1,4苯醌对K562细胞自噬的影响及机制

[目的]研究1,4苯醌(1,4-BQ)对人慢性髓系白血病K562细胞自噬的影响及其机制。[方法]选择人慢性髓系白血病K562细胞,采用1,4-BQ、自噬早期抑制剂LY294002和自噬晚期抑制剂氯喹(CQ)进行染毒处理,分为对照组、1,4-BQ染毒组(5、10、20μmol/L)、LY294002组(10μmol/L)、CQ组(10μmol/L)、1,4-BQ(20μmol/L)+LY294002(10μmol/L)组和1,4-BQ(20μmol/L)+CQ(10μmol/L)组。应用MTT法检测细胞增殖率;采用CYTO-ID荧光探针并运用荧光染色法和流式细胞术法对细胞自噬水平进行定性、定量检测;采用丫啶橙染色法检测细胞溶酶体pH值;运用实时定量PCR法和Western blot法检测LC3-Ⅱ和P62自噬相关基因和蛋白的表达水平。[结果]10、20μmol/L的1,4-BQ分别作用K562细胞24、48、72 h后,细胞相对增殖率明显降低(P0.05)。CYTO-ID自噬荧光染料特异性聚集在K562细胞胞质内,随着染毒浓度增加荧光强度明显增强。流式细胞术结果显示,与对照组相比,5、10、20μmol/L 1,4-BQ组自噬水平均明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。丫啶橙染色结果显示,不同浓度1,4-BQ组红色荧光强度均高于对照组,即1,4-BQ组溶酶体pH明显降低。Western blot结果显示,当1,4-BQ浓度为10、20μmol/L时,LC3-Ⅱ和P62蛋白表达量明显高于对照组(P0.05),且在染毒24 h时增幅最大。干预自噬后,与1,4-BQ组相比,1,4-BQ+LY294002组的自噬水平和LC3-Ⅱ蛋白表达量均降低(P0.05)。与1,4-BQ组相比,1,4-BQ+CQ组自噬水平增加(P0.05),而与CQ组的差异无统计学意义。此外,与对照组相比,CQ组LC3-Ⅱ蛋白表达明显增加(P0.05)。与1,4-BQ组相比,1,4-BQ+CQ组LC3-Ⅱ蛋白表达水平差异无统计学意义(P0.05)。[结论]1,4-BQ可引起K562细胞LC3-Ⅱ、P62蛋白表达增加,可能是通过增加自噬体的合成和减少自噬体的降解从而增加细胞自噬。     

N-乙酰半胱氨酸抑制亚砷酸钠诱导心肌细胞凋亡和自噬作用的研究

目的:探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)抑制亚砷酸钠诱导H9C2细胞凋亡和自噬作用及机制。方法:用亚砷酸钠诱导H9C2细胞构建凋亡和自噬模型。采用CCK-8比色法检测细胞的存活率,Hoechst 33258核染色法观察凋亡细胞的形态和数量改变.双氯荧光素染色法检测细胞内活性氧(ROS)水平,Western Blot法测定蛋白P53、Bcl-2、Bax及LC3的表达水平,以及磷酸化ERK1/2蛋白及ERK1/2蛋白总量的表达水平。结果:与对照组相比,15μM亚砷酸钠处理的H9C2细胞存活率显著降低.细胞内ROS水平明显增加.凋亡细胞数量明显增多,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值明显增大(P0.01)。1 mM NAC预处理后显著减少H9C2细胞内ROS的生成和促凋亡蛋白P53和Bax的表达,诱导抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高,同时降低自噬相关蛋白LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值。亚砷酸钠处理诱导ERK1/2蛋白磷酸化(P0.01),而NAC和亚砷酸钠共处理抑制了ERK1/2蛋白的磷酸化。结论:亚砷酸钠降低H9C2细胞的存活率,增加细胞内ROS的生成,诱导细胞凋亡和自噬。NAC通过降低H9C2细胞内的ROS水平和抑制ERK1/2蛋白的磷酸化拮抗亚砷酸钠诱导的细胞凋亡和自噬。     

