姜黄素调控自噬在抑制HPV阳性宫颈癌细胞的体外研究

目的研究姜黄素在体外应用于诱导HPV阳性宫颈癌细胞凋亡与自噬的影响。方法采用MTT检测法和流式细胞仪检测姜黄素(10,20,30,40μmol/L)对HPV阳性宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响;采用自噬抑制剂3-MA与姜黄素联用,观察自噬对姜黄素抑制HPV阳性宫颈癌细胞增殖和诱导细胞凋亡的影响;分光光度法检测SiHa细胞Caspase-3活性;应用ELISA检测姜黄素和(或)自噬抑制剂3-MA对宫颈癌SiHa细胞内Bcl-2、Bax和Beclin-1表达的影响。结果姜黄素对HPV阳性的宫颈癌SiHa细胞的生长具有抑制作用,而且这种抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性;而姜黄素与3-MA联用后,对HPV阳性宫颈癌SiHa细胞诱导凋亡的作用明显下降;与对照组相比,姜黄素组细胞Caspase-3活性明显提高(P0.01)、Bax和Beclin-1的表达均明显升高(P0.01),而Bcl-2的表达明显降低(P0.01);与单独应用姜黄素组相比,姜黄素与3-MA联用组细胞Caspase-3活性和Bax表达均明显下降(P0.01),而Bcl-2的表达明显增加(P0.01)。结论姜黄素能有效抑制HPV阳性宫颈癌SiHa细胞的增殖,可以提高细胞Caspase-3活性、促进促凋亡因子Bax的表达升高和抑制凋亡因子Bcl-2表达下调,同时促进自噬相关蛋白Beclin 1的表达上调,从而诱导HPV阳性宫颈癌SiHa细胞发生凋亡和自噬性细胞死亡。     

姜黄素调控自噬抑制K562细胞增殖的体外研究

目的研究姜黄素诱导自噬对K562细胞增殖的影响。方法采用1、5、10、20和40μM/L姜黄素及自噬抑制剂3-MA作用于K562细胞24h,采用MTT实验观察K562细胞增殖变化情况,随后采用Western-blot检测自噬标志蛋白LC3-II/LC3-I变化水平;同时Western blot分析p53,p21和p27表达变化。结果姜黄素能以时间、剂量依赖性方式抑制K562细胞增殖,与3-MA对照组相比,LC3-II/LC3-I比值显著上升,姜黄素诱导K562细胞周期停滞,上调p53,p21和p27表达水平。结论姜黄素诱发自噬,抑制K562细胞增殖,上调p53促进自噬激活。     

联合自噬抑制剂增加PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235诱导的结肠癌细胞凋亡

目的探讨自噬对I3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235诱导的人结肠腺癌DLD1细胞凋亡的影响。方法PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235和(或)自噬抑制剂3-MA处理人结肠腺癌DLD1细胞,MTT法检测细胞生存率,流式细胞术检测细胞凋亡率的变化,Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果不同浓度的NVP-BEZ235作用于人结肠腺癌DLD1细胞24h后,MTT及流式细胞术结果显示,明显地抑制了细胞增殖,并增加了细胞凋亡率,同时观测到凋亡相关蛋白Caspase-3表达升高;采用3-MA特异性抑制自噬活性后,明显地增加了NVP-BEZ235诱导的细胞凋亡率;同时,检测到凋亡相关蛋白Caspase-3的表达上调。结论自噬在NVP-BEZ235诱导的人结肠腺癌DLD1细胞凋亡的过程中起保护作用,3-MA抑制自噬后,促进了NVP-BEZ235诱导人结肠腺癌DLD1细胞凋亡,联合应用PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235和自噬抑制剂3-MA有望成为人结肠癌的新治疗策略。     

PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂在乳腺癌治疗中的应用研究

目的 研究PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂在乳腺癌治疗中的应用.方法 应用ADP-GloTMLipidKinaseSystems对PO系列化合物在PI3Kα激酶水平的抑制活性进行初步筛选,对待测化合物100nM进行五倍的梯度稀释,计算IC50.P13K激酶各亚型IC50测定操作进行筛选,基于酶浓度的不同,对mTOR激酶的水平进行测定.借助大鼠试验测定PO-23化合物体内外抗乳腺癌的活性.为了探讨PO-23化合物的抗肿瘤作用机制对细胞进行培养,检测细胞的凋亡和自噬.结果 研究结果表明,筛选出乳腺癌的选择性较强,PI3K-mTOR抑制剂的抑制性能较好.在实验研究中所筛选出来的PI3K-mTOR双靶点抑制剂在乳腺癌细胞FASN当中过表达.在细胞的抑制和自噬当中,PI3K/Akt/mTOR可以抑制MDA-MB-231的细胞增殖,有着浓度和时间的依赖性.相较于空白对照组,PI3K/Akt/mTOR的细胞凋亡率明显较高,且在数据的对比中具有统计学差异(P＜0.05).结论 PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂在乳腺癌的治疗中有较高的应用价值,可以抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路磷酸化,抑制细胞的增殖,对乳腺癌治疗有治疗的作用,值得临床推广并且应用.     

姜黄素诱导细胞自噬对人乳头瘤病毒复制的抑制研究

目的：研究姜黄素诱导细胞产生自噬对人乳头瘤病毒（HPV）复制的影响。方法用姜黄素处理人宫颈癌细胞 SiHa 12 h ,荧光酶标仪观察自噬小体形成,免疫印迹试验检测 SiHa 细胞自噬标志蛋白 LC3‐Ⅱ／LC3‐Ⅰ的表达水平;实时定量聚合酶链反应和免疫印迹试验分别检测 HPV E6基因 mRNA 表达和蛋白水平。加入自噬抑制剂3‐甲基腺嘌呤（3‐MA）,实时定量聚合酶链反应和免疫印迹试验分别检测自噬抑制后 HPV E6基因表达情况。结果姜黄素诱导后,与对照组相比,SiHa 细胞中自噬小体的荧光强度明显增高,LC3‐Ⅱ／LC3‐Ⅰ比值明显上升（P＜0．05）;细胞诱导自噬后 HPV E6 mRNA 和蛋白水平明显降低,而加入自噬抑制剂3‐MA 后,HPV E6 mRNA 和蛋白水平均明显增高。结论姜黄素可能通过诱导细胞自噬抑制 HPV 的复制。     

抑制自噬增加PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂引起的胃癌细胞死亡

目的为了研究3-MA是否可能增强胃癌细胞对PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235的敏感性。方法以胃癌SNU16细胞系为研究对象,SNU16细胞用不同浓度的NVP-BEZ235(10nM、20nM和50nM)处理24h。实验分为四组:Control组,20nM NVP-BEZ235组,5mM 3-MA组,20nM NVP-BEZ235联合5mM 3-MA组。MTT法用来检测不同组内细胞的生存率,Western blotting用来检测Cleaved Caspase-3和Cytochrome C的表达水平。结果MTT结果表明NVP-BEZ235能抑制SNU16细胞的增殖,3-MA增强了NVP-BEZ235对SNU16细胞的增殖抑制作用。Western blotting结果表明NVP-BEZ235增加了Cleaved Caspase-3和Cytochrome C的表达,而NVP-BEZ235联合3-MA会进一步诱导Cleaved Caspase-3和Cytochrome C蛋白的表达。结论 3-MA通过抑制自噬增加了SNU16细胞对NVP-BEZ235的敏感性。     

姜黄素诱导K562细胞自噬的抗瘤作用研究

目的研究姜黄素诱导自噬对K562细胞增殖的作用。方法采用MTT法检测不同浓度的姜黄素及自噬特异性抑制剂3-MA对K562细胞存活率的影响;通过Western blot法检测自噬标志蛋白Beclin1及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的水平评价自噬;应用实时定量PCR法检测BCR-ABL融合基因的表达。结果姜黄素以剂量、时间依赖方式抑制K562细胞增殖;与加入3-MA的对照组相比,Beclin1的水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明显升高;姜黄素可导致BCRABL融合基因的水平降低。结论姜黄素诱导自噬可抑制K562细胞增殖并下调BCR-ABL融合基因的表达水平。     

