成骨细胞核心结合因子α1表达的影响

目的观察不同剂量氟化物在不同时间段对成纤维细胞和成骨细胞核心结合因子α1(cbfa1)表达的影响。方法采用细胞培养的方法,将细胞分为对照组和6个染氟组(0．1、1．0、100．0、1000．0、10 000．0、20 000．0μg／L),分别在5个染氟时间段(2、4、24、48、72 h)收集培养细胞培养上清液和细胞,应用酶联免疫吸附(ELISA)法和免疫组化方法检测cbfa1蛋白含量和表达,应用RT-PCR方法检测染氟48 h cbfa1 mRNA的表达。结果①与对照组比较(2．13±0．07),成纤维细胞染氟48 h时,cbfa1蛋白含量在0．1、1．0、100．0、1 000．0、20 000．0μg／L组[(2.35±0．08)、(2．28±0．09)、(2．32±0．09)、(2．25±0．08)、(2．28±0．09)]及染氟72 h的10 000．0μg／L组(2．48±0．22)明显升高;染氟48 h,cbfa1 mRNA表达呈升高趋势,其中10 000．0μg／L组(1．29±0．30)与对照组(1．02±0．12)比较,明显增强;免疫组化结果显示,染氟48 h的0．1μg／L组成纤维细胞内可见明显cbfa1阳性表达。②在成骨细胞,染氟组cbfa1蛋白含量较对照组有不同程度增加;染氟48 h时,0．1、1．0、100．0、1 000．0μg／L组cbfa1 mRNA表达较对照组(1．27±0．20)升高,其中0．1μgL组(1．34±0．19)明显升高。结论氟能提高成纤维细胞和成骨细胞cbfa1蛋白含量,促进cbfa1和cbfa1 mRNA表达,成纤维细胞可能在氟骨症骨周化骨的发生中起重要作用。     

Effect of SiO_2 nanoparticles exposure on microRNA expression level in human bronchial epithelial cells

<正>Objective To investigate the effect of short and long term exposure to Si O2nanoparticles on microRNA expression level in human bronchial epithelial cells(16HBE cells).Methods The 16HBE cells were exposed to 5,10,15,20,25,30 and 40μg/ml Si O2nanoparticles for24 h to detect the cell viability by using CCK-8 assay.     

Mef2c真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的构建小鼠Mef2c基因真核表达质粒并转染HEK293T细胞。方法采用RT-PCR方法从小鼠心脏组织的总cDNA中扩增出小鼠的Mef2c的基因,采用基因重组技术将Mef2c的cDNA片段插入真核表达载体peD—NA3．1（＋）,构建小鼠Mef2c真核表达质粒,脂质体转染HEK293T细胞进行表达。结果酶切和测序结果证实Mef2c真核表达质粒构建成功,经脂质体转染293T细胞后,Western blot检测证明Mef2c蛋白在真核细胞中成功表达。结论成功构建真核表达质粒pcDNA3．1（＋）．Mef2c,为进一步研究小鼠Mef2c在心肌分化过程中的作用及其调控机制奠定了实验基础。     

骨髓瘤细胞抑制成骨细胞活性和Runx2表达

目的 建立MM细胞系(U266细胞株)和MSCs共培养体系,研究骨髓瘤细胞对MSCs增殖能力、OB形成能力和Runx2表达的影响.方法 研究对象为2例缺铁性贫血和1例特发性血小板减少性紫癜.采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,培养3-5代后,诱导MSCs向OB分化,待细胞融合至60％～70％时,分两组,一组加U266细胞株共同培养(共培养组),另一组不加U266细胞株(对照组).采用CCK-8试剂盒检测MSCs向OB分化过程中的增殖能力,以平均光密度值(AOD)表示;碱性磷酸酶(ALP)染色和钙结节(Von-Kcssa)染色检测MSCs的OB形成能力,分别以IOD sum/Area sum值和平均钙结节个数表示;RT-PCR技术检测MSCs向OB分化过程中Runx2的表达,以Runx2/GAPDH平均光密度值表示.结果 在共培养体系中,U266细胞株和MSCs共培养的前3d,MSCs增殖能力无明显变化,两组AOD值分别为0.731±0.020和0.805±0.152(P ＞0.05),至第6天,共培养组的MSCs增殖能力明显低于对照组,AOD分别为0.560±0.034和2.283±0.145(P ＜0.05).与对照组相比,共培养组MSCs向OB分化过程中ALP的表达显著降低,IOD sum/Area sum值分别为0.138±0.038和0.376±0.044(P ＜0.01),钙结节的形成减少,平均钙结节个数分别为(6.7±2.75)个和(15.3±8.99)个(P＜0.01)和Runx2的表达显著降低,Runx2/GAPDH平均光密度值分别为0.238±0.168和0.653 ±0.343(P ＜0.01).结论 骨髓瘤细胞可抑制骨髓MSCs向OB分化的增殖能力和OB形成能力,也抑制其Runx2表达.     