PI3KC3/Beclin1复合物对染矽尘NR8383细胞自噬的调控作用

[目的]探讨PI3KC3/Beclin1复合物在染矽尘大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)自噬中的调控作用。[方法]常规培养NR8383细胞,随机分为4组:对照组,矽尘组,3-MA组和3-MA干预组,分别孵育1、3、6、12、20 h后收集样品。采用蛋白免疫印迹方法检测自噬标记蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬底物蛋白p62以及自噬相关蛋白Beclin1、PI3KC3;采用激光扫描共聚焦显微镜观察孵育不同时间的自噬免疫荧光表达情况;采用免疫共沉淀检测Beclin1复合物表达。[结果]免疫荧光结果显示,矽尘组LC3点状聚集绿色荧光亮斑随时间先增强后减弱,在6 h时荧光最强,且各时间点较对照组和3-MA干预组荧光亮斑增强;3-MA干预组LC3荧光标记绿色亮斑先增强后减弱,弱于矽尘组,但强于对照组。加入溶酶体抑制剂二磷酸氯喹后,各组LC3绿色荧光信号随时间均呈现增强的趋势。Western blot结果显示,矽尘组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值呈先增加后减少趋势,且在各个时间点均高于对照组(P 0.05);在LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值达最高的6 h时间点,矽尘组的值是对照组的248%,是3-MA组的372%。3-MA干预组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值也呈先增加后减少趋势;除1 h时间点外,余各时间点均低于矽尘组,但高于对照组(P 0.05);在LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值达最高的6 h时间点,3-MA干预组的值是矽尘组的90%,是对照组的223%。Beclin1、PI3KC3蛋白表达趋势与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值一致,p62蛋白表达趋势与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值相反。免疫共沉淀显示,矽尘组Beclin1与PI3K结合增加,3-MA干预后两者结合减少。[结论]矽尘诱导NR8383细胞的自噬活动随时间发生不同程度的改变,3-MA可下调矽尘诱导的NR8383细胞自噬活动,推测PI3KC3/Beclin1信号通路参与矽尘诱导肺泡巨噬细胞的自噬过程。     

肺炎克雷伯菌调控肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬的机制研究

目的探讨肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬体与肺炎克雷伯菌相互作用的分子机制。方法建立体外肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)感染A549细胞模型,分为感染组(Pneu)、自噬抑制组(Pneu+3-MA)、自噬诱导组(Pneu+rapa)、阴性对照组(ctrl),每组3个样本;通过免疫荧光染色与western-blot实验检测肺炎克雷伯菌不同时间点及不同浓度感染后细胞中自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达变化及分布情况;进一步采用自噬抑制剂3-Methyladenine (3-MA)与激动剂雷帕霉素(Rapamycin)干预细胞,观察K.pneumoniae感染A549细胞后自噬水平的变化。结果与未感染肺炎克雷伯菌的对照组相比,共聚焦显微镜观察感染组细胞LC3自噬体发生明显改变(P<0.05),western-blot检测感染组细胞LC3Ⅱ蛋白表达上升(P<0.05),且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高(P<0.05),表明肺炎克雷伯菌能够促进细胞自噬,随着细菌感染细胞比例(MOI)的增大,细胞自噬随之增多,随着时间的延长,肺炎克雷伯菌对细胞的入侵能力减弱(自噬增加),LC3Ⅱ蛋白的表达逐渐增加。自噬抑制剂和激动剂处理细胞后,免疫荧光和western-blot检测结果显示,感染组、自噬诱导组的LC3Ⅱ蛋白高于对照组(P<0.05),采用3-MA处理的感染组LC3Ⅱ蛋白低于感染组(P<0.05),表明3-MA能够抑制细胞的自噬,Rapamycin可以促进细胞的自噬。结论自噬在肺泡Ⅱ型上皮细胞抵抗肺炎克雷伯菌过程中发挥着非常重要的作用。     