白藜芦醇通过激活mTOR/自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞损伤及凋亡

目的:白藜芦醇对缺氧缺糖/复氧复糖(OGD/R)诱导的PC12细胞损伤及凋亡的影响及作用机制。方法:以PC12细胞建立OGD/R自噬性损伤模型,设置空白对照组、模型组、不同浓度(5、10μmol/L)白藜芦醇组,自噬抑制剂(3-MA)组。使用CCK-8试剂盒检测PC12的增殖能力;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;ELISA检测各组细胞培养液中TNF-α和IL-6的浓度变化;DHE荧光探针检测ROS的变化;特定试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH-PX)含量;Westernblot法检测各组mTOR的磷酸化情况及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达。结果:与空白对照组相比模型组能够显著降低PC12的增殖能力,增加细胞中ROS的含量和凋亡率,诱导TNF-α和IL-6分泌,LDH、MDA含量显著增加,SOD、GSH-PX活性显著下降,而P-mTOR/mTOR、LC3-Ⅱ、Beclin-1表达增加(P<0.01)。与模型组比较,不同浓度白藜芦醇作用PC12时,细胞存活率逐渐上升,ROS含量及凋亡率逐渐下降,LDH、MDA含量减少,SOD、GSH-PX活性随之上升,TNF-α和IL-6分泌显著下降,P-mTOR/mTOR、LC3-Ⅱ、Beclin-1表达进一步增加(P<0.01)。自噬抑制剂(3-MA)组上述指标的检测结果与白藜芦醇组相反。结论:白藜芦醇可能部分通过激活mTOR/自噬通路对神经细胞发挥保护作用。     

普伐他汀对H2O2诱导的人骨髓间充质干细胞凋亡的影响

目的:探讨普伐他汀干预对H2O2诱导的人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)凋亡的影响及其相关细胞信号传导通路。方法:应用普伐他汀干预体外培养的第6代人MSCs,采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测作用前后ERK1/2、p38MAPK及PI3K/Akt通路蛋白的表达及磷酸化情况。将10μmol/L普伐他汀预处理人MSCs 1 h后,换用含1 mmol/L H2O2的完全培养基培养1 h,观察细胞形态,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;进一步在普伐他汀干预前用特异的细胞信号通路抑制剂或激动剂阻断或激活ERK1/2、p38MAPK及PI3K/Akt途径,观察其对普伐他汀作用的影响。结果:普伐他汀可使人MSCs的PI3K/Akt通路磷酸化水平升高,使p38MAPK通路磷酸化水平降低,而其对人MSCs的ERK1/2通路和总Akt、总p38MAPK蛋白水平无显著影响。普伐他汀能抑制H2O2诱导的人MSCs的凋亡(P<0.05),PI3K/Akt通路特异抑制剂Ly294002预处理后这种作用消失,p38MAPK通路特异激动剂anisomycin预处理对这种作用影响不显著。结论:普伐他汀可激活人MSCs的PI3K/Akt通路,抑制p38MAPK通路,并可抑制H2O2诱导的人MSCs凋亡。PI3K/Akt通路的激活参与了其抗凋亡作用的调控。     

雌激素受体β通过调节AMPK/mTORC1轴的作用诱导结肠癌细胞自噬

目的:探讨雌激素受体(ER)β诱导结肠癌细胞自噬的作用机制。方法:将ERβ质粒转染人结肠癌细胞株HCT116(p53野生型)和SW480(p53突变型)后,通过荧光显微镜观察自噬现象;采用蛋白印迹法检测LC3-Ⅱ蛋白、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、AMPK和p70S6K蛋白及相应磷酸化蛋白的表达变化;应用实时定量PCR法检测DRAM1、Sestrin1和Sestrin2的mRNA表达变化。结果:ERβ过表达能促进HCT116和SW480细胞发生自噬;LC3-Ⅱ和p-AMPK蛋白在HCT116细胞中分别上调了2.81倍和1.80倍(P<0.05);在SW480细胞中分别上调了1.70倍和2.48倍(P     