Effects of human microRNA-181a-5p on proliferation and migration of gastric cancer cells

<正>Objective To preliminarily explore the effects of human microRNA-181a on migration of gastric cancer cells and its mechanism.Methods The expression of miRNA-181a-5p in gastric cancer cell line GC9811 and peritoneal high metastasis gastric cancer cell line GC9811-P were tested by quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR).GC9811 cell line was transfected     

燃煤砷暴露对人体T细胞增殖能力的影响及其机制探讨

目的 探讨燃煤砷暴露对人体T细胞增殖能力的影响及其作用机制.方法 采集贵州省燃煤污染型砷中毒病区居民及非病区居民外周血,按<地方性砷中毒诊断标准>(WS/T 211-2001)分为暴露组(17例)、轻度砷中毒组(35例)、中度砷中毒组(38例)、重度砷中毒组(19例)及对照组(35例).采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测T细胞刺激指数;钙离子荧光探针(Fiuo-3/AM)染色流式细胞术检测外周血单个核细胞(PBMC)钙离子指数(IECa2+);电泳迁移率改变实验(EMSA)检测PBMC活化T细胞核转录因子(NF-AT)结合DNA的活性.结果 经刀豆蛋白A(ConA)刺激后,暴露组及轻、中、重度砷中毒组刺激指数(1.315±0.962、1.611±1.224、1.114±0.545、1.289±0.875)均低于对照组(2.322±1.241,P＜0.01).经抗CD3单克隆抗体(McAb)刺激后,暴露组及轻、中、重度砷中毒组刺激指数(0.997±0.177、1.103±0.291、1.007±0.221、0.957±0.205)亦均低于对照组(1.842±0.429,P＜0.01).轻、中、重度砷中毒组PBMC经抗CD3 McAb处理后,IECa2+(110.130±49.637、92.429±31.191、77.640±35.372)均显著低于对照组(145.986±59.450,P＜0.01);中、重度砷中毒组IECa2+亦均显著低于暴露组(121.337±46.410,P＜0.05).轻、中、重度砷中毒组PBMC内NF-AT结合DNA活性(1.354±0.446、1.290±0.291、1.159±0.411)均显著低于对照组(1.722±0.291,P＜0.01)和暴露组(1.611±0.294,P＜0.05).结论 燃煤砷暴露町导致人体T细胞刺激指数下降、PBMC内IECa2+减少及NF-AT结合DNA的活性降低,表明砷可抑制人体T细胞增殖能力,其原因可能与砷对T细胞受体(TCR)/CD3信号转导途径的影响有关.     

Effects of dihydrotestrone on osteoblast gene expression in osteopenic ovariectomized rats

Androgens stimulate bone formation, however, the precise mechanism of androgen action on osteoblasts remains to be elucidated. In this study, we defined the expression profile of osteoblast genes in ovariectomized rats with established osteopenia and their response to treatment with dihydrotestosterone (DHT). Twenty-four, 8-month-old female Sprague-Dawley rats were ovariectomized (ovx) and were administered vehicle, 40 mg, 80 mg, or 160 mg/kg body weight DHT at 15-weeks post-ovariectomy for 14 weeks. Alkaline phosphatase (ALP) messenger ribonucleic acid (mRNA) levels were increased at 29-weeks post-ovariectomy compared with preoperative rats (P < 0.05). In contrast, osteopontin and osteocalcin mRNA levels were unchanged. Treatment of osteopenic ovx rats with DHT for 14 weeks suppressed the ovariectomy-induced increase in ALP (P < 0.05) mRNA levels, independent of dose. These data suggest that androgens may act to inhibit the stimulation of the early stages of osteoblast development that occurs in the absence of estrogen and in states of low bone turnover.     

pCMV-HSF2-FLAG重组质粒的构建及其在Caco-2细胞中的表达

目的:构建人HSF2 pCMV-Myc真核表达载体,研究其在人结肠上皮肿瘤细胞Caco-2内的表达和定位.方法:以HSF2 Human cDNA ORF clone为模板,PCR法扩增出全长HSF2编码系列,用EcoRⅠ和KpnⅠ对HSF2 PCR纯化产物双酶切后,采用基因重组技术将其插入至pCMV-Myc载体中.DNA测序正确后,脂质体法将重组质粒转染到Caco-2细胞内,提取细胞总RNA逆转录为cDNA后进行普通PCR检测HSF2 mRNA转录水平,提取细胞蛋白进行Western blot检测HSF2蛋白质水平及融合蛋白表达.采用激光共聚焦显微镜观察HSF2及融合蛋白在Caco-2内的表达和定位.结果:将人全长HSF2编码序列克隆到真核表达载体pCMV-Myc中,酶切鉴定片段为1557bp,重组质粒测序正确.转染重组质粒后,PCR显示HSF2在mRNA水平较未转染组和空载组升高;Western blot检测到融合蛋白正确表达,分子量约为70kDa.与未转染组和空载组相比,重组质粒组HSF2蛋白质水平明显升高.激光共聚焦显微镜下观察到HSF2和融合蛋白定位一致,主要分布于Caco-2细胞质中,少量聚集在细胞核膜.结论:成功构建了人全长HSF2编码序列的pCMV-HSF2-FLAG真核表达载体,并在Caco-2细胞中成功表达,为进一步研究HS F2在溃疡性结肠炎中的作用奠定了良好的基础.     

缺氧对人胰腺癌SW1990细胞HIF-1α及靶基因Glut1、VEGF表达的影响

目的探讨缺氧对人胰腺癌SW1990细胞HIF-1α及靶基因Glut1、VEGF表达的影响。方法建立人胰腺癌SW1990细胞体外缺氧培养模型,随机分为缺氧培养8h、16h、24h组及常规培养组。采用RT-PCR和Western blot方法分别检测各组细胞HIF-1α、Glut1、VEGF mRNA和蛋白的表达。结果HIF-1α在常规培养细胞中的表达较弱,而在缺氧培养细胞中的表达水平明显增高。SW1990胰腺癌细胞株HIF-1α、Glut1、VEGF mRNA和蛋白在缺氧条件下的表达显著增强,并随缺氧时间的延长而升高。结论缺氧可诱导人胰腺癌SW1990细胞Glut1和VEGF的表达,这种作用可能是通过HIF-1α途径介导的。