N-乙酰半胱氨酸对甲苯二异氰酸酯诱导人支气管上皮细胞自噬激活作用的影响

目的 探讨N-乙酰半胱氨酸（NAC）对于甲苯二异氰酸酯（TDI）诱导人支气管上皮细胞（HBECs）自噬激活的影响。方法 （1）制备TDI-人血清白蛋白（HSA）偶联物，分别采用Gutmann法和BCA蛋白定量法测定偶联物中TDI和HSA的水平。（2）以不同浓度TDI-HSA（0、40.00、80.00和120.00 mg/L）处理HBECs 12 h，采用活细胞成像技术检测细胞中活性氧（ROS）水平，酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞上清液中IL-4和IL-6的水平，蛋白质印迹法（Western blot）检测自噬相关蛋白腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、磷酸化AMPK（p-AMPK）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化mTOR（p-mTOR）、酵母自噬相关基因6（Beclin1）、微管相关蛋白1A/1B-轻链3（LC3）和泛素结合蛋白p62的表达水平。（3）采用NAC（5 mmol/L）预处理HBECs 4 h后，再用TDI-HSA（120.00 mg/L）染毒12 h，检测细胞中ROS及IL-4、IL-6的水平，测定自噬相关蛋白AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Beclin1、LC3、p62的表达水平。结果 （1）合成的TDI-HSA偶联物中TDI和HSA质量浓度分别为21.90 mg/L、1 955.00 mg/L，摩尔比为4.41。（2）随着TDI-HSA染毒剂量的增加，HBECs细胞中ROS和IL-4、IL-6水平明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05）。TDI-HSA中（80.00 mg/L）、高（120.00 mg/L）剂量染毒组自噬相关蛋白p-AMPK/AMPK比值、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1表达明显增加，p-mTOR/mTOR比值和p62表达明显减少，差异均有统计学意义（P<0.05）。（3）与TDI-HSA高剂量染毒组相比，TDI-HSA+NAC组HBECs细胞中ROS和IL-4、IL-6水平明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；自噬相关蛋白p-AMPK/AMPK比值、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1表达明显降低，p-mTOR/mTOR比值和p62表达明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 通过抑制TDI-HSA诱导的HBECs中ROS水平，可显著抑制HBECs自噬激活，并降低细胞上清液中IL-4、IL-6的水平。     

miR-138-5p在锰致SH-SY5Y细胞自噬中的作用

[目的]探讨miR-138-5p在氯化锰(MnCl_2)诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬中的作用及其机制。[方法]以生理盐水处理组作为对照,0.125、0.25、0.5、1 mmol/L MnCl_2染毒SH-SY5Y细胞6 h后,利用MTT法检测细胞活力;0.25和0.5 mmol/L MnCl_2处理细胞6 h后,采用Western blot检测自噬相关蛋白LC3和Beclin1的表达;MnCl_2染毒6 h后,使用反转录PCR和Western blot检测miR-138-5p和组蛋白脱乙酰酶SIRT1 mRNA以及蛋白表达的变化;使用miRNA模拟物转染细胞实现miR-138-5p过表达,然后0.25 mmol/L MnCl_2染毒6 h,检测SIRT1 mRNA和蛋白的表达以及自噬相关蛋白LC3和Beclin1的变化。[结果]MnCl_2可剂量依赖性地降低SH-SY5Y细胞活力(趋势χ~2=12.42,P0.05)。与对照组相比,0.25、0.5 mmol/L MnCl_2染毒后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值和Beclin1表达水平明显增加(P0.05);miR-138-5p表达下调,SIRT1 mRNA及蛋白表达上调(均P0.05)。miR-138-5p过表达后,相比未过表达的MnCl_2染毒组,SIRT1 mRNA及蛋白表达均出现下调,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值及Beclin1蛋白表达也相应下调(P0.05)。[结论]miR-138-5p过表达可通过调节SIRT1的表达抑制锰诱导的SH-SY5Y细胞自噬。     