RhBMP-2通过抑制PI3K/Akt信号通路对肝细胞癌SK-Hep-1细胞增殖影响的体外研究

目的探讨体外条件下rhBMP-2对肝细胞癌SK-Hep-1细胞系增殖能力的影响及其作用机制。方法无血清条件下,不同浓度的rhBMP-2处理肝癌SK-Hep-1细胞,通过MTT法检测不同浓度的rhBMP-2对细胞增殖能力的影响。利用流式细胞分析技术检测细胞周期,通过Real-time PCR检测不同浓度的rhBMP-2对p21、cyclin E表达的影响,应用Western blot技术检测不同浓度的rhBMP-2处理对p21、cyclin E蛋白水平及对PI3K/Akt磷酸化水平的影响。结果无血清条件下,不同浓度的rhBMP-2处理细胞,研究发现rhBMP-2可显著抑制肝癌SK-Hep-1的增殖能力。无血清条件下,不同浓度的rhBMP-2处理细胞24小时,发现rhBMP-2可增加G1期细胞所占比率。rhBMP-2可显著促进p21的表达,显著抑制cyclin E的表达,并显著抑制PI3K/Akt信号通路的磷酸化过程。结论研究证实在体外条件下rhBMP-2通过抑制PI3K/Akt信号通路的磷酸化过程对肝细胞癌SK-Hep-1细胞增殖能力发挥显著抑制作用,从基础水平进一步论证了rhBMP-2的临床应用不能显著增加肝癌的患病风险,为脊柱融合手术及骨不连等骨科疾病的治疗中应用rhBMP-2提供了一定的理论基础。     

自噬调节药物对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和自噬的影响

目的:探讨自噬调节药物包括自噬激活剂(雷帕霉素)、自噬抑制剂(羟氯喹和3-甲基腺嘌呤)对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖、凋亡和自噬的影响。方法:采用不同浓度雷帕霉素(RAPA)、羟氯喹(HCQ)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理RPMI 8226细胞,用CCK-8法检测药物对细胞增殖的作用,流式细胞术检测药物作用24 h后细胞凋亡率,应用单丹磺酰戊二胺(MDC)染色观察自噬小体数量,Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC-3b和凋亡相关蛋白(caspase-3、PARP和BCL-2)的表达情况。结果:RAPA和HCQ可呈时间及剂量依赖性抑制RPMI8226细胞的增殖,并增加细胞的凋亡,而3-MA无明显抑制细胞增殖作用,也无诱导凋亡作用。MDC染色结果显示,细胞内自噬泡数量随着RAPA浓度的提高逐渐增多,而随着HCQ和3-MA浓度升高自噬泡数量却逐渐减少。Western blot结果显示,RAPA可诱导自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和凋亡蛋白caspase-3及PARP表达上调,但抑制抗凋亡蛋白BCL-2表达;HCQ抑制LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和BCL-2表达,但可上调caspase-3和PARP表达;3-MA可下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达,但对caspase-3、PARP及BCL-2表达均未显示明显影响。结论:RAPA能抑制RPMI8226细胞增殖,诱导RPMI8226细胞凋亡和自噬,HCQ则在抑制自噬和增殖的同时也可诱导凋亡,3-MA可抑制细胞自噬但对细胞增殖和凋亡影响不大。     