炭黑颗粒对人支气管上皮细胞自噬水平及炎症反应的影响

目的探讨炭黑颗粒对人支气管上皮细胞(16HBE)自噬水平及炎症反应的影响。方法体外培养16HBE细胞,分为0μg/ml(空白对照组)及12.5、25、50、100μg/ml炭黑颗粒染毒组,染毒时间24 h。采用CCK-8法检测细胞存活率,Western blot法测定细胞内自噬体蛋白LC3-Ⅱ的表达水平,酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞上清液中细胞因子白介素8(IL-8)、白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)的含量。结果人支气管上皮细胞16HBE经12.5、25、50、100μg/ml炭黑颗粒悬液染毒24 h后,细胞存活率均低于空白对照组,且随浓度增加细胞存活率逐渐下降,呈明显的剂量-反应关系;各剂量染毒组16HBE细胞的自噬体蛋白LC3-Ⅱ表达水平均升高,其中100μg/ml组LC3-Ⅱ蛋白表达高于空白对照组,差异有统计学意义(P0.05);25、50、100μg/ml染毒组的细胞上清液中IL-8含量高于空白对照组,100μg/ml染毒组的IL-1β含量高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论炭黑颗粒可导致人支气管上皮细胞内自噬体蛋白LC3-Ⅱ表达水平增加,诱导细胞释放高水平的IL-8、IL-1β等炎性细胞因子。     

密花香薷挥发油经活性氧-线粒体途径诱导SMMC-7721细胞自噬性死亡

目的 探讨密花香薷挥发油诱导肝癌SMMC-7721细胞死亡的作用及机理。方法 设置三个处理组,使密花香薷挥发油处理终浓度为20、40μg/ml和60μg/ml,以1%DMSO为对照。采用AO-EB染色和Annexin-V/PI双染流式细胞术分析细胞死亡率;化学荧光法检测细胞内ROS相对含量和线粒体膜电位;通过透射电子显微镜观察细胞超微结构;Western blot检测自噬相关蛋白Beclin 1和LC3的表达量;采用SPSS 17.0进行ANOVA方差分析,Duncan法进行多重比较。结果 AO/EB双染和Annexin-V/PI双染流式细胞术结果表明,随着密花香薷挥发油浓度增加,SMMC-7721细胞的死亡率增高(F=132.100,Ρ<0.001);SMMC-7721细胞内相对ROS水平升高,差异有统计学意义(F=61.580,P<0.001),而线粒体膜电位下降(F=64.300,Ρ<0.001);透射电子显微镜观察SMMC-7721细胞内出现自噬体;Western blot检测结果显示,随着密花香薷挥发油处理浓度的增加,自噬相关蛋白LC3-Ⅰ(F=504.10...     

缺血性脑血管病细胞自噬相关因子与斑块炎性反应的相关性

目的 探讨缺血性脑血管患者细胞自噬相关因子与炎性因子的相关性,为完善其病理机制,寻找新的治疗靶点提供依据.方法 选取缺血性脑血管病患者85例,按照颈动脉斑块分级分为三组:Ⅰ级21例、Ⅱ级35例、Ⅲ级29例,并以33例健康志愿者为对照组.抽取空腹肘静脉血,采用WB法测定自噬相关因子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ与Beclin-1的蛋白表达量,采用ELISA法测定炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平.结果 对照组、Ⅰ级斑块、Ⅱ级斑块、Ⅲ级斑块的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1表达和血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平依次升高(P<0.05);经Pearson分析,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达与IL-1β、IL-6和TNF-α水平之间,Beclin1表达与IL-1β、IL-6和TNF-α水平之间均呈线性正相关(P<0.05);经秩相关分析,颈动脉斑块分级与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、IL-1β、IL-6、TNF-α之间均呈正相关性(P<0.05).结论 缺血性脑血管病患者细胞自噬能够通过与炎性反应的相互作用影响斑块稳定性,可能为其病理机制的重要组成部分.     