5-Aza诱导胃癌细胞株GC-7901凋亡及自噬的相关性研究

目的研究5‐氮‐2‐脱氧胞苷（5‐aza‐2‐deoxycytidine ,5‐Aza）对胃癌细胞株GC‐7901自噬、凋亡及胰岛素相关信号通路轴的影响。方法选择不同浓度（5μmol／L、10μmol／L、20μmol／L ）的5‐Aza干预胃癌细胞株GC‐7901,72 h后用免疫印记检测自噬相关蛋白LC3‐Ⅱ和LC3‐Ⅰ的表达。选择5‐Aza最佳浓度10μmol／L干预GC‐7901,免疫印记检测空白组和对照组中胰岛素样生长因子‐1受体（IGF‐1R）、磷酸化胰岛素样生长因子‐1受体（p‐IGF‐1R）及下游信号通路相关蛋白磷脂酰肌醇3‐激酶（PI3K ）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）,磷酸化磷脂酰肌醇3‐激酶（p‐PI3K）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p‐mTOR）的表达;流式细胞技术检测细胞凋亡情况。结果不同浓度的5‐Aza均可增加胃癌细胞的自噬表达,并呈计量依赖性,10μmol／L 5‐Aza干预后胃癌细胞的状态最佳。10μmol／L 5‐Aza可诱导胃癌细胞株GC‐7901凋亡增加,5‐Aza组与空白对照组相比较差异具有显著性（ P ＜0．01）;10μmol／L 5‐Aza可抑制p‐IGF‐1R、p‐PI3K、p‐mTOR的表达,空白组与5‐Aza组相比较差异具有显著性（ P ＜0．01）。但对总蛋白IGF‐1R、PI3K、mTOR无影响（ P＞0．05）。结论5‐Aza可以诱导胃癌细胞凋亡,增加细胞自噬,可能与抑制IGF‐1R磷酸化表达有关。     

电针对去神经支配骨骼肌萎缩大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

目的:研究电针对去神经支配骨骼肌萎缩大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响,探讨电针延缓去神经支配骨骼肌萎缩的治疗机制。方法:SD雄性大鼠63只随机分为假手术组(n=21)、模型组(n=21)和电针组(n=21)。模型组、电针组通过暴露并切断坐骨神经的方法制作去神经支配腓肠肌动物模型,假手术组暴露坐骨神经但不切断。术后1d,电针组术侧进行电针治疗,其余两组不做任何处理。分别在术后7d、14d和21d取材,测定术侧腓肠肌湿重比,Masson染色测定腓肠肌纤维直径、截面积,Western Blot检测PI3K、Akt以及mTOR蛋白表达、Akt以及mTOR蛋白磷酸化,PCR检测PI3K、Akt和mTOR基因表达。结果:模型组与电针组大鼠腓肠肌的湿重比、肌纤维截直径以及面积均显著低于假手术组(P0.001),且模型组与电针组比较,差异具有显著性(P0.05);电针组的PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达量均高于模型组与假手术组(P0.05);电针组的PI3K、Akt、mTOR m RNA表达也明显高于其余两组(P0.05)。结论:电针可延缓去神经性骨骼肌萎缩,其作用机制可能与电针激活PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

PI3K/Akt信号传导通路在替莫唑胺诱导脑胶质瘤细胞耐药中的作用研究

目的观察替莫唑胺耐药脑胶质瘤细胞中激活磷脂酰肌醇3激酶/PKB蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号传导通路活化情况,并对PI3K/Akt信号传导通路在替莫唑胺诱导脑胶质瘤细胞耐药中的作用机制进行探讨。方法采用Western blot方法检测耐药脑胶质瘤细胞(U251/TMZ)和非耐药脑胶质瘤细胞中PI3K/Ak信号传导通路的活化情况。采用PI3K/Akt信号传导通路特异性阻断剂LY294002阻断U251/TMZ中PI3K/Akt信号传导通路,检测替莫唑胺对U251/TMZ细胞活性的影响。采用Western blot方法检测LY294002作用后,U251/TMZ细胞中Bcl-2、MDR1、Topo Ⅱ、ARF和p53等蛋白表达变化情况。结果耐药脑胶质瘤细胞中PI3K/Akt信号传导通路活化情况显著增强(P0.01)。阻断PI3K/Akt信号传导通路后,替莫唑胺对U251/TMZ耐药脑胶质瘤细胞的抑制率明显高于对照组(P0.05)。阻断PI3K/Akt信号传导通路后,耐药相关基因Bcl-2和MDR1的表达显著降低(P0.01),Topo Ⅱ的表达显著升高(P0.01),同时抑癌基因ARF和p53的表达显著升高(P0.01)。结论 PI3K/Akt信号传导通路参与替莫唑胺耐药脑胶质瘤细胞的形成,其机制可能与PI3K/Akt信号传导通路对耐药相关基因Bcl-2、MDR1和Topo Ⅱ及抑癌基因ARF和p53的表达调控有关。     