N-乙酰半胱氨酸对矽尘诱导肺泡巨噬细胞自噬影响

目的探讨抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对大鼠肺泡巨噬细胞NR8383在染尘不同时间的自噬活动影响。方法常规培养NR8383细胞,染尘3、6、12、20、24 h,并给予NAC,分别收集细胞上清液,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-βⅠ(TGF-βⅠ)表达水平,自噬水平检测采用蛋白免疫印迹法和细胞免疫荧光法。结果体外巨噬细胞染尘模型最佳时间为20 h;NAC+矽尘组NR8383细胞TNF-α表达[(116.82±8.98)pg/mL]低于矽尘组[(1823.58±764.85)pg/mL](P0.05);NAC+矽尘组NR8383细胞TGF-βⅠ表达[(8.27±3.62)pg/mL]与矽尘组[(14.28±5.71)pg/mL]比较差异无统计学意义(P0.05);NAC+矽尘组与矽尘组NR8383细胞LC3蛋白表达[分别为(3.52±0.57)、(3.84±0.53)pg/mL]高于对照组[(2.24±0.56)pg/mL];免疫荧光结果显示,矽尘组NR8383细胞在20 h荧光信号强于对照组;NAC+矽尘组NR8383细胞荧光强度与矽尘组无明显差异。结论矽尘刺激使NR8383细胞自噬表达增强;NAC可降低细胞上清液中TNF-α分泌水平,NAC可能参与染尘肺泡巨噬细胞的炎症反应过程。     

DNA依赖蛋白激酶抑制剂对1,4-苯醌诱导的非p53依赖的HL60细胞凋亡的影响

目的 探讨DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)抑制剂NU7026和渥曼青霉素(Wortmannin)对1,4-苯醌(1,4-BQ)诱导的人早幼粒白血病细胞(HL60)细胞凋亡的影响.方法 HL60细胞分为染毒组(0、5、10、25和50μmol/L1,4-BQ染毒24 h)和NU7026 、Wortmannin预处理组(10μmol/L NU7026、25μmol/L Wortmannin分别预处理1h后以0、5、10、25和50 μmol/L 1,4-BQ染毒24 h),用流式细胞仪Annexin V/PI双染法和DNA Ladder法分析检测细胞凋亡水平.将HL60细胞分为空白对照组、NU7026处理组(10 μmol/L)、Wortmannin处理组(25 μmol/L)、1,4-BQ染毒组(10 μmol/L)、NU7026+1,4-BQ组(10μmol/L NU7026预处理1h,以10 μmol/L 1,4-BQ染毒24 h),25 μmol/L Wortmannin+1,4-BQ组(25μmol/L Wortmannin预处理1h,以10 μmol/L 1,4-BQ染毒24 h),用real-time PCR法检测Bax mRNA基因表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测HL60细胞的p53蛋白表达.结果 流式细胞仪Annexin V/PI双染法结果显示,NU7026+10 μmol/L 1,4-BQ处理组细胞凋亡率为17.6％±1.19％,Wortmannin+ 10μmol/L 1,4-BQ处理组细胞凋亡率为15.2％±1.22％,两组细胞凋亡率均高于10 μmol/L 1,4-BQ染毒组(6.3％±1.04％);NU7026+25tμmol/L1,4-BQ处理组细胞凋亡率为46.2％±3.55％,Wortmannin+25 μmol/L1,4-BQ处理组细胞凋亡率为26.9％±2.62％,两组细胞凋亡率均明显高于25 μmol/L 1,4-BQ染毒组(14.1％±1.54％);NU7026+50 μmol/L1,4-BQ处理组细胞凋亡率为61.8％±1.78％,明显高于50 μmol/L1,4-BQ染毒组(35.9％±4.51％),以上各组的差异均有统计学意义(P＜0.05).DNA Ladder法结果与流式细胞仪检测数据基本一致.与NU7026组和1,4-BQ染毒组比较,NU7026+1,4-BQ组Bax mRNA表达水平升高;与Wortmannin组和1,4-BQ组比较,Wortmannin+1,4-BQ组Bax mRNA表达水平升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测HL60细胞不表达p53蛋白.结论 DNA-PK抑制剂NU7026和Wortmannin促进1,4-BQ诱导的非p53依赖的HL60细胞凋亡.     