mTOR活化对抗β2 GPI抗体/β2 GPI复合物诱导THP-1细胞组织因子表达的影响

目的探讨雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在抗β_2糖蛋白I(β_2GPI)/β_2GPI复合物诱导THP-1细胞组织因子(TF)表达中的作用。方法用抗β_2GPI抗体/β_2GPI和β_2GPI/Ig G-APS处理THP-1细胞,mTOR抑制剂雷帕霉素(100 nmol/L)进行干预实验;收集细胞总RNA和蛋白质,实时定量PCR(RT-q PCR)和TF活性试剂盒分别检测THP-1细胞中TF mRNA表达水平及其活性,western blot检测THP-1细胞中mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、NF-κB p65和p-NF-κB p65的表达情况。结果抗β_2GPI抗体/β_2GPI和β_2GPI/Ig G-APS复合物均能明显增加THP-1细胞TF mRNA和TF活性以及mTOR磷酸化水平(P均0.05);雷帕霉素能明显降低抗β_2GPI抗体/β_2GPI和β_2GPI/Ig G-APS诱导THP-1细胞TF的表达水平以及mTOR磷酸化的效应(P均0.05),也能明显地削弱p38、ERK1/2和NF-κB p65的磷酸化水平(P均0.05),而对JNK的磷酸化水平无抑制效应(P0.05)。结论抗β_2GPI抗体/β_2GPI复合物能够刺激THP-1细胞mTOR的活化,并能影响TF的表达。     

人胚胎干细胞Pten基因表达及PI3K/Akt/mTOR信号通路下游蛋白的磷酸化

背景:各种磷酸化蛋白质表达水平对人胚胎干细胞维持未分化状态或定向分化的影响逐渐成为人胚胎干细胞的研究热点,研究发现磷酸化蛋白质表达水平可能决定着人胚胎干细胞的命运。目的:对PI3K/Akt途径下游的关键蛋白磷酸化水平进行检测,寻找PI3K/Akt途径中能够维持人胚胎干细胞未分化状态的下游蛋白。方法:用胎鼠成纤维细胞作为饲养层,二维培养的方法培养人胚胎干细胞,胶原酶消化后待测;以饲养层细胞、K562细胞株为对照。观察人胚胎干细胞生长状态;RT-PCR检测Pten基因表达;WesternBlot检测p-PTEN、p-mTOR、p-P70S6Kp-4E-BP14种蛋白的表达。结果与结论:人胚胎干细胞在未分化状态时PtenmRNA表达高于肿瘤细胞K562,而且Pten抑制的mTOR信号通路中关键蛋白表达均明显低于K562,尤其以p-4E-BP1表达最低。提示PI3K/Akt/mTOR信号通路下游磷酸化蛋白在人胚胎干细胞活性较低,如果抑制负调节蛋白PTEN或直接激活该通路正调节关键蛋白,可能会加快人胚胎干细胞增殖、减少凋亡,进而为定向分化、再生医学提供更多的细胞来源。     

血小板源性生长因子-DD通过Akt信号通路促进膀胱癌T24细胞增殖

目的研究外源性血小板源性生长因子-DD(PDGF-DD)对膀胱癌T24细胞增殖及Akt信号转导通路的影响,阐述factor其诱导细胞增殖的机制。方法外源性PDGF-DD蛋白作用T24细胞,采用MTT法分析细胞的增殖;流失细胞仪检测细胞周期的变化;Western blot法观测膀胱癌T24细胞Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR以及核因子NF-κB蛋白表达的变化。结果 PDGF-DD促进T24细胞的增殖,并且具有浓度依赖性;DNA合成前期(G0/G1期)细胞比例下降,合成期(S期)细胞比例上升;Akt、mTOR表达变化不明显,而p-Akt、p-mTOR及NF-κB p65的表达均上调。LY294002抑制PI3K/Akt及其下游靶位蛋白磷酸化;雷帕霉素和PDTC分别抑制p-mTOR和NF-κBp65的表达。结论外源性PDGF-DD刺激T24细胞的增殖,其机制可能是通过Akt/mTOR和Akt/NF-κB两条独立的信号通路实现的。     