AMPK-mTOK信号通路参与百草枯致PC12细胞的自噬抑制作用

目的探讨AMPK-mTOR信号转导通路在百草枯(paraquat,PQ)诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞(PC12)自噬异常中的调控作用。方法用终浓度0、25、50、100、200、300、400 μmol/L PQ处理PC12细胞24 h,300 μmol/L PQ处理细胞不同时间(6、12、24、48 h),四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞相对存活率,确定剂量/时间-效应关系;终浓度0、100、200、300 μmol/L PQ处理细胞24 h,分光光度法检测培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)活力;二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)法检测细胞内活性氧(ROS)水平;单丹磺酰尸胺(MDC)染色法观察自噬溶酶体的表达及分布变化;免疫荧光(IF)检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达水平;免疫印迹法(Western blot)检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p62、Beclin1及AMPK-mTOR信号通路蛋白p-AMPK、p-mTOR表达水平。结果与对照组比较,100、200、300、400 μmol/L PQ染毒组的细胞存活率明显降低,且呈剂量依赖关系,差异有统计学意义(P<0.05)。300 μmol/L PQ处理细胞不同时间(6、12、24、48 h),细胞存活率随染毒时间的延长而下降,其中12、24、48 h染毒组的差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,100、200、300 μmol/L PQ染毒组细胞上清液中LDH活力明显升高,细胞内ROS荧光强度明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);MDC染色结果显示,PQ染毒组的自噬溶酶体在核周分布密度降低、荧光强度减弱、自噬水平降低;免疫荧光结果显示,PQ染毒组的LC3荧光强度减弱,细胞自噬水平下降,与MDC染色结果一致。Western blot结果显示,与对照组比较,PQ染毒组的自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表达水平均明显降低,而p62蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。200、300 μmol/L PQ染毒组的p-AMPK蛋白表达水平降低,p-mTOR蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PQ致PC12细胞损伤过程中,细胞自噬水平降低,AMPK-mTOR信号通路发挥调节作用。     

线粒体融合蛋白2低表达诱导绒毛滋养层细胞自噬的发生

目的观察线粒体融合蛋白2(Mfn2)si RNA转染人绒毛滋养细胞后自噬的发生情况。方法构建Mfn2 si RNA真核表达载体,电穿孔法将Mfn2 si RNA稳定转染人绒毛滋养层细胞并进行培养,获得Mfn2表达抑制的滋养层细胞。设立实验组(转染Mfn2 si RNA序列)、阴性转染组(转染Cy3 si RNA序列)、空白对照组(未转染序列)。采用Western Blot检测3组细胞转染后Mfn2及自噬相关基因Beclin1和Atg5的表达水平;采用免疫荧光化学染色检测LC3Ⅱ在3组绒毛滋养层细胞中的表达率。结果相对比阴性转染组和空白对照组,实验组Mfn2蛋白水平显著降低,Beclin1和Atg5蛋白表达水平增加;免疫荧光化学染色显示,LC3Ⅱ荧光光点表达率增加。结论 Mfn2低表达诱导Beclin1和Atg5的表达增加,进而诱导绒毛滋养层细胞自噬小体出现和自噬的发生,提示Mfn2可能通过调控绒毛滋养层细胞自噬参与胚胎发育。     

桔梗皂苷D在体外对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用机制研究

目的研究桔梗皂苷D在体外对人肝癌细胞株Hep G2的杀伤作用及其机制。方法 MTT法检测桔梗皂苷D对Hep G2细胞增殖的抑制作用,台盼蓝染色法检测桔梗皂苷D对Hep G2细胞死亡的诱导作用。Western blot检测自噬标记蛋白LC3-Ⅱ的表达,并用荧光定量PCR法检测自噬相关基因Beclin1的表达。荧光定量PCR法检测Hep G2细胞线粒体膜电位相关蛋白BNIP3的表达水平。JC-1染料处理Hep G2细胞,并用流式细胞术检测桔梗皂苷D对线粒体膜电位的影响。结果桔梗皂苷D可显著抑制Hep G2细胞的增殖并杀伤肿瘤细胞。桔梗皂苷D处理后Hep G2细胞的Beclin1水平和LC3-Ⅱ表达显著增高,BNIP3表达水平显著增高并诱导其线粒体肿胀,膜电位降低。结论桔梗皂苷D上调BNIP3表达,诱导Hep G2细胞发生自噬性死亡。     

苯代谢物氢醌促进人T细胞白血病细胞自噬的研究

目的探讨苯代谢物氢醌(hydroquinone,HQ)对人T细胞白血病细胞株(Jurkat细胞)自噬水平的影响及其作用机制。方法取对数生长期的Jurkat细胞,分别暴露于含终浓度为0(对照)、6.25、12.5、25、50μmol/L HQ的培养基处理24 h。采用单丹黄酰尸胺(MDC)染色法检测Jurkat细胞内自噬囊泡的生成;通过透射电子显微镜观察Jurkat细胞内自噬体的超微结构;采用Western blot法检测自噬标志性蛋白微管相关蛋白1A/1B轻链3B(LC3B)、P62蛋白及经典的自噬调节通路磷脂酰肌醇3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路中人第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源等位基因(PTEN)、Akt与磷酸化Akt(p-Akt)蛋白的表达情况。结果 Jurkat细胞内MDC荧光强度随着HQ浓度的升高而增强,在胞浆中呈点状分布。HQ染毒组Jurkat细胞出现较多的双层膜自噬体结构,伴有线粒体明显肿胀,内质网扩张等超微结构的改变。与对照组比较,各剂量HQ染毒组Jurkat细胞内LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平及6.25、12.5μmol/L HQ染毒组Jurkat细胞内P62蛋白的表达水平均较高,差异均有统计学意义(P0.05);且随着HQ染毒浓度的升高,Jurkat细胞内LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平均呈上升趋势,而P62蛋白的表达水平呈先上升后下降的趋势。与对照组比较,12.5、25、50μmol/L HQ染毒组Jurkat细胞内PTEN蛋白的表达水平均较高,而各剂量HQ染毒组Jurkat细胞内p-Akt蛋白的表达水平均较低,差异均有统计学意义(P0.05);但各剂量HQ染毒组Jurkat细胞内Akt蛋白的表达水平均无明显改变(P0.05)。且随着HQ染毒浓度的升高,Jurkat细胞内PTEN蛋白的表达水平呈上升趋势,p-Akt蛋白的表达水平呈下降趋势。结论 HQ可促进Jurkat细胞内自噬水平的增加,其作用机制可能与PI3K/Akt信号通路被抑制有关。     

2,2’,4,4’-四溴联苯醚对人神经母细胞瘤细胞自噬水平的影响

目的探讨2,2’,4,4’-四溴联苯醚(2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ethers,PBDE-47)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬水平的影响。方法取对数生长期的SH-SY5Y细胞,分别以终浓度为0(溶剂对照)、1、5、10μmol/L的PBDE-47染毒处理24 h后,采用透射电子显微镜观察细胞内双层膜自噬体结构;以自噬囊泡示踪剂单丹黄酰尸胺(MDC)染色检测自噬囊泡生成情况;采用Western blotting技术检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1、P62的表达水平。结果电镜超微结构观察结果显示,对照组细胞内未见异常变化,1μmol/L染毒组细胞内可见轻微的线粒体扩张但未见明显的双层膜自噬体结构,5μmol/L染毒组细胞内可见明显的线粒体空泡及双层膜自噬体结构,10μmol/L染毒组细胞内观察到的双层膜自噬体结构最多;与对照组相比,5、10μmol/L PBDE-47染毒组MDC荧光强度升高,MDC阳性细胞比例增加;此外,5、10μmol/L PBDE-47染毒组自噬相关蛋白LC3、Beclin1、P62的表达水平与对照组相比均明显升高,且差异具有统计学意义(P0.05)。结论 PBDE-47可诱导SH-SY5Y细胞自噬水平的增加。     

1,3-β-葡聚糖可激活自噬诱发小鼠肺组织炎症

目的 探讨1,3-β-葡聚糖诱导炎症小鼠的肺组织自噬水平，为肺组织炎症的预防、诊断及治疗提供依据。方法 将20只实验小鼠分为两组，1,3-β-葡聚糖实验组、生理盐水对照组，每组10只。小鼠非暴露气管灌注1,3-β-葡聚糖，于灌注后第3天、第28天分别收集小鼠肺组织。采用苏木素伊红和Masson染色，观察肺组织病理改变；采用Western blot检测小鼠体内自噬特异性蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)和自噬相关蛋白sequestosome 1(p62)的表达水平。结果 镜下可见，与对照组相比，实验组小鼠肺组织出现大量炎症细胞和胶原沉积。Western blot结果显示，实验组小鼠体内LC3-Ⅱ表达水平较对照组升高（t=-2.932,P<0.05）,p62表达水平较对照组升高（t=-5.151,P<0.05）。结论 1,3-β-葡聚糖可明显著提高小鼠肺组织自噬特异性蛋白LC3及自噬相关蛋白p62的表达水平，证明肺组织炎症的小鼠细胞自噬水平升高。     