创伤性脑损伤诱导大鼠脑内巨噬细胞亚群分化与脑外伤后神经元过度自噬和凋亡的关系研究

目的探讨创伤性脑损伤后大鼠脑内巨噬细胞分化的亚群种类和创伤后神经元过度自噬和凋亡的关系。方法选择45只雄性SD大鼠建立创伤性脑损伤(TBI)模型,然后根据随机数字表法分为Sham组(假手术大鼠,右心室注射5μL氯化钠溶液)、TBI组(TBI模型大鼠,右心室注射5μL氯化钠溶液)和3-MA组(TBI模型大鼠,右心室注射5μL 600 nmol的3-MA),每组各15只。造模后1~14 d测定Sham组和TBI组大鼠脑水肿程度;流式细胞术检测Sham组、TBI组和3-MA组大鼠脑损伤处巨噬细胞分化的亚群种类,采用蛋白质印迹(Western blotting)法测定了3组大鼠脑损伤处自噬相关通路蛋白、凋亡相关通路蛋白的表达水平以及自噬效应性信号通路PI3K/AKT通路的磷酸化水平。结果TBI造模手术后第1~14天时,TBI组大鼠脑水肿程度显著高于Sham组(P<0.05);与Sham组相比,TBI组和3-MA组M1亚群比例和M1/M2比值均显著升高,3-MA组M1亚群比例则较TBI组显著降低(P<0.05);与Sham组相比,TBI组和3-MA组大鼠脑损伤组织中凋亡相关蛋白cleaved-Caspase-3和Bax的相对表达水平显著升高,Bcl-2的相对表达水平显著降低,3-MA组cleaved-Caspase-3和Bax的相对表达水平则较TBI组显著升高,Bcl-2水平显著降低(P<0.05);与Sham组相比,TBI组和3-MA组的p-PI3K和p-AKT的磷酸化水平显著升高,而3-MA处理后,p-PI3K和p-AKT的磷酸化水平较TBI组显著降低(P<0.05)。结论TBI能够诱导大鼠脑内M1巨噬细胞亚群激增并导致脑损伤处神经元发生过度自噬和凋亡,同时,当自噬被抑制后,脑损伤处的凋亡被进一步激活;TBI大鼠神经元的过度自噬引发PI3K/AKT信号通路被激活,抑制自噬能够明显下调被激活的PI3K/AKT磷酸化水平。     

shRNA沉默NSD2基因表达对OCI-Ly3细胞增殖、凋亡及Akt/mTOR信号通路的影响

目的:探讨干扰shRNA下调NSD2基因表达对弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-Ly3细胞增殖、凋亡及Akt /mTOR信号通路的影响。方法:NSD2 shRNA慢病毒转染OCI-Ly3细胞,应用real time Q-PCR检测NSD2 mRNA的表达和Western blot法检测NSD2蛋白的表达,以鉴定NSD2 shRNA的沉默效果,应用CCK-8试验检测细胞增殖,AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot测定组蛋白H3K36二甲基化水平(H3K36me2)、BAX BCL-2、caspase-3、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、磷酸化P70核糖体蛋白S6激酶(phosphorylation P70 ribosomal protein S6 kinase,p-P70S6K)的变化。结果:NSD2 shRNA慢病毒转染OCI-Ly3细胞72 h后,real time Q-PCR和Western blot检测显示NSD2的mRNA和蛋白表达均有明显下降(P0.05),NSD2 shRNA组细胞增殖率明显低于对照和Neg shRNA组(P0.05),NSD2 shRNA组细胞的凋亡率明显高于对照组和和Neg shRNA组(30.37±4.22)%vs(1.36±0.52)%和(2.17±1.43)%(P0.05);促凋亡蛋白BAX表达上调,抑制凋亡蛋白BCL-2表达下调,caspase-3表达上调;H3K36me2水平较对照组明显下降,而检测Akt /mTOR通路蛋白发现,Akt总蛋白水平未明显下降,但是活性形式的磷酸化p-Akt、p-mTOR和p-P70S6K表达下调。结论:干扰沉默NSD2基因可抑制弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-Ly3细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能是调节组蛋白H3K36me2水平变化,特异性地抑制Akt /mTOR信号通路的活性。