原花青素对MPP+暴露的SH-SY5Y细胞线粒体质量控制系统的影响

目的 探究原花青素(proanthocyanidins, PAC)对N-甲基-4-苯基吡啶鎓碘化物(MPP⁺)诱导的SH-SY5Y细胞线粒体质量控制系统的影响。方法 用MPP⁺处理SH-SY5Y细胞建立帕金森病细胞模型。将SH-SY5Y细胞随机分为对照组(control)、模型组(MPP⁺)、PAC低剂量组(MPP⁺+1.0μg/mlPAC)、PAC中剂量组(MPP⁺+5.0μg/mlPAC)和PAC高剂量组(MPP⁺+10.0μg/mlPAC)。以MTT法检测细胞活力、ROS检测试剂盒检测ROS生成量、Westernblot法检测线粒体分裂、融合、生物发生、自噬相关蛋白的表达情况。结果 与对照组比较，MPP⁺处理后SH-SY5Y细胞活力显著降低，活性氧(ROS)的积累显著增加。此外，与对照组相比，MPP⁺处理使线粒体分裂相关蛋白(FIS1和DRP1)表达水平显著升高、线粒体融合相关蛋白(MFN1、MFN2、OP...     

葛根素对高糖诱导的RSC96细胞凋亡和自噬相关蛋白的影响

目的探讨葛根素对高糖诱导的RSC96细胞损伤的保护作用是否与自噬调节有关。方法建立体外RSC96细胞高糖损伤模型,根据Westernblot检测CleavedCaspase-3蛋白判断造模成功与否。通过CCK-8法确定葛根素干预浓度。免疫细胞化学法检测Beclin-1蛋白的表达;Western blot检测Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅱ、p62、Beclin-1蛋白的表达。结果与高糖组相比,葛根素预处理可显著提高高糖诱导后RSC96细胞的存活率(P<0.05),抑制Cleaved Caspase-3蛋白的表达(P<0.05),抑制LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白的表达(P<0.05),增强p62蛋白的表达(P<0.05)。结论葛根素可改善由高糖诱导的RSC96细胞损伤,其机制可能与其抑制LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达、提高p62蛋白表达有关。[营养学报,2020,42(3):281-286]     

去血清饥饿法对卵巢颗粒细胞自噬因子LC3和Beclin-1表达的影响

目的观察去血清饥饿法对卵巢颗粒细胞自噬因子LC3和Beclin-1表达的影响。方法用去血清的培养液诱导处于对数生长期的颗粒细胞,0、4、12、24 h后用单丹磺酰戊二胺(MDC)荧光染色法检测自噬体的形成,反转录-聚合酶链反应(RT-PCT)和Western blot方法分别检测颗粒细胞微管相关蛋白1轻链3(MAPLC3)和Beclin-1 mRNA和蛋白的表达。结果随着去血清时间的延长,MDC阳性细胞数及自噬泡数量增多;4 h后LC3-Ⅱ及Beclin-1mRNA表达开始增加,且随着时间增加有增加趋势[LC3-Ⅱ:(0.21±0.02)、(0.45±0.12)、(0.60±0.05)、(0.74±0.03),P0.05;Beclin-1:(0.20±0.06)、(0.37±0.11)、(0.52±0.07)、(0.69±0.07),P0.05];4 h后蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加,Beclin-1蛋白表达亦增加,且随时间增加有增加的趋势[LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ:(0.12±0.05)、(0.32±0.09)、(0.63±0.07)、(0.92±0.04),P0.01;Beclin-1:0,(61±0.01)、(0.83±0.11)、(1.09±0.05)、(1.35±0.10),P0.05]。结论去血清饥饿可诱导颗粒细胞自噬的发生,这可能与卵泡发育和闭锁的发生、发展有